專利名稱：一種基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)工程中的蛋白表達(dá)與分離純化的領(lǐng)域，特別涉及一 種基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋白的方法。
背景技術(shù)：
生物膜有著重要的生物功能，如提供細(xì)胞識別位點，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì) 胞與基質(zhì)之間的連接等等。參與這些生物功能的主要是膜蛋白，正因如此，膜 蛋白的研究也正成為蛋白質(zhì)組研究的熱點，然而，由于膜蛋白本身的疏水性以 及低豐度等特性，使得膜蛋白的研究進(jìn)展比較緩慢。但是膜蛋白不僅具有非常 重要的生物學(xué)功能，也是許多藥物的作用靶位點，因而，研究膜蛋白不僅有利 于低豐度蛋白的研究，更為藥物研發(fā)和疾病的診斷提供耙體與標(biāo)記蛋白質(zhì)。然 而，膜蛋白的分離卻是膜蛋白研究的"瓶頸"。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種膜蛋白分離與純化新的技術(shù)方法。
本發(fā)明的一種基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋白的方法重組桿狀 病毒Bm-sp-HA-tm感染昆蟲宿主細(xì)胞后增殖，在病毒出芽時帶走宿主細(xì)胞膜成
分而形成自身的囊膜，將病毒粒子分離出，反復(fù)凍融，獲得膜蛋白。
所述的基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋白的方法，包括以下步驟
(1) 重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm感染昆蟲細(xì)胞后，27°C、 5°/^02培養(yǎng)5 7
天，收獲被感染昆蟲細(xì)胞；
(2) 從被感染昆蟲細(xì)胞中分離純化出帶囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒粒子，經(jīng) 多步離心后，再進(jìn)行蔗糖密度剃度離心后收集樣品； (3)脫糖，選擇截留分子量為750kD的中空纖維膜，用無菌超純水置換樣
品中的蔗糖，最后得到膜蛋白。
其中步驟(2)中分離純化出帶囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒粒子的步驟依次包
括
(1) 取適量被感染昆蟲細(xì)胞樣品，與0. 85%生理鹽水適量混和，勻漿至漿 液細(xì)致均勻；
(2) 將勻漿液加入500ml離心管中，配平，3000rpm離心20-60min，取 上清，棄去油脂；
(3) 將3000rpm離心上清液倒入新500ml離心管中，配平，6000rpm離心 20-60min，取上清，棄油脂;
(4) 6000rpm離心的上清液倒入50ml離心管，配平，12000rpm離心30-120min,取上清，棄油脂；
(5) 12000rpm離心后的上清，在超凈臺上分裝于滅菌的超離管中，平 衡，35000rpm離心30-90min，使病毒粒子沉淀下來；
(6) 35000rpm離心后的上清裝入滅菌的瓶中，先置于4匸，沉淀用無菌 溶解液重懸，用槍頭反復(fù)輕輕吹打，使沉淀能充分溶解，得帶囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒^立子。
所述的昆蟲細(xì)胞為家蠶蛹。 所述的重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm的構(gòu)建方法
(1) 以gp64DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp64信號肽，所用引物 Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， ；
Psp2: 5， catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc
3，；
(2) 以gp64DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp64跨膜域，所用引物
Ptml: 5， gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc 3， Ptm2: 5， gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3' ;
(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因為模板，PCR擴(kuò)增HA基因，所用引物 Phal: 5， gaaasgaacgttactgttacacatgc 3，
Pha2: 5， aatgcaaattctgcattgtaacgac 3，
(4) 以gp64信號肽和HA基因為模板，PCR擴(kuò)增sp-HA融合基因，所用引
物
Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， ； Pha2: 5， aatgcaaattctgcattgtaacgac 3，
(5) 以sp-HA融合基因和gp64跨膜域為模板，PCR擴(kuò)增sp-HA-tm融合基
因，所用引物
Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， ；
Ptm2: 5' gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3， ；
(6) 將融合基因sp-HA-tm連接到pGEM-T vector上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 E. coli DH5 a中，構(gòu)建得克隆質(zhì)粒pGEM-sp-HA-tm;
(7) 克隆質(zhì)粒pGEM-sp-HA-tm經(jīng)BamH I和Not I雙酶切切下sp-HA-tm融 合基因片段克隆至經(jīng)BamH I和Not I雙酶切的pBacPAK8中，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移 質(zhì)粒pBacsp-HA-tnu
(8) 取重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-sp-HA-tm DNA和經(jīng)Bsu361酶切線性化的修飾 型病毒BmBacPAK6 DNA，加入無血清的TC-100培養(yǎng)基混勻，取Dosper加入無血 清的TC-100培養(yǎng)基混均，將事先培養(yǎng)在平皿中的BmN細(xì)胞用無血清的TC-100 培養(yǎng)基洗漆兩次，并逐滴加入pBac-sp-HA-tm轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Dosper混合物，27°C 培養(yǎng)4-5天，取上清感染平皿中的Bm N細(xì)胞，1小時后棄去上清加入等量混合 的TC-100培養(yǎng)基和低熔點瓊脂糖，4-5天后挑取噬斑，感染BmN細(xì)胞3-4天， 保存上清，細(xì)胞用NaOH裂解用于Southern blot斑點雜交，以sp-HA-tm融合 基因作模板用隨機(jī)引物探針標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針，雜交；取陽性克隆的上清感 染家蠶細(xì)胞擴(kuò)增，即得到含sp-HA-tm融合基因的重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm。
本發(fā)明的有益之處在于病毒出芽時會帶走宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜成分，而形 成自身的囊膜，本發(fā)明正是利用囊膜病毒出芽的這個特性，分離獲得囊膜病 毒，再將病毒粒子去除，從而獲得囊膜即宿主細(xì)胞膜的成分。同時，在囊膜上 插有分子標(biāo)記，以追蹤膜成分。本發(fā)明為膜蛋白分離與純化提供了新的技術(shù)方 法，為膜蛋白的研究奠定基礎(chǔ)，能促進(jìn)膜蛋白組學(xué)研究的發(fā)展，有助于發(fā)現(xiàn)藥 物蛋白作用的靶點，促進(jìn)藥物學(xué)、醫(yī)學(xué)的發(fā)展。
具體實施例方式
本發(fā)明通過攜帶HA融合蛋白的桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后，HA融合蛋白表達(dá) 后將會定位于宿主的細(xì)胞膜上，當(dāng)病毒以出芽的方式釋放出來時將會帶走宿主 細(xì)胞膜成分而形成自身的囊膜，因而以HA融合蛋白作為分離膜蛋白的標(biāo)記，經(jīng) 過多步純化步驟獲得純的帶囊膜的病毒粒子，反復(fù)凍融使囊膜破裂，再經(jīng)離心 除去不帶囊膜的病毒粒子而獲得純的囊膜，即宿主的細(xì)胞膜成分，再經(jīng)HPLC和 質(zhì)譜分析，實現(xiàn)膜蛋白的鑒定與分離。
為了能使桿狀病毒能感染動物的細(xì)胞，本發(fā)明構(gòu)建了 Bm-sp-HA-tm重組桿
狀病毒o
下面結(jié)合實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案 實施例1
1.融合基因sp-HA-tm的構(gòu)建。
在HA基因(Genbank號DQ520855)的5，和3，端分別連接編碼桿狀病毒 囊膜蛋白gp64信號肽基因序列(Genbank號NP 074525)和gp64跨膜區(qū)基因序 列(Genbank號NP 074525)，并在融合基因的5，和3，端分別引入BamH I和 Not I酶切位點。分別以桿狀病毒AcNPV gp64信號肽基因序列(Genbank號NP 074525)、禽流感病毒H5N1 HA基因序列(Genbank號DQ520855。)和gp64 跨膜區(qū)基因序列(Genbank號NP 074525)為模板設(shè)計3對引物，首先擴(kuò)增目的 片段gp64信號肽(sp) 、 HA和gp64跨膜域(tm)，然后利用各目的片段互為 引物和模板合成融合基因sp-HA-tm。設(shè)計引物如下
Pspl5，gc欲atcc atgctactagtaaatcagtc 3， (BamHI位點)
Psp25，catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc 3，
Phal5，gaaaagaacgttactgttacacatgc 3'
Pha25，aatgcaaattctgcattgtaacgac 3'
Ptml5，gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc 3;
