專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)工程中的蛋白表達(dá)與分離純化的領(lǐng)域，特別涉及一 種利用人囊膜病毒出芽特性分離獲得細(xì)胞膜及細(xì)胞器的膜蛋白的方法。
背景技術(shù)：
生物膜有著重要的生物功能，如提供細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì) 胞與基質(zhì)之間的連接等等。膜蛋白的研究也正成為蛋白質(zhì)組研究的熱點(diǎn)。膜蛋 白是許多藥物的作用靶位點(diǎn)，研究膜蛋白不僅有利于低豐度蛋白的研究，更為 藥物研發(fā)和疾病的診斷提供靶體與標(biāo)記蛋白質(zhì)。然而，膜蛋白的分離是膜蛋白 研究的"瓶頸"，研究蛋白的高效方法雙向電泳技術(shù)也不適合膜蛋白的研究。
本發(fā)明提供一種膜蛋白分離與純化新的技術(shù)方法。利用桿狀病毒出芽并帶 走宿主細(xì)胞部分膜成分的特性，先分離出出芽病毒(囊膜病毒)，再獲得囊膜
(膜蛋白)。然而，桿狀病毒具有限制性，只能感染昆蟲(chóng)細(xì)胞。1995年， Hofmann等研究發(fā)現(xiàn)在桿狀病毒DNA中插入CMV(human cytomegalovirus immediate-early region)后，桿狀病毒可以在人肝細(xì)胞中表達(dá)。1997年， Barsoum等研究報(bào)道，在桿狀病毒DNA中插入VSV-G (vesicular stomatitis virus G protein)能擴(kuò)大宿主范圍并增加轉(zhuǎn)染率。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種胞膜和細(xì)胞器膜蛋白分離與純 化新的技術(shù)方法。
本發(fā)明的一種人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制備方法，是重 組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA感染人宿主細(xì)胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主 細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞膜碎片疏水作用會(huì)形成膜小球，經(jīng)分離、超濾，獲得細(xì)胞膜 及細(xì)胞器膜蛋白。
人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制備方法，具體包括以下步
驟
(1 )重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA以5M0I感染人宿主細(xì)胞，37°C、 5% C02條件下培養(yǎng)4一5天，用PBS沖洗細(xì)胞，收獲細(xì)胞并超聲破碎；
(2 )將上述破碎液經(jīng)12000rpm離心20—60min，膜碎片或膜小球沉淀； 上清液進(jìn)行超速離心，35000rpm， 30—60min，去除病毒粒子；收集12000rpm 離心的沉淀和35000rpm離心的上清液，沉淀用PBS重懸溶解；
(3 )將12000rpm離心沉淀的重懸液及35000rpm離心的上清液，用截留 分子量為750kD的中空纖維膜超濾，獲得細(xì)胞膜及細(xì)胞器的膜蛋白。 所述的人宿主細(xì)胞為人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞。
所述重組桿狀病毒BacmidCMV-G-Ha的構(gòu)建方法在pFastBac 載體中插入 CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用Bac-to-Bac 系統(tǒng)獲得BacmidCMV-G-HA。
所述重組桿狀病毒BacmidCMV-G-Ha的構(gòu)建方法包括以下步驟
(1) 融合基因HA與質(zhì)粒pFastBacTM同時(shí)進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切，在 T4連接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì) 胞E.coli DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切測(cè)序鑒定出正確連接的質(zhì)粒 pFastBac-HA;
(2) 通過(guò)pHCMV-VSV-G的序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，擴(kuò)增出CMV-VSV-G的序 列，含BamH I位點(diǎn)的上幼,弓l物atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I 位點(diǎn)的下游引物gcgaattcgacggatccttatcactttc， PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳，純 化回收反應(yīng)產(chǎn)物；
(3) 步驟(2)純化后的PCR產(chǎn)物與步驟(1)所得質(zhì)粒pFastBac-HA分別 進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切，在T4連接酶的作用下使PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒 pFastBac-HA中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切和 測(cè)序鑒定正確插入的重組質(zhì)粒pFastBacCMV-G-HA;
