專利名稱：：豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種豬Sirtl(pSirtl)基因小干擾RNA(siRNA)表達(dá)載體的構(gòu)建方法及用途，屬于生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)
技術(shù)領(lǐng)域：
的應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
：Sirtl是酵母染色質(zhì)沉默因子Sir2的哺乳動(dòng)物同源體，是一種依賴于煙堿腺嘌呤二核苷酸的組蛋白脫乙酰酶。Sirtl是一種核蛋白，它具有多種生物學(xué)功能，它不僅是一個(gè)重要的與機(jī)體長壽有關(guān)的因子，而且可能在動(dòng)物脂肪沉積和肌肉發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。因此，開展Sirtl在動(dòng)物脂肪代謝和肌肉發(fā)育中的功能研究具有重要的意義。豬Sirtl(pSirtl)全長cDNA序列4024bp，GenBank登錄號(hào)EU030283，編碼區(qū)2226bp,編碼742個(gè)氨基酸，蛋白分子量80.9kDa，含有Sirtl蛋白家族的保守核心結(jié)構(gòu)域；BLAST結(jié)果表明，pSirtl氨基酸序列與人、狗、牛、鼠同源性分別達(dá)到87%，92%，91%和82%。RNA干擾(RNAi)技術(shù)作為一種新的基因阻斷技術(shù)，具有低成本、高效性、高特異性以及可傳遞性等特點(diǎn)，能特異、高效地抑制特定基因的表達(dá)，已經(jīng)成為研究基因功能的一種有力工具。由于干擾載體/^7ewcw4.7-CMVneo可以方便用于目的基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建，從而可以特異性的使特定目的基因沉默，功能喪失，因此干擾載體/7&7e"c^4.7-CMVneo可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具，用于功能基因組的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，以及該小干擾RNA表達(dá)載體的用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)、通過RACE技術(shù)克隆得至UpSirtl全長cDNA序列；2)、根據(jù)載體的信息和靶序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)含9個(gè)核苷酸的loop環(huán)的siRNA引物，該9個(gè)核苷酸為TTCAAGAGA;3)、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建siRNA引物退火后與雙酶切的RNAi載體連接轉(zhuǎn)化，得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。作為本發(fā)明的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的改進(jìn)，步驟2)為根據(jù)步驟1)所得的pSirrtl全長基因序列，篩選并設(shè)計(jì)4對(duì)siRNA引物；該4對(duì)siRNA引物分別為引物I:引物II:引物m:引物IV:作為本發(fā)明的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3)為將i^7e"cer4.7-CMVneo質(zhì)粒進(jìn)行Sam//1和歷"dIII雙酶切后，與siRNA弓|物退火后得到的DNA片段連接，采用熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌。作為本發(fā)明的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟l)為設(shè)計(jì)并合成pSirtl的特異性引物PlP4，利用3'-RACE、5-RACE技術(shù)和pSirtl的特異性引物P1P4，克隆得到豬3'和5'端序列并對(duì)序列進(jìn)行測序鑒定；將Sirtl的5'和3'序列拼接得到pSirtl全長cDNA序列，將pSirtl全長cDNA序列登錄到GenBank，利用NCBI上的BLAST工具對(duì)pSirtl堿基序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；特異性引物P1P4是Pl:5'-GTTAGGAGGTGAATATGCCAAG-3';P2:5'-CACGAACACAAAAAGAGTTGGC-3';P3:5'-AACTGGCATGTGAGGCTCTATC-3';P4:5'-CAGAAGGTTATCTCGGTACCCA-3'。