Ptm25，gagc敘ccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3' (NotI位點)
(1) gp64信號肽(sp)的擴(kuò)增
以gp64 DNA (Genbank號NP 074525)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)計為，94°C 預(yù)變性3min， 94。C變性30s， 68。C復(fù)性延伸30s， 30個循環(huán)，68。C延伸5min。 在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分
10XPCR Buffer lOti 1
25mmol MgCl2 8 u 1
2. 5 mmol dNTPs 8 u1
Pspl 1 ti 1
Psp2 1 u 1
模板 1 u 1
KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本) 1 u 1
加無菌雙蒸水至100ul
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時切膠回收目的片斷，得到gp64信號肽(以下 簡稱sp)。
(2) gp64跨膜域(tm)的擴(kuò)增
以gp64 DNA (Genbank號NP 074525)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)計為，94°C 預(yù)變性3min， 94。C變性30s， 68。C復(fù)性延伸30s， 30個循環(huán)，68。C延伸5min。
lOOul的反應(yīng)體系同上，所用引物為Ptml和Ptm2 ，各組分混勻后，放入 PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷， 同時切膠回收目的片斷，得到gp64跨膜域(以下簡稱tm)。
(3) HA基因的擴(kuò)增
以禽流感病毒H5N1 HA基因(Genbank號DQ520855)為模板，PCR反應(yīng)參 數(shù)為94'C預(yù)變性3min， 94'C變性30s， 68。C復(fù)性延伸lmin， 30個循環(huán)，68。C延 伸5min。在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR BufferlOu 1， 25mmo1 MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8p1，引物Phal lul，引物Pha2 1 ul,模板llU， KOD-Plus DNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本)lul，加無菌雙 蒸水至100 u 1。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時切膠回收目的片斷，得到HA基因。(4) gp64信號肽sp基因與HA基因的融合
PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性3min， 94。C變性30s， 68"C復(fù)性延伸lmin， 30 個循環(huán)，68。C延伸5min。在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10X PCR Buffer 10 ii 1， 25mmol MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8ul，引物Pspl lu 1，引物Pha2 lul，模板sp lnl，模板HA lul， KOD-Plus DNA聚合酶 (TOYOBO公司，日本)lul，加無菌雙蒸水至100ul。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時切膠回收目的片斷。
因為sp的下游引物Psp2設(shè)計時加入了 HA基因5，端的部分序列，所以 PCR擴(kuò)增出的sp片斷3'端序列與HA基因5'端序列存在重疊，再次利用PCR 方法就可以擴(kuò)增出sp-HA融合基因序列。
(5) 融合基因sp-HA再次與tm的融合
PCR反應(yīng)參數(shù)為94"C預(yù)變性3min， 94。C變性30s， 68"C復(fù)性延伸1. 5min， 30個循環(huán)，68'C延伸5min。在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10 XPCR BufferlOul， 25,1 MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8ul，引物Pspl 1 ul，引物Ptm2 lul，模板sp-HA lul，模板tm lul， KOD-Plus DNA聚合酶 (日本TOYOBO公司)1p1，加無菌雙蒸水至lOOu 1。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié) 束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時切膠回收目的片斷。