(4) 根據(jù)Bac-to-Bac 系統(tǒng)，取5ul步驟(3)所得重組質(zhì)粒 pFastBacCMV-G-HA轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中，平板于37。C培養(yǎng)24-48h后 挑取白色克隆，劃線(xiàn)接種至平板上，過(guò)夜培養(yǎng)，證實(shí)是陽(yáng)性克隆；第二天，挑 取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA;
(5)取重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA的DNA約5ul加入100ul Sf-900 II SFM，取cellfectin 試劑加入到100ul的Sf-900 II SFM，再將兩者混勻，室 溫放置15 30min， Sf9培養(yǎng)在含50個(gè)單位的青霉素和鏈霉素的SFM中，將細(xì) 胞轉(zhuǎn)移到27X:至少放置lh，再用不含抗生素的SFM培養(yǎng)基洗滌兩次后，加入上 述的DNA混合物，27C培養(yǎng)5h，移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM，于27 。C培養(yǎng)72h，收獲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA。 所述的融合基因HA的構(gòu)建包括以下步驟
(1) 以gp64DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp64信號(hào)肽基因，PCR所用的兩種引
物為
Pspl: 5， gcgaattcatgctactag"taaatcag 3，
Psp2: 5， tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3，；
(2) 以gp64 DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp64跨膜域基因，PCR所用的兩種引
物為
Ptml: 5， cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3， Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，；
(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因序列為模板，擴(kuò)增HA基因，PCR所用的兩 種引物為
Phal: 5， aaagaacgttactgttacac 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，；
(4) 以gp64信號(hào)肽基因和HA基因?yàn)槟０?，利用PCR方法擴(kuò)增出sp-HA融 合基因序列，PCR所用的兩種引物為
Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，
(5) 以融合基因sp-HA與gp64跨膜域基因?yàn)槟０?，?gòu)建出HA融合基因， PCR所用的兩種引物為
Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，。
步驟(4)中所述的DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞含Bacmid質(zhì)粒。 步驟(4)中所述的平板含Bluo-gal、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、 IPTG。
步驟(4)中所述的液體培養(yǎng)基含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素。 步驟(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素為青霉素和鏈霉素。
本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明構(gòu)建了 BacmidCMV-G-HA重組桿狀病毒，感 染人宿主細(xì)胞，病毒攜帶的HA融合基因表達(dá)后將會(huì)定位于宿主的細(xì)胞膜上，以 HA為膜蛋白上的一個(gè)標(biāo)志，在分離純化中通過(guò)檢測(cè)HA活性追蹤細(xì)胞膜。當(dāng)病毒 大量出芽后，導(dǎo)致宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，破碎的細(xì)胞膜因疏水作用而形成 "球狀"，因此稱(chēng)之為膜小球。由于蛋白的相互作用，細(xì)胞膜上可能會(huì)帶有細(xì) 胞器的成分，因而也獲得了細(xì)胞器的膜成分，反復(fù)凍融使細(xì)胞器的膜破裂。再 對(duì)膜成分進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜分析，從而鑒定并獲得膜蛋白。膜 蛋白質(zhì)的研究一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的瓶頸，本發(fā)明主要針對(duì)膜蛋白，能促進(jìn) 膜蛋白組學(xué)研究的發(fā)展，有助于發(fā)現(xiàn)藥物蛋白作用的靶點(diǎn)，促進(jìn)藥物學(xué)、醫(yī)學(xué) 的發(fā)展。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的目的是提供一種新的膜蛋白分離純化的技術(shù)方法，通過(guò)重組桿狀 病毒感染人宿主細(xì)胞，病毒攜帶的HA融合基因表達(dá)后將會(huì)定位于宿主的細(xì)胞膜 上，以HA為膜蛋白上的一個(gè)標(biāo)志，有HA活性則表明有細(xì)胞膜成分存在。當(dāng)病 毒大量出芽后，導(dǎo)致宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，膜碎片形成膜小球。分離出宿主 細(xì)胞膜小球，由于蛋白的相互作用，細(xì)胞膜小球上可能會(huì)帶有細(xì)胞器的成分。 再對(duì)膜"小球"成分進(jìn)行HPLC和質(zhì)譜分析，從而鑒定并獲得膜蛋白。