作為本發(fā)明的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)，將步驟3)所得的RNAi表達(dá)載體進(jìn)行鑒定通過抗生素篩選，將陽性克隆采用PCR和測序鑒定；PCR反應(yīng)的引物為特異性上游引物和RNAi干擾載體的本身引物5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3';測序引物為5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3'。本發(fā)明還同時(shí)提供了按照上述方法所得的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的用途用于研究pSirtl基因?qū)χ敬x產(chǎn)生的影響。作為本發(fā)明的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的用途的改進(jìn)，包括以下步驟(1)、將含pSirtl的siRNA表達(dá)載體的大腸桿菌擴(kuò)培后，提取高純轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒；(2)、將含pSirtl的siRNA表達(dá)載體的高純轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬脂肪細(xì)胞等細(xì)胞，37°C，5X的C02中保溫46h后更換不含抗生素的培養(yǎng)基；(3)、轉(zhuǎn)染48h后，分析siRNA表達(dá)載體對(duì)pSirtl及脂肪代謝關(guān)鍵功能基因ATGL、HSL、PPARy等表達(dá)的影響，研究Sirtl的功能。本發(fā)明的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其用途，具有以下有益效果本發(fā)明通過RACE技術(shù)克隆得到pSirtl全長cDNA序歹U，然后根據(jù)i^7ewcwneo載體信息和靶序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)siRNA引物，siRNA引物經(jīng)退火后與雙酶切的p&7e加wneo載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，構(gòu)建得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒，經(jīng)篩選和條件優(yōu)化后，構(gòu)建好的RNAi表達(dá)載體對(duì)pSirtl具有較好的干擾效果。本發(fā)明是利用RNAi技術(shù)，開拓了目前研究豬脂肪代謝調(diào)控和基因功能研究的新思路。此法所用的RNAi表達(dá)載體p&7eMcer4.7-CMVneovector方便易得，載體構(gòu)建方法簡單、可行，同時(shí)構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體能夠特異、高效地抑制pSirtl基因的表達(dá)，是研究pSirtl功能的一種強(qiáng)有力的研究技術(shù)，為開展pSirtl在豬脂肪代謝和肌肉發(fā)育中的功能研究具有重要的意義。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是siRNA弓1物退火后電泳檢測圖中M---DNAmarker，l-隱隱RSl，2—RS2，3---RS3，4—RS4，5—Control;圖2是消化pSilencer4.1-CMV后的電泳檢測圖中M—-DNAmarker，1—-質(zhì)粒，2—質(zhì)粒，3—雙酶切質(zhì)粒；圖3是PCR產(chǎn)物檢電泳測圖中M---DNAmarker;RS1~RS4—陽性克隆PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；圖4是各干擾載體對(duì)pSirtlmRNA表達(dá)的影響(不同小寫字母表示P<0.05;不同大寫字母表示P〈0.01);圖5是pSirtl-siRNA對(duì)pSirtlmRNA表達(dá)的影響圖6是pSirtl-siRNA(RS3)對(duì)pSirtlmRNA表達(dá)的影響圖；(不同字母表示P<0.01)圖7是pSirtl-siRNA(RS3)對(duì)pSirtl蛋白表達(dá)的影響圖8是Sirtl-siRNA(RS3)對(duì)基因表達(dá)的影響圖(不同字母表示P<0.01);圖9是RES和pSirtl-siRNA對(duì)pSirtl基因表達(dá)的影響圖(不同小寫字母表示P<0.05;不同大寫字母表示P〈0.01);圖10是細(xì)胞免疫熒光分析RES和pSirtl-siRNA(RS3)對(duì)pSirtl蛋白表達(dá)的影響圖；圖11是RES和pSirtl-siRNA對(duì)脂肪代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)的影響圖(不同小寫字母表示P〈0.05;不同大寫字母表示P〈0.01)。