同上，因為tm的上游引物Ptml設(shè)計時加入了 HA基因3'端的部分序列， 所以PCR擴(kuò)增出的tm片斷5'端序列與HA基因3'端序列存在重疊，再次利用 PCR方法就可以擴(kuò)增出sp-HA-tm融合基因。
2.克隆質(zhì)粒pGEM-sp-HA-tm (圖l)的構(gòu)建
將PCR擴(kuò)增出的融合基因sp-HA-tm連接到pGEM-T vector (購自 promage公司)上，在0. 5ml的離心管中加入下列成分 融合基因印-HA-tm 2ul pGEM-T vector 0. 5ul
2XRapid Ligation buffer 5ul T4 DNA ligase (promage) lul
加無菌H20至lOul，混勻，25。C反應(yīng)lh。反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 E.coli DH5ct中，LB固體培養(yǎng)基(配方見《分子克隆》)培養(yǎng)過夜，挑取單菌 落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測序，序列完全正確，得重組質(zhì)粒pGEM-sp-HA-tm。
3. 含sp-HA-tm融合基因桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-sp-HA-tm (圖2)的獲得 質(zhì)粒pGEM-sp-HA-tm經(jīng)BamH I和Not I雙酶切切下sp-HA-tm融合基因片
段克隆至經(jīng)BamH I和Not I雙酶切的pBacPAK8中，使sp-HA-tm融合基因置于 多角體蛋白(polyhedrin， ph)基因啟動子控制之下，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pBac-sp-HA-tm，經(jīng)酶切分析鑒定基因序列正確。
4. 含sp-HA-tm融合基因的家蠶重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm的獲得
取5ul重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-sp-HA-tm DNA和6ul經(jīng)Bsu36I酶切線性化的修 飾型病毒BmBacPAK6 DNA (購自上海生化細(xì)胞所)，加入lOOul無血清的TC-100培養(yǎng)基(GIBCOBRL公司)混均。取6ulDosper (寶靈曼公司)加入lOOul 無血清的TC-100培養(yǎng)基(GIBCOBRL公司)混均。將事先培養(yǎng)在35mm平皿中的 BmN細(xì)胞(購自上海生化細(xì)胞所)用無血清的TC-100培養(yǎng)基(GIBCOBRL公 司)洗滌兩次，并逐滴加入pBac-sp-HA-tm轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Do印er混合物(寶靈曼 公司)，27。C培養(yǎng)4-5天，收取上清進(jìn)行第一輪噬斑篩選。取5ul上清感染35 mm平皿中的BmN細(xì)胞(購自上海生化細(xì)胞所)，1小時后棄去上清加入等量混 合的TC-100培養(yǎng)基和低熔點瓊脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染BmN細(xì)胞3-4 天，保存上清，細(xì)胞用Na0H裂解用于Southern blot斑點雜交，以sp_HA-tm 融合基因作模板用隨機(jī)引物探針標(biāo)記試劑盒(寶靈曼公司)標(biāo)記探針，雜交方 法按照《分子克隆》(科學(xué)出版社，1995)。取陽性克隆的上清進(jìn)行第二輪噬 斑篩選。取陽性克隆的上清感染家蠶細(xì)胞擴(kuò)增。即可得到大量的含sp-HA-tm融 合基因的重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm。該病毒能感染家蠶細(xì)胞，在顯微鏡下細(xì)胞 呈發(fā)病狀。
5. 家蠶桿狀病毒Bm-sp-HA-tm感染家蠶細(xì)胞
將桿狀病毒Bm-sp-HA-tm以1 X 106PFU/條針刺接種法接入家蠶蛹，27。C培 養(yǎng)。在感染5-7天后收集蛹體。
6. 帶囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒粒子的分離
(1) 從蠶蛹中分離純化出帶囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒粒子
a. 取適量蠶蛹樣品，與0.85%生理鹽水適量混和，勻漿至漿液細(xì)致均勻即
可；
b. 將勻漿液加入500ml離心管中，配平，3000rpm離心20-60min，取上 清，小心棄去油脂；
c. 將3000rpm離心上清液倒入新500ml離心管中，配平，6000rpm離心 20-60min，取上清，棄油脂；
d. 6000rpm離心的上清液倒入50ml離心管，配平，12000rpm離心30-120min，取上清，棄油脂；
e. 12000rpm離心后的上清，在超凈臺上分裝于滅菌的超離管中，平衡， 35000rpm離心30-90min，使病毒粒子沉淀下來；
f. 35000rpm離心后的上清裝入滅菌的瓶中，先置于4°C，沉淀用無菌溶解 液(0.05MPB， 0.5MNaCl， 0.04%EDTA)重懸，用槍頭反復(fù)輕輕吹打，使沉淀 能充分溶解；沉淀全部溶解后，定容至一定體積(300-500ml)，用于區(qū)帶離心