為了能時(shí)桿狀病毒能感染人細(xì)胞，本發(fā)明構(gòu)建了 BacmidCMV-G-HA重組桿狀 病毒，通過(guò)從質(zhì)粒pHCMV-VSV-G中擴(kuò)增出CMV-VSV-G的序列，同時(shí)構(gòu)建出HA融 合基因(在HA基因的N端與C端分別連接上信號(hào)肽和跨膜區(qū))，再分別將兩者 插入到pFastBacTM載體中，形成pFastBacCMV-G-HA質(zhì)粒，根據(jù)Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)而獲得BacmidCMV-G-HA重組桿狀病毒。
下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案 實(shí)施例1
HA基因的作用相當(dāng)于一個(gè)分子標(biāo)記，在此發(fā)明中HA可以用其他的基因或標(biāo) 記物代替，如綠色熒光蛋白GFP，本發(fā)明僅以HA基因?yàn)槔@些實(shí)施例并不 用于限定本發(fā)明。
1、 融合基因HA的構(gòu)建
在HA基因(Genbank DQ520855)的5，和3，端分別連接編碼桿狀病毒囊 膜蛋白gp64信號(hào)肽基因序列和gp64跨膜區(qū)基因序列，并在融合基因的5'和 3'端分別引入EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)。分別以桿狀病毒(AcNPV)囊膜糖蛋 白(gp64)信號(hào)肽基因序列(Genbank號(hào)NP 074525)、禽流感病毒H5N1 HA基 因序列(禽流感病毒H5N1杭州流行株，Genbank DQ520855)和AcNPV gp64跨 膜區(qū)基因序列(Genbank號(hào)NP 074525)為模板設(shè)計(jì)3對(duì)引物，首先擴(kuò)增目的片 段gp64信號(hào)肽(以下簡(jiǎn)稱(chēng)sp) 、 HA和gp64跨膜域(以下簡(jiǎn)稱(chēng)tm)，然后 利用各目的片段互為引物和模板合成融合基因HA。設(shè)計(jì)引物如下
Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，
Psp2: 5， tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3，
Phal: 5， aaagaacgttactgttacac 3，
Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，
Ptml: 5， cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3， Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3， (1) gp64信號(hào)肽(sp)的擴(kuò)增
以gp64 DNA (Genbank號(hào)NP 074525)為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，先94。C預(yù) 變性3min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其循環(huán)條件為94'C變性30s, 68t:復(fù)性延伸 30s;循環(huán)結(jié)束后，再68"C延伸5min。
在一個(gè)無(wú)菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
10XPCR Buffer 10 u 1
25mmol MgC12 8u 1
2. 5聽(tīng)l d,s 8 y 1
Pspl
Psp2 1 ti 1
模板 1 u 1
K0D-PlusDNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本) 1 til 加無(wú)菌雙蒸水至100 u 1
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié) 束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時(shí)切膠回收目的片斷。
(2) gp64跨膜域(tm)的擴(kuò)增
以gP64 DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，先94。C預(yù)變性3min，然后進(jìn)行30個(gè) 循環(huán)，其循環(huán)條件為94。C變性30s， 68。C復(fù)性延伸30s;循環(huán)結(jié)束后，再68°C 延伸5min。
100ul的反應(yīng)體系同上，所用引物為Ptml和Ptm2 ，各組分混勻后，放入 PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷， 同時(shí)切膠回收目的片斷。
(3) HA基因的擴(kuò)增
以禽流感病毒H5N1 HA基因序列(從患病雞血清中提取，序列見(jiàn)Genbank DQ520855)為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，先94。C預(yù)變性3min，然后進(jìn)行30個(gè)循 環(huán)，其循環(huán)條件為94t:變性30s， 6『C復(fù)性延伸lmin;循環(huán)結(jié)束后，再68°C 延伸7min。在一個(gè)無(wú)菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR BufferlO ul， 25,1 MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8ul，引物Phal lul，引物Pha2 lul，模板lul， KOD-Plus DNA聚合酶ltil，加無(wú)菌雙蒸水至100ul。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時(shí)切膠回收目的片斷。