具體實(shí)施例方式(一)、豬Sirtl(pSirtl)基因全長cDNA克隆及序列分析1、根據(jù)GenBank上登錄的pSirtl的部分序列設(shè)計(jì)并合成Sirtl3'-RACE和5'-RACE的特異性引物PI:5'-GTTAGGAGGTGAATATGCCAAG-3'(SEQIDNO:1)P2-5'-CACGAACACAAAAAGAGTTGGC-3'(SEQIDNO:2)P3:5'-AACTGGCATGTGAGGCTCTATC國3'(SEQIDNO:3)P4:5'-CAGAAGGTTATCTCGGTACCCA-3'(SEQIDNO:4)2、基因組總RNA提取利用TrizolReagent提取豬的基因組總RNA，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。3、豬Sirtl基因全長cDNA克隆及序列分析利用3'-RACE、5-RACE技術(shù)和上述pSirtl的特異性引物，克隆得到豬3'和5'端序列并對(duì)序列進(jìn)行測序鑒定。將Sirtl的5'和3'序列拼接得到pSirtl全長cDNA序列，將pSirtl全長cDNA序列登錄到GenBank(EU030283)，利用NCBI上的BLAST工具對(duì)pSirtl堿基序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果如下通過RACE技術(shù)克隆得到pSirtl全長cDNA序列4024bp，GenBank登錄號(hào)EU030283，編碼區(qū)2226bp，編碼742個(gè)氨基酸，蛋白分子量80.9kDa，含有Sirtl蛋白家族的保守核心結(jié)構(gòu)域；BLAST結(jié)果表明，pSirtl氨基酸序列序列與人、狗、牛、鼠同源性分別達(dá)到87%，92%，91%和82%。(二)、pSirtl的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定I、靶序列選擇根據(jù)(一)得到的pSirtl全長基因序列，遵循Tuschl規(guī)則和Cenix規(guī)則設(shè)計(jì)并篩選pSirtl的siRNA靶序列RS1:5'-AAATCGTCACCAATGGTTTCC-3'RS2:5'-AATTCCTCCACCTGAATTGGA-3'RS3:5'陽AAGAGATGGCATTTATGCACG-3'RS4:5'-AATCCAGAGGATAATCCAGTG-3'選擇9個(gè)核苷酸的loop環(huán)"TTCAAGAGA"，根據(jù)載體的信息和靶序列設(shè)計(jì)并合成siRNA引物。合成引物的結(jié)構(gòu)順序?yàn)?lt;formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>所得的4對(duì)shRNA引物分別為引物I(SEQIDNO:9禾BSEQIDNO:10)AS:引物II(SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12)AS:引物III(SEQIDNO:13和SEQIDNO:14)AS:引物IV(SEQIDNO:15和SEQIDNO:16)AS:2、引物退火將合成好的引物稀釋至100pmol/pL，取正反義鏈引物各4pL、10X退火緩沖液4^L和無酶水28pL，進(jìn)行退火，退火條件為100°C水浴20min，自然冷卻至室溫。然后瓊脂糖凝膠電泳檢測退火反應(yīng)結(jié)果。引物退火結(jié)果如圖l所示，表明退火成功。3、將含有/&7e"cer4.7-CMV質(zhì)粒的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，然后利用小批量提取上述質(zhì)粒，再將質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和HindIII雙酶切，反應(yīng)條件為37°C水浴16h或酶切過夜，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，并割膠回收線性化的載體。質(zhì)粒提取及雙酶切結(jié)果如圖2所示，表明雙酶切成功。4、插入片段(步驟2所得的退火產(chǎn)物)和載體片段(步驟3雙酶切后的載體)用T4DNA連接酶4'C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5oi感受態(tài)細(xì)胞，37'C培養(yǎng)過夜。得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。5、經(jīng)抗性初步篩選后，挑取白色單菌落接種于3ml液體LB培養(yǎng)基中(含Amp100ng/ml)，37'C振蕩培養(yǎng)12h，進(jìn)行PCR和克隆測序鑒定。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反應(yīng)條件為(1)94。C預(yù)變性4min;(2)94。C變性45sec，58°C45sec，72°C55sec，共35個(gè)循環(huán)；(3)72°C7min，4。