專利名稱：一種酶解提取山茱萸多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶解提取山茱萸多糖的方法。
(二)
背景技術(shù)：
中藥山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb et Zu cc ) 的干燥果肉，其味酸、澀、微溫，歸肝腎經(jīng)，有補益肝腎、澀精固脫的功 效,是我國傳統(tǒng)名貴的中藥材。中醫(yī)藥臨床研究證明山茱萸是治療糖尿病、 冠心病和高血壓病的主要藥材。
目前國內(nèi)外對山茱萸的研究主要集中在化學(xué)成分及藥理作用方面，其 主要成分為環(huán)烯醚萜苷類、五環(huán)三萜酸及其酯類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油類及多 糖類等，具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗休克、抗心律失常、抗菌、抗炎、 抗衰老、抗癌、抗艾滋病和治療不育癥等藥理活性。
多糖類物質(zhì)是生命代謝不可缺少的重要物質(zhì)，具有多種生物活性而成 為當今生物醫(yī)藥研究和開發(fā)的一大熱點。傳統(tǒng)的山茱萸多糖提取方法主要 是采用熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法提取。熱水浸提法時間長、耗能 高、雜質(zhì)含量高、收率低；酸或堿浸提法雖能提高提取率，但極易破壞多 糖的結(jié)構(gòu)。另外，酸、堿浸提對設(shè)備有一定的影響，且需經(jīng)中和反應(yīng)，操 作程序較為繁瑣，難以在工業(yè)化生產(chǎn)中得以廣泛應(yīng)用。
現(xiàn)有中國專利CN1511539 "山茱萸提取物及其制備方法和用途，，中 提及了 一種山茱萸提取物及其制備方法和用途，該提取物中含有莫諾苷 25 50 % 、馬錢素25~40 % 。目前還未有采用酶法處理提取山茱萸多糖的 報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種酶解提取山茱萸多糖的方法，該方法可提高山 茱萸多糖的提取率及其多糖含量。由于避免了傳統(tǒng)的熱水浸提或酸、石咸提 取對多糖結(jié)構(gòu)的影響，可最大限度地保持多糖的活性。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種酶解提取山茱萸多糖的方法，所述方法包括取山茱萸干燥果肉 粉碎制得山茱萸干粉，加入質(zhì)量為山茱萸干粉質(zhì)量15~60倍的蒸餾水， 加入酶于35 60。C、 pH3.5~7.0下酶解0.5h 4h，酶解結(jié)束后滅酶，提取液 分離純化得到山茱萸多糖提取物；所述酶為下列之一或其中兩種以上的混 合物①纖維素酶、②木瓜蛋白酶、③果膠酶、④淀粉水解酶，酶質(zhì)量用 量為山茱萸干4分質(zhì)量的0.1 24%。所用酶均采用市購商品酶，通常的，纖 維素酶酶活為10000U/g~3 0000U/g ，木瓜蛋白酶酶活為600000U/g ~800000U/g,果膠酶酶活為20000 U/g 40000U/g，淀4分水解酶酶活為1500 U/g ~3000U/g。
所述分離純化方法可按照常規(guī)方法進行，本發(fā)明中所述提取液的分離 純化方法可如下揭:耳又液離心耳又上清液，濃縮至體積為上清液體積的 1/2 1/6得到濃縮液，加入體積為濃縮液體積2~5倍的70% 100% ( v/v) 乙醇，靜置3h 15h,離心、冷凍干燥，得到山茱萸多糖。
通常的，所述山茱萸干燥果肉粉^^至30 150目。
優(yōu)選的，所用酶為果膠酶和木瓜蛋白酶組成的復(fù)合酶，果膠酶質(zhì)量用 量為山茱萸干粉質(zhì)量的4%、木瓜蛋白酶質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量的 3.5%。
優(yōu)選的，所用酶為果膠酶、纖維素酶和淀粉酶組成的復(fù)合酶，果膠酶
質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量的3%、纖維素酶質(zhì)量用量為山茱萸干4分質(zhì)量
的3%、淀粉酶質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量的3%。
具體所述方法如下取山茱萸干燥果肉，粉碎至60 150目得山茱萸 干粉，加入質(zhì)量為山茱萸干粉質(zhì)量30~50倍的蒸餾水，加入質(zhì)量為山茱 萸干粉質(zhì)量的4%的果膠酶和質(zhì)量為山茱萸干粉質(zhì)量的3.5%的木瓜蛋白 酶，于45 55°C 、pH5.0 7.0下酶解0.5h 2.0h,酶解結(jié)束后升溫至80~100°C 滅酶0.5h 2.0h,提取液離心取上清液，濃縮至體積為上清液體積的1/2 1/6 得到濃縮液，加入體積為濃縮液體積2 5 4咅的70% 100%乙醇，靜置 6h 15h,離心(3000 6000r/min, 10min 30min)、冷凍干燥，得到山茱萸 多糖提取物。
本發(fā)明方法相對于傳統(tǒng)的熱水浸提法可使山茱萸多糖提取率提高 10~50%,并可使山茱萸多糖含量才是高15 80%。由于避免了傳統(tǒng)的熱水浸 提或酸、堿提取對多糖結(jié)構(gòu)的影響，采用酶解處理提取山茱萸多糖具有條 件溫和、易除去雜質(zhì)、最大限度地保持多糖活性等優(yōu)點。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍 并不僅限于此