(Zonal Centrifuge)，進(jìn)一步純化。
(2) 區(qū)帶離心
區(qū)帶離心所需的不同濃度蔗糖均用工作液配制，加樣順序依次為150-200ml 滅菌工作液(0.05M PB， 0. 5M NaCl， 0. 04%EDTA) 、 300-500ml樣品、300-500ml 20%蔗糖、300-500ml 30%蔗糖，最后加52%蔗糖充滿轉(zhuǎn)頭(總體積為 1690ml) 。 35000rpm離心3小時后收樣，用濃度高于52%的蔗糖作頂液，把轉(zhuǎn) 頭里的樣品頂出來，用核酸蛋白檢測儀檢測，無菌離心管收集樣品。
(3) 脫糖
樣品逐管脫糖，選擇截留分子量為750kD的中空纖維膜，用無菌超純水置 換樣品中的蔗糖，直至樣品中幾乎不存在蔗糖。 帶囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒粒子鑒定
測活方法采用紅細(xì)胞凝集試驗。取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在每一排的1到6孔 (Al-A6)加250ul生理鹽水(0.85%)后，加入250^1樣品于第一孔，做倍 比稀釋，同時設(shè)置陰性對照孔，加入不含樣品的液體做倍比稀釋，再加入1%雞 血紅細(xì)胞(市場上購買公雞，抽血，制備成1%紅細(xì)胞溶液)懸液250nl至每 一孔內(nèi)，輕輕震蕩培養(yǎng)板，于37'C孵育4小時后觀察結(jié)果。結(jié)果顯示是陽性， 說明截留的樣品中有HA融合蛋白的表達(dá)，因HA是定位于膜上，則說明了截留 的樣品是膜蛋白。
7. 囊膜(膜蛋白)的分離
上述帶囊膜的病毒粒子樣品在液氮和+37。C之間反復(fù)凍融3次，使囊膜破 裂。12000rpm，離心30min，使大片的囊膜沉淀下來，用于后面的HPLC分析。 其上清再進(jìn)行35000rpm離心30min以上，去除病毒粒子，35000rpm的上清也將 用于HPLC分析。
8. HPLC與質(zhì)譜分析囊膜
沉淀的囊膜用20%乙腈反復(fù)溶解后，取上清用于HPLC上樣，0.5ml/管收集 樣品。35000rpm的上清直接上樣于HPLC，也是0. 5ml/管收集樣品。
收集的樣品用質(zhì)譜級胰酶(sigma)進(jìn)行酶解，于37'C反應(yīng)過夜。酶解后的 樣品再進(jìn)行HPLC分析，按峰或按管收集樣品，用于質(zhì)譜分析。
經(jīng)HPLC分析的樣品進(jìn)行ABI Q-TRAP質(zhì)譜分析，得到可能的氨基酸序列。
9. 數(shù)據(jù)檢索
質(zhì)譜所測得的可能性氨基酸序列與西南農(nóng)大和本地的家蠶蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 比對，通過NPS@提供的跨膜區(qū)域分析軟件及TMHMM服務(wù)器 (http:〃ww. cbs. dtu. dk/services/TMHMM)對蛋白進(jìn)行跨膜分析，分析結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，85%以上的蛋白為膜蛋白，具有跨膜區(qū)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從 本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
序列表
SEQ ID NO 1:
28 gcggatccat gctactagta aatcagtc SEQ ID NO 2:
50 catgtgtaac agtaacgttc ttttccgcaa aggcagaatg cgccgccgcc SEQ ID NO 3:
50 gtcgttacaa tgcagaattt gcattggtga tactgggcta tccaaaaatc SEQ ID NO 4:
35 gagcggccgc ttactttcca agtcggttca tctct SEQ ID NO 5:
26 gaaaag犯cg ttactgttac acatgc SEQ ID NO 6:
25 aatgcaaatt ctgcattgta acgac
權(quán)利要求
1、一種基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋白的方法，其特征在于重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm感染昆蟲宿主細(xì)胞后增殖，在病毒出芽時帶走宿主細(xì)胞膜成分而形成自身的囊膜，將病毒粒子分離出，反復(fù)凍融，獲得膜蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋白的 方法，其特征依次包括以下步驟(1)重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm感染昆蟲細(xì)胞后，27°C、 5%002培養(yǎng)5 7天，收獲被感染昆蟲細(xì)胞；(2 )從被感染昆蟲細(xì)胞中分離純化出帶囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒粒子，經(jīng)多步離心后，再進(jìn)行蔗糖密度剃度離心后收集樣品；(3)脫糖，選擇截留分子量為750kD的中空纖維膜，用無菌超純水置換 樣品中的蔗糖，最后得到膜蛋白。