C保存。陽性克隆菌液PCR鑒定結(jié)果表明，用鑒定引物CMV-F和特異性pSirtl引物PCR擴(kuò)增的片段大小為187bp，與本實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果相符，確定為陽性克隆(圖3)。CMV-F是RNA千擾載體pSilencer4.1-CMV中的鑒定引物，是根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)合成的。陽性克隆測序及序列比對(duì)鑒定結(jié)果表明，與插入的序列完全一致，證明pSirtl的siRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。這為進(jìn)一步研究pSirtl基因的功能及調(diào)控脂肪代謝的作用途徑打下基礎(chǔ)，也為通過RNAi技術(shù)研究動(dòng)物脂肪沉積奠定基礎(chǔ)。(三)、有效siRNA篩選1、利用Lipofectamine2000介導(dǎo)將第(二)步構(gòu)建篩選得到的豬Sirtl的重組干擾載體及無關(guān)序列(陰性對(duì)照)和空白對(duì)照分別轉(zhuǎn)染豬脂肪細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為70%~90%，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清，不含抗生素；對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50^無血清培養(yǎng)基(OPTI-MEMI培養(yǎng)基)稀釋3昭DNA;對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50nlOPTI-MEMI培養(yǎng)基稀釋10piLipofectamine2000試劑。Lipofectamine2000稀釋后，在30min內(nèi)同稀釋的DNA混合(保溫時(shí)間過長會(huì)降低活性)；混合稀釋的DNA和稀釋的Lipofectamine2000，在室溫保溫20min(復(fù)合物可以在室溫保持6h穩(wěn)定);直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻，每處理重復(fù)三次。如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板，在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換無血清培養(yǎng)基；在37"，5X的C02中保溫46h后更換不含抗生素的完全培養(yǎng)基；在細(xì)胞中加入復(fù)合物1848h后，分析檢測干擾效果。2、干擾效果檢測轉(zhuǎn)染48h后，用TrizolReagent提取細(xì)胞中總RNA，采用Real-time定量PCR方法檢測豬Sirtl基因表達(dá)水平。結(jié)果為pSirtl干擾載體(pSirtl-siRNA)篩選轉(zhuǎn)染pSirtl-siRNA(RS1，RS2，RS3，RS4)48h后，熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，陰性對(duì)照組pSirtl基因的表達(dá)沒有明顯的變化；RS2轉(zhuǎn)染組、RS3轉(zhuǎn)染組和RS4轉(zhuǎn)染組的pSirtl基因mRNA水平分別降低19.16%(PO.Ol)、30.00%(PO.01)和19.66%(P〈0.01);其中，RS3抑制效果最好，與RS2轉(zhuǎn)染組相比pSirtl基因mRNA水平降低了10.84%(P<0.05)，與RS4轉(zhuǎn)染組相比pSirtl基因mRNA水平降低了10.35%(PO.05)(圖4)。(四)、干擾條件優(yōu)化對(duì)篩選出的抑制效果最好的siRNA的質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體Lipofectamine2000的量進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)六孔板細(xì)胞量，本實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的質(zhì)粒DNA(嗎)和Lipofectamine2000(pL)的量為2:4，2:6，2:8，2:10;3:4，3:6，3:8，3:10;4:8，4:10，4:12;以上單位均指pg/^iL。不同質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體濃度及比例對(duì)pSirtl表達(dá)的影響。將篩選出的有效的pSirtl-siRNA表達(dá)載體RS3的質(zhì)粒和脂質(zhì)體Lipofectamine2000按照不同的濃度和不同的比例進(jìn)行干擾條件優(yōu)化，結(jié)果表明，DNA3pg和Liposome10pL時(shí)轉(zhuǎn)染RS3對(duì)pSirtl基因表達(dá)的抑制效果最好，抑制率可以達(dá)到70%左右(圖5)。