(4) gp64信號(hào)肽sp基因與HA基因的融合
進(jìn)行PCR反應(yīng)，先94t:預(yù)變性5min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其循環(huán)條件 為94'C變性30s， 68。C復(fù)性延伸lmin;循環(huán)結(jié)束后，再68'C延伸7min。在一 個(gè)無(wú)菌的0.5ml離心管中，混合下列成分10XPCR BufferlOul， 25mmo1 MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8ul，引物Pspl 1p1，引物Pha2 lul，模板
sp l"l，模板HA l"l， K0D-Plus DNA聚合酶(T0Y0B0，日本)lul，加無(wú) 菌雙蒸水至100 u 1。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時(shí)切膠回收目的片斷。
因?yàn)閟p的下游引物Psp2設(shè)計(jì)時(shí)加入了 HA基因5'端的部分序列，所以 PCR擴(kuò)增出的sp片斷3;端序列與HA基因5'端序列存在重疊，再次利用PCR 方法就可以擴(kuò)增出sp-HA融合基因序列。
(5)融合基因sp-HA再次與tm的融合，構(gòu)建出HA融合基因
PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其循環(huán)條件為94 'C變性30s， 68'C復(fù)性延伸1. 5min;循環(huán)結(jié)束后，再68'C延伸10min。在一個(gè) 無(wú)菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR BufferlOul， 25mtno1 MgC12 8ul， 2.5咖ol dNTPs 8ul，引物Pspl 1p1，引物Ptm2 lul，模板sp-HA 1 ul，模板tm lul， KOD-Plus DNA聚合酶lul，加無(wú)菌雙蒸水至100u 1 。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時(shí)切膠回收目的片斷。
同上，因?yàn)閠m的上游引物Ptml設(shè)計(jì)時(shí)加入了 HA基因3，端的部分序列， 所以PCR擴(kuò)增出的tm片斷5'端序列與HA基因3'端序列存在重疊，再次利用 PCR方法就可以擴(kuò)增出融合基因HA。
2. 構(gòu)建pFastBac-HA質(zhì)粒
上述得到的融合基因HA與質(zhì)粒pFastBac (invitrogen公司Bac-to-Bac baculovirus expression system[kits])同時(shí)進(jìn)行EcoR I禾口 Xho I雙 酶切，在T4連接酶(TAKARA公司試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行)的作用下使HA 融合基因插入到pFastBacTM質(zhì)粒中。根據(jù)kits中說(shuō)明書(shū)操作，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì) 胞E. coli DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切測(cè)序鑒定出正確連接的質(zhì)粒 pFastBac-HA。
3. 構(gòu)建pFastBacCMV-G-HA質(zhì)粒
通過(guò)pHCMV-VSV-G (Genebank NO. AJ3腦4)的序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物， 擴(kuò)增出CMV-VSV-G的序列。上游引物(含BamH I位點(diǎn))
atggatccgagcttggcccattgcatac ， 下游弓|物(含 EcoR I 位點(diǎn)) gcgaattcgacggatccttatcactttc。 PCR程序設(shè)計(jì)如下94。C預(yù)變性7min， 94°C 變性lmin， 68。C復(fù)性延伸3min， 30個(gè)循環(huán)，68°。延伸10min。在一個(gè)無(wú)菌的 0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR Buffer 10u 1， 25mrno1 MgC12 8ul， 2.5 ramol dNTPs 8ul，引物各3p1，質(zhì)粒模板lul， K0D-Plus DNA聚合酶1 "1，加無(wú)菌雙蒸水至100y 1。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳，純化回收反應(yīng)產(chǎn)物。
純化的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pFastBac-HA分別進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切， 在T4連接酶的作用下使PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pFastBac-HA中。轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì) 胞E.coli DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定正確插入的重組質(zhì) 粒pFastBacCMV-G-HA。
4. 桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA
根據(jù)Bac-to-Bac baculovirus expression system操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取 5ul (約lng)重組質(zhì)粒pFastBacCMV-G-HA轉(zhuǎn)化到DHlOBac 感受態(tài)細(xì)胞(含 Bacmid質(zhì)粒)中，平板(含Bluo-gal，卡那霉素，慶大霉素，四環(huán)素，IPTG) 于37'C培養(yǎng)24-48h后挑取白色克隆。劃線(xiàn)接種至平板上，過(guò)夜培養(yǎng)，證實(shí)是陽(yáng) 性克隆。第二天，挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基(含上述三種抗生素)中培 養(yǎng)，用來(lái)分離重組Bacmid質(zhì)粒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的操作而獲得重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA。 PCR鑒定重組質(zhì)粒序列正確。
5. 含重組質(zhì)粒的重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA的獲得 根據(jù)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA的DNA約5ul加入
lOOul Sf-900 II SFM (不含抗生素，invitrogen)，取cellfectin 試劑 (invitrogen)加入到lOOul的Sf-900 II SFM (不含抗生素)，再將兩者混 勻，室溫放置15-30min。 Sf9 (9X 105cells/35隨well)培養(yǎng)在含50個(gè)單位的 青霉素和鏈霉素的SFM中，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到27'C至少放置lh，再用不含抗生素的 SFM培養(yǎng)基洗滌兩次后，加入上述的DNA混合物，27"培養(yǎng)5h。用移液器移去 DNA混合物，加入SFM (含青霉素和鏈霉素)，于27。C培養(yǎng)72h。收獲細(xì)胞，獲 得重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA。
6. 重組桿狀病毒感染人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞
此重組桿狀病毒可以感染各種類(lèi)型的細(xì)胞，本發(fā)明以人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞為例。
重組桿狀病毒以5M0I感染人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(購(gòu)于上海麥莎生物)，37 °C、 5%0)2條件下培養(yǎng)4一5天，PBS沖洗，收獲細(xì)胞，并超聲破碎細(xì)胞。 6.膜蛋白的分離
將上述細(xì)胞破碎液經(jīng)12000rpm離心30min，膜碎片或膜小球沉淀；上清液 進(jìn)行超速離心，35000rpm， 30min，去除病毒粒子；收集12000rpm離心的沉淀 和35000rpm離心的上清液，沉淀用PBS重懸溶解；
8. 超濾
12000rpm離心沉淀的重懸液和35000rpm離心的上清，用截留分子量為 750kD的中空纖維膜(美國(guó)GE公司)進(jìn)行超濾，得到細(xì)胞膜及細(xì)胞器的膜蛋 白。截留液用于HPLC分析。超濾器的操作根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行， 一定要清洗中空纖 維膜。
9. HA活性檢測(cè)
截留的樣品進(jìn)行測(cè)活，測(cè)活方法采用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。取24孔細(xì)胞培養(yǎng) 板，在每一排的1到6孔(A1-A6)加250 u 1生理鹽水(0. 85%)后，加入250 ul樣品于第一孔，做倍比稀釋?zhuān)瑫r(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔，加入不含樣品的液體做 倍比稀釋?zhuān)偌尤?%雞紅細(xì)胞懸液250ul至每一孔內(nèi)，輕輕震蕩培養(yǎng)板，于 37'C孵育4小時(shí)后觀(guān)察結(jié)果。結(jié)果顯示是陽(yáng)性，說(shuō)明HA融合蛋白使定位于膜上 的，否則HA將會(huì)濾出纖維膜。
10. HPLC與Q-Trap LC-MS/MS質(zhì)譜分析膜成分
在750kD超濾的樣品中，由于蛋白之間的相互作用，細(xì)胞膜蛋白可能與細(xì) 胞器的膜蛋白粘連在一起，為了使細(xì)胞器的膜蛋白破裂，將截留樣品在液氮和 十37。C之間反復(fù)凍融3-5次，使膜破裂。12000rpm，離心20-60min，使大片的膜 沉淀下來(lái)，用于后面的HPLC分析。上清液也用于HPLC分析。
12000rpm沉淀部分用20%乙腈反復(fù)溶解后，取上清，用于HPLC上樣， 0. 5ml/管收集樣品。
12000rpm上清液溶解于5%乙腈(acetonitrile)， 直接上樣于HPLC，按 0.5ml/管收集樣品。
收集的樣品用質(zhì)譜級(jí)胰酶(trypsin,購(gòu)于sigma)進(jìn)行酶解，于37'C反應(yīng) 過(guò)夜。酶解后的肽段樣品再進(jìn)行HPLC分析，按峰或按管收集樣品，用于質(zhì)譜分 析。
經(jīng)HPLC分析的樣品進(jìn)行Q-Trap LC-MS/MS (美國(guó)ABI公司)質(zhì)譜分析，得 到蛋白的可能氨基酸序列，用于數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。 11.數(shù)據(jù)檢索