實施例1:
(1) 干燥粉碎取烘干的山茱萸干燥果肉，研磨粉碎成30目的山茱萸干粉。
(2) 酶處理取10.0g山茱萸干粉，加入蒸餾水150g混合，加入木瓜蛋白 酶(酶活800000 U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司)0.6g,用l.Omol/L NaOH和l.Omol/L HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.0。在溫度為45。C下酶解提
取1.5h。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至100。C滅酶0.5h。
(4) 醇沉提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/6，向濃縮液中加入2倍 體積的100%乙醇，攪拌均勻后靜止12h后離心，沉淀物經(jīng)冷凍干燥后得 到山茱萸多糖0.785g，山茱萸多糖含量為48.6%。
實施例2:
(1) 干燥粉碎取烘干的山茱萸干燥果肉，研磨粉碎成30目的山茱萸干粉。
(2) 酶處理取10.0g山茱萸干粉，加入蒸餾水150g混合，再加入果膠酶 (酶活20000 U/g，天津市利華酶制劑廠)0.6g、木瓜蛋白酶(酶活800000
U/g,廣西南寧龐博生物工程有限公司)0.6g，用1.0mol/LNaOH和1.Omol/L HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值為5.0。在溫度為35。C下酶解提取2.0h。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至100。C滅酶0.5h。
(4) 醇沉提耳又液離心后上清液濃縮至原體積的1/2,向濃縮液中加入5倍 體積的70%乙醇，攪拌均勻后靜止12h后離心，沉淀物經(jīng)冷凍干燥后得 到山茱萸多糖0.798g,山茱萸多糖含量為51.3%。
實施例3:
(1) 干燥粉碎取烘干的山茱萸千燥果肉，研磨粉碎成100目的山茱萸干 粉。
(2) 酶處理取10.0g山茱萸干粉，加入蒸餾水300g混合，再加入果膠酶 (酶活20000 U/g，天津市利華酶制劑廠)0.3g、木瓜蛋白酶(酶活800000
U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司)0.3g、纖維素酶(酶活15000U/g, 無錫市雪梅酶制劑科技有限公司)0.3g、淀粉水解酶(酶活2000U/g,北 京東華強盛生物技術(shù)有限7>司)0.3g,用1.0mol/LNaOH和1.Omol/LHC1 調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0。在溫度為60。C下酶解提取0.5h。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至90。C滅酶1.5h。
(4) 醇沉提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/4，向濃縮液中加入4倍 體積的90%乙醇，攪拌均勻后靜止12h后離心，沉淀物經(jīng)冷凍干燥后得 到山茱萸多糖0.766g，山茱萸多糖含量為59.6%。
實施例4:
(1) 干燥粉碎取烘干的山茱萸干燥果肉，研磨粉碎成150目的山茱萸干 粉。
(2) 酶處理取10.0g山茱萸干粉，將山茱萸干粉和600g蒸餾水混合，再 加入纖維素酶(酶活15000U/g，無錫市雪梅酶制劑科技有限公司)0.6g、 淀粉水解酶(酶活2000U/g,北京東華強盛生物技術(shù)有限公司)0.6g,用 1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值為3.5。在溫度為45°C 下酶解纟是耳又4.0h。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至80。C滅酶l.Oh。
(4) 醇沉提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/6,向濃縮液中加入3倍 體積的95%乙醇，攪拌均勻后靜止12h后離心，沉淀物經(jīng)冷凍干燥后得 到山茱萸多糖0.813g,山茱萸多糖含量為47.7%。
實施例5:
取粉碎至60目的山茱萸藥材粉末100.00克放入提取罐內(nèi)，加入 4000ml蒸餾水，并加入木瓜蛋白酶(酶活800000 U/g,廣西南寧龐博生 物工程有限公司)L5g、纖維素酶(酶活15000U/g,無錫市雪梅酶制劑科 技有限公司)4.0g組成的復(fù)合酶，用1.Omol/L NaOH和1.0mol/L HC1調(diào) 節(jié)pH值為7.0,在酶解溫度為40。C下進行酶解l.Oh。酶解完成后迅速升 溫至80"C，保持1.0h，提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/2,向濃縮
液中加入4倍體積的80%乙醇，靜置15h后，在轉(zhuǎn)速為3000r/min下離心 30min，沉淀物經(jīng)冷凍干燥后得到山茱萸多糖0.903g,山茱萸多糖含量為 42.3 % 。
實施例6:
取粉碎至100目的山茱萸藥材粉末100.00克放入提取罐內(nèi)，加入 3000ml蒸餾水，并加入果膠酶(酶活20000 U/g,天津市利華酶制劑廠) lg,木瓜蛋白酶(酶活800000 U/g,廣西南寧龐博生物工程有限公司)1.5g、 纖維素酶(酶活15000U/g,無錫市雪梅酶制劑科技有限公司)0.5g組成 的復(fù)合酶，用1.Omol/L NaOH和l.Omol/L HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.5, 在溫度為45。C下進行酶解0.5h。酶解完成后迅速升溫至100。C,保持0.5h， 提耳又液離心后上清液濃縮至原體積的1/6,向濃縮液中加入3倍體積的 75%乙醇，靜置15h后，在轉(zhuǎn)速為6000r/min下離心10min,沉淀物經(jīng)冷 凍干燥后得到山茱萸活性多糖0.931g，山茱萸多糖含量為39.1%。
實施例7:
取粉碎至150目的山茱萸藥材粉末100.00克放入提取罐內(nèi)，加入 5000ml蒸餾水，并加入果膠酶(酶活20000 U/g,天津市利華酶制劑廠) 4g，木瓜蛋白酶(酶活800000 U/g,廣西南寧龐博生物工程有限公司)l.Og 組成的復(fù)合酶，，用1.0mol/LNaOH和1.Omol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的pH值為 5.0，在溫度為55。C下進行酶解2.0h。酶解完成后迅速升溫至90。C,保持 2.0h，揭:耳又液離心后上清液濃縮至原體積的1/3,向濃縮液中加入3倍體 積的90%乙醇，靜置6h后，在轉(zhuǎn)速為5000r/min下離心15min,沉淀物 經(jīng)冷凍干燥后得到山茱萸活性多糖1.053g,山茱萸多糖含量為37.5%。
權(quán)利要求
1.一種酶解提取山茱萸多糖的方法，所述方法包括取山茱萸干燥果肉粉碎制得的山茱萸干粉，加入質(zhì)量為山茱萸干粉質(zhì)量15～60倍的蒸餾水，加入酶于35～60℃、pH3.5～7.0下酶解0.5h～4h，酶解結(jié)束后滅酶，提取液分離純化得到山茱萸多糖提取物；所述酶為下列之一或其中兩種以上的混合物①纖維素酶、②木瓜蛋白酶、③果膠酶、④淀粉水解酶，酶質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量的0.1～24％。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下提取 液離心取上清液，濃縮至體積為上清液體積的1/2 1/6得到濃縮液，加 入體積為濃縮液體積2 5倍的70% 100%乙醇，靜置3h 15h,離心、 冷凍干燥，得到山茱萸多糖提^C物。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述山茱萸干燥果肉粉碎至 30 150目。
4. 如權(quán)利要求1 3之一所述的方法，其特征在于所用酶為果膠酶和木瓜 蛋白酶組成的復(fù)合酶，果膠酶質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量的4.0%、蛋 白酶質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量的3.5%。
5. 如權(quán)利要求1~3之一所述的方法，其特征在于所用酶為果膠酶、纖維 素酶和淀粉水解酶組成的復(fù)合酶，果膠酶質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量 的3%、纖維素酶質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量的3%、淀粉酶質(zhì)量用量 為山茱萸干4分質(zhì)量的3%。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下取山茱萸干燥 果肉，粉碎至60 150目得山茱萸干粉，加入質(zhì)量為山茱萸干粉質(zhì)量 30 50倍的蒸餾水，加入質(zhì)量為山茱萸干粉質(zhì)量的3%的果膠酶、質(zhì)量 為山茱萸干粉質(zhì)量的3%的纖維素酶和質(zhì)量為山茱萸干4分質(zhì)量的3%的 木瓜蛋白酶，于45 55。C、 pH5.0~7.0下酶解0.5h 2.0h,酶解結(jié)束后升 溫至80 100。C滅酶0.5h 2.0h,提取液離心取上清液，濃縮至體積為上 清液體積的1/2 1/6得到濃縮液，加入體積為濃縮液體積3 5倍的95% 乙醇，靜置6h 15h,離心、冷凍干燥，得到山茱萸多糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種酶解提取山茱萸多糖的方法，所述方法包括取山茱萸干燥果肉粉碎制得山茱萸干粉，加入質(zhì)量為山茱萸干粉質(zhì)量15～60倍的蒸餾水，加入酶于35～60℃、pH3.5～7.0下酶解0.5h～4h，酶解結(jié)束后滅酶，提取液分離純化得到山茱萸多糖提取物；所述酶為下列之一或其中兩種以上的混合物①纖維素酶、②木瓜蛋白酶、③果膠酶、④淀粉水解酶，酶質(zhì)量用量為山茱萸干粉質(zhì)量的0.1～24％。本發(fā)明方法相對于傳統(tǒng)的熱水浸提法可使山茱萸多糖提取率提高10～50％，并可使山茱萸多糖含量提高15～80％。由于避免了傳統(tǒng)的熱水浸提或酸、堿提取對多糖結(jié)構(gòu)的影響，采用酶解處理提取山茱萸多糖具有條件溫和、易除去雜質(zhì)、最大限度地保持多糖活性等優(yōu)點。
文檔編號C12P19/04GK101348817SQ200810120569
公開日2009年1月21日 申請日期2008年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日
發(fā)明者付立忠, 吳學(xué)謙, 吳慶其, 李海波, 程俊文, 亮 賀, 魏海龍 申請人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院