本研究篩選出了能夠有效干擾豬Sirtl基因表達(dá)的siRNA干擾載體，并對(duì)干擾條件進(jìn)行了優(yōu)化，這將為進(jìn)一步探討豬Sirtl基因在豬脂肪代謝和脂肪沉積中的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。(五)、pSirtl-siRNA(RS3)對(duì)目的基因mRNA表達(dá)的影響選取第(三)步篩選得到抑制效果最好的RS3的siRNA表達(dá)載體，按照第(四)步的優(yōu)化的反應(yīng)體系，檢測其對(duì)目的基因mRNA表達(dá)的抑制作用。將豬脂肪細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h后，使其在轉(zhuǎn)染日密度達(dá)70-95%進(jìn)行處理。轉(zhuǎn)染條件按優(yōu)化時(shí)抑制效果最佳的比例的進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分成三個(gè)組對(duì)照組(Control),轉(zhuǎn)染空載體，pSirtl-siRNA組，轉(zhuǎn)染有效重組干擾載體RS3;陰性對(duì)照組(Neg.-control)轉(zhuǎn)染/&7ewc"4J-CMVneoNegativeControl,每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染48h后收集脂肪細(xì)胞，Real-time定量PCR檢測pSirtl基因mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖6所示轉(zhuǎn)染pSirtl-siRNA(RS3)48h后，豬脂肪細(xì)胞中pSirtl基因表達(dá)顯著低于對(duì)照組和陰性對(duì)照組，與對(duì)照組相比，pSirtl-siRNA組pSirtl基因mRNA水平下降49.70%(PO.01);陰性對(duì)照組與對(duì)照組之間差異不顯著。(六)、pSirtl-siRNA(RS3)對(duì)目的基因蛋白表達(dá)的影響選取第(三)步篩選得到抑制效果最好的RS3的siRNA表達(dá)載體，按照第(四)步的優(yōu)化的反應(yīng)體系，檢測其對(duì)目的基因蛋白表達(dá)的抑制作用。將豬脂肪細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h后，使其在轉(zhuǎn)染日密度達(dá)70-95%進(jìn)行處理。轉(zhuǎn)染條件按優(yōu)化時(shí)抑制效果最佳的比例的進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分成三個(gè)組對(duì)照組(Control),轉(zhuǎn)染空載體，pSirtl-siRNA組，轉(zhuǎn)染有效重組干擾載體RS3;陰性對(duì)照組(Neg,control)轉(zhuǎn)染；Si/e"cerneoNegativeControl,每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染48h后共聚焦免疫熒光檢測pSirtl基因蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖7所示轉(zhuǎn)染pSirtl-siRNA(RS3)48h后豬脂肪細(xì)胞中pSirtl基因的蛋白表達(dá)水平免疫熒光檢測結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，pSirtl主要表達(dá)在脂肪細(xì)胞的核和或漿內(nèi)，陽性呈明顯的黃綠色；與對(duì)照組相比，pSirtl-siRNA組降低了pSirtl的蛋白水平。(七)、pSirtl-siRNA(RS3)對(duì)脂肪代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)的影響選取第(三)步篩選得到抑制效果最好的RS3的siRNA表達(dá)載體，按照第(四)步的優(yōu)化的反應(yīng)體系，檢測其對(duì)目的基因蛋白表達(dá)的抑制作用。將豬脂肪細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h后，使其在轉(zhuǎn)染日密度達(dá)70-95%進(jìn)行處理。轉(zhuǎn)染條件按優(yōu)化時(shí)抑制效果最佳的比例的進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分成三個(gè)組對(duì)照組(Control),轉(zhuǎn)染空載體，pSirtl-siRNA組，轉(zhuǎn)染有效重組干擾載體RS3;陰性對(duì)照組(Neg,control)轉(zhuǎn)染；5V/e"cw￥J-CMVneoNegativeControl,每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。