質(zhì)譜所測(cè)得的可能性氨基酸序列在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，同時(shí)通過(guò) NPS@提供的跨膜區(qū)域分析軟件及TMH醒服務(wù)器 (http:〃ww. cbs. dtu. dk/services/TMHMM)對(duì)檢索到的蛋白進(jìn)行跨膜分析，分 析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，約80%的蛋白為膜蛋白，具有跨膜區(qū)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從 本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
序列表
SEQ ID NO 1:
28 atggatccga gcttggccca ttgcatac SEQ ID NO 2:
28 gcgaattcga cggatcctta tcactttc SEQ ID NO 3:
26 gcgaattcat gctactagta aatcag SEO ID NO 4:
44 tgtgtaacag taacgttctt ttccgcaaag gcagaatgcg ccgc SEQ ID NO 5:
45 cgttacaatg cagaatttgc attggtgata ctgggctatc caaaa SEO ID NO 6:
30 gtgagctctt actttccaag tcggttcatc SEQ ID NO 7:
20 aaagaacgtt actgttacac SEQ ID NO 8:
20 atgcaaattc tgcattgtaa
權(quán)利要求
1、一種人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制備方法，其特征在于重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA感染人宿主細(xì)胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞膜碎片疏水作用會(huì)形成膜小球，經(jīng)分離、超濾，獲得細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的 制備方法，其特征依次包括以下步驟(1 )重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA以5M0I感染人宿主細(xì)胞，37°C、 5 %(:02條件下培養(yǎng)4_5天，用PBS沖洗細(xì)胞，收獲細(xì)胞并超聲破碎；(2 )將上述破碎液經(jīng)12000rpm離心20—60min，膜碎片或膜小球沉淀； 上清液進(jìn)行超速離心，35000rpm， 30—60min，去除病毒粒子；收集12000rpm 離心的沉淀和35000rpm離心的上清液，沉淀用PBS重懸溶解；(3 )將12000rpm離心沉淀的重懸液及35000rpm離心的上清液，用截 留分子量為750kD的中空纖維膜超濾，獲得細(xì)胞膜及細(xì)胞器的膜蛋白。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白 的制備方法，其特征在于所述的人宿主細(xì)胞為人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白 的制備方法，其特征在于所述重組桿狀病毒BacmidCMV-G-Ha的構(gòu)建方法在 pFastBac 載體中插入CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用 Bac-to-Bac 系統(tǒng)獲得Bacmi dCMV-G-HA 。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制 備方法，其特征在于所述重組桿狀病毒BacmidCMV-G-Ha的構(gòu)建方法包括以下 步驟(1) 融合基因HA與質(zhì)粒pFastBac 同時(shí)進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切， 在T4連接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBac 質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到感受 態(tài)細(xì)胞E.coli DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切測(cè)序鑒定出正確連接 的質(zhì)粒pFastBac-HA;(2) 通過(guò)pHCMV-VSV-G的序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，擴(kuò)增出CMV-VSV-G的 序列，含BamH I位點(diǎn)的上游弓l物atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I位點(diǎn)的下游引物gcgaattcgacggatccttatcactttc， PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳， 純化回收反應(yīng)產(chǎn)物；(3) 步驟(2)純化后的PCR產(chǎn)物與步驟(1)所得質(zhì)粒pFastBac-HA分 別進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切，在T4連接酶的作用下使PCR產(chǎn)物克隆至 質(zhì)粒pFastBac-HA中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒， 酶切和測(cè)序鑒定正確插入的重組質(zhì)粒pFastBacCMV-G-HA;(4) 根據(jù)Bac-to-Bac 系統(tǒng)，取5ul步驟(3)所得重組質(zhì)粒 pFastBacCMV-G-HA轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中，平板于37。