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋白 的方法，其特征在于所述的昆蟲細(xì)胞為家蠶蛹。4 、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋 白的方法，其特征在于所述的重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm的構(gòu)建方法(1) 以gp64 DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp64信號肽，所用引物 Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， 5Psp2:5' catgtgtaacagt犯cgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc3，；(2) 以gp64DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp64跨膜域，所用引物Ptml: 5' gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc3，Ptm2: 5， gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3， ；(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因為模板，PCR擴(kuò)增HA基因，所用引物: Phal: 5， gaaaagaacgttactgttaicacatgc 3，Pha2: 5' aatgcaaattctgcattgtaacgac 3'(4) 以gp64信號肽和HA基因為模板，PCR擴(kuò)增sp-HA融合基因，所用 引物Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， ； Pha2: 5， aatgcaaattctgcattgtaacgac 3，(5) 以sp-HA融合基因和gp64跨膜域為模板，PCR擴(kuò)增sp-HA-tm融合基因，所用引物Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， ；Ptm2: 5， gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3， ；(6) 將融合基因sp-HA-tm連接到pGEM-T vector上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì) 胞E.coli DH5a中，構(gòu)建得克隆質(zhì)粒pGEM-sp-HA-tm;(7) 克隆質(zhì)粒pGEM-sp-HA-tm經(jīng)BamH I和Not I雙酶切切下sp-HA-tm 融合基因片段克隆至經(jīng)BamH I和Not I雙酶切的pBacPAK8中，構(gòu)建成重組 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacsp-HA-tm;(8) 取重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac-sp-HA-tm DNA和經(jīng)Bsu36I酶切線性化的修 飾型病毒BmBacPAK6 DNA，加入無血清的TC-100培養(yǎng)基混勻，取Dosper加 入無血清的TC-100培養(yǎng)基混均，將事先培養(yǎng)在平皿中的BmN細(xì)胞用無血清的 TC-100培養(yǎng)基洗滌兩次，并逐滴加入pBac-sp-HA-tm轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Dosper混 合物，27。C培養(yǎng)4-5天，取上清感染平皿中的Bm N細(xì)胞，1小時后棄去上清 加入等量混合的TC-100培養(yǎng)基和低熔點瓊脂糖，4-5天后挑取噬斑，感染BmN 細(xì)胞3-4天，保存上清，細(xì)胞用Na0H裂解用于Southern blot斑點雜交，以 sp-HA-tm融合基因作模板用隨機(jī)引物探針標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針，雜交；取陽 性克隆的上清感染家蠶細(xì)胞擴(kuò)增，即得到含印-HA-tm融合基因的重組桿狀病 毒Bm-sp-HA-tm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于昆蟲的囊膜病毒出芽方式制備膜蛋白的方法重組桿狀病毒Bm-sp-HA-tm感染昆蟲宿主細(xì)胞后增殖，在病毒出芽時帶走宿主細(xì)胞膜成分而形成自身的囊膜，將病毒粒子分離出，反復(fù)凍融，獲得膜蛋白。本發(fā)明為膜蛋白分離與純化提供了新的技術(shù)方法，為膜蛋白的研究奠定基礎(chǔ)，能促進(jìn)膜蛋白組學(xué)研究的發(fā)展，有助于發(fā)現(xiàn)藥物蛋白作用的靶點，促進(jìn)藥物學(xué)、醫(yī)學(xué)的發(fā)展。
文檔編號C12N15/62GK101358203SQ20081012047
公開日2009年2月4日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者呂正兵, 吳祥甫, 張耀洲, 健 陳 申請人:浙江理工大學(xué)