C培養(yǎng)24-48h 后挑取白色克隆，劃線(xiàn)接種至平板上，過(guò)夜培養(yǎng)，證實(shí)是陽(yáng)性克隆；第二天， 挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA;(5) 取重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA的DNA約5ul加入lOOul Sf-900 II SFM，取cellfectin 試劑加入到lOOul的Sf-900 II SFM，再將兩者混勻， 室溫放置15 30min， Sf9培養(yǎng)在含50個(gè)單位的青霉素和鏈霉素的SFM中， 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到27'C至少放置lh，再用不含抗生素的SFM培養(yǎng)基洗滌兩次后， 加入上述的DNA混合物，27'C培養(yǎng)5h，移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM， 于27'C培養(yǎng)72h，收獲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制 備方法，其特征在于所述的融合基因HA的構(gòu)建包括以下步驟(1) 以gp64 DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp64信號(hào)肽基因，PCR所用的兩種引物為Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，Psp2: 5， tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3';(2) 以gp64DNA為模板，PCR擴(kuò)增gp64跨膜域基因，PCR所用的兩種 引物為Ptml: 5， cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3' Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，；(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因序列為模板，擴(kuò)增HA基因，PCR所用的兩種引物為Phal: 5' aaagaacgttactgttacac 3' Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，；(4) 以gp64信號(hào)肽基因和HA基因?yàn)槟０?，利用PCR方法擴(kuò)增出sp-HA 融合基因序列，PCR所用的兩種引物為Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，(5) 以融合基因sp-HA與gp64跨膜域基因?yàn)槟０澹瑯?gòu)建出HA融合基因， PCR所用的兩種引物為Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制 備方法，其特征在于步驟(4)中所述的DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞含Bacmid 質(zhì)粒。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制 備方法，其特征在于步驟(4)中所述的平板含Bluo-gal、卡那霉素、慶 大霉素、四環(huán)素、IPTG。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制 備方法，其特征在于步驟(4 )中所述的液體培養(yǎng)基含卡那霉素、慶大霉 素、四環(huán)素。
10、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的 制備方法，其特征在于步驟(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素 為青霉素和鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人囊膜病毒出芽后細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白的制備方法，是重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA感染人宿主細(xì)胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞膜碎片疏水作用會(huì)形成膜小球，經(jīng)分離、超濾，獲得細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜蛋白。本發(fā)明構(gòu)建了BacmidCMV-G-HA重組桿狀病毒，感染人宿主細(xì)胞，病毒攜帶的HA融合基因表達(dá)后將會(huì)定位于宿主的細(xì)胞膜上，以HA為膜蛋白上的一個(gè)標(biāo)志，在分離純化中通過(guò)檢測(cè)HA活性追蹤細(xì)胞膜。由于蛋白的相互作用，獲得了細(xì)胞器的膜成分，反復(fù)凍融使細(xì)胞器的膜破裂。本發(fā)明主要針對(duì)膜蛋白，能促進(jìn)膜蛋白組學(xué)研究的發(fā)展，有助于發(fā)現(xiàn)藥物蛋白作用的靶點(diǎn)，促進(jìn)藥物學(xué)、醫(yī)學(xué)的發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101358204SQ20081012047
公開(kāi)日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者呂正兵, 吳祥甫, 張耀洲, 健 陳 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)