Real-time定量PCR檢測脂肪代謝關(guān)鍵功能基因PPARy、ATGL和HSL的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果如下轉(zhuǎn)染pSirtl-siRNA(RS3)48h后，豬脂肪細(xì)胞中其它各基因的mRNA表達(dá)水平見圖8。結(jié)果表明，pSirtl-siRNA組豬脂肪細(xì)胞中pATGL和HSL基因表達(dá)顯著低于對(duì)照組和陰性對(duì)照組(PO.Ol)，PPARY的mRNA水平顯著高于對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)。與對(duì)照組相比，pSirtl-si畫A組pATGL和HSLmRNA水平分別降低了29.54%(PO.Ol)和9.05%(P〈0.01);PPARy基因的mRNA水平分別提高了61.65%(PO.01)(圖8)。(八)、Sirtl功能及其對(duì)脂肪代謝的影響將豬脂肪細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h后，使其在轉(zhuǎn)染日密度達(dá)70-95%進(jìn)行處理。試驗(yàn)分成4個(gè)處理組對(duì)照組(Control),轉(zhuǎn)染空載體；RES(Sirtl激動(dòng)劑)組，DMEM/F12培養(yǎng)基+50|imol/LRES;pSirtl-siRNA組，脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染有效的重組干擾載體RS3;RES+pSirtl-siRNA組，DMEM/F12培養(yǎng)基+50阿ol/LRES，并轉(zhuǎn)染pSirtl-siRNA,每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染48h后收集脂肪細(xì)胞，檢測對(duì)pSirtl基因mRNA水平和蛋白水平的影響，并進(jìn)一步探討對(duì)脂肪代謝關(guān)鍵功能基因PPARy、ATGL和HSL基因mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果如下RES50與pSirtl-siRNA協(xié)同作用對(duì)pSirtl基因表達(dá)的影響結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，RES處理組能顯著提高pSirtl基因的表達(dá)(48.34%，P<0.01)，pSirtl-siRNA處理組顯著降低pSirtl基因的表達(dá)(32.13%，P<0.05)，RES+pSirtl-siRNA處理組對(duì)pSirtl基因的表達(dá)影響不顯著(P>0.05);與RES處理組相比，RES+pSirtl-siRNA處理組降低pSirtl基因的表達(dá)(28.48%,PO.01);與pSirtl-siRNA處理組相比，RES+pSirtl-siRNA處理組提高了pSirtl基因的表達(dá)(56.31%，PO.05)(圖9)。免疫熒光檢測結(jié)果表明，RES處理組能提高pSirtl蛋白水平，pSirtl-siRNA組能降低pSirtl蛋白水平，RES+pSirtl-siRNA處理組pSirtl蛋白水平也較對(duì)照組和RES組低(圖10)。RES50與pSirtl-siRNA協(xié)同作用對(duì)脂肪代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，RES處理組能顯著提高ATGL(17.41%，P<0.01)禾BHSL(93.40%，PO.01)基因的表達(dá)，pSirtl-siRNA處理組顯著降低ATGL(35.04%，P<0.01)和HSL(28.20%，P>0.05)基因的表達(dá)；與RES處理組相比，RES+pSirtl-siRNA處理組降低pATGL(9.00%,P>0.05)和HSL28.07%，P<0.05)基因的表達(dá)；與pSirtl-siRNA處理組相比，RES+pSirtl-siRNA處理組提高了ATGL(64.51%，PO.01)和HSL(93.75%,PO.01)基因的表達(dá)(圖11)。與對(duì)照組相比，pSirtl-siRNA組和RES+pSirtl-siRNA組使PPARy基因表達(dá)顯著提高了304.85%(PO.01)和127.19%(PO.01);與RES處理組相比，RES+pSirtl-siRNA處理組的PPARY基因表達(dá)提高了211.52%(P<0.01);與pSirtl-siRNA處理組相比，RES+pSirtl-siRNA處理組PPARy基因表達(dá)降低了43.85%(PO.01)(圖11)。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表SEQIDNO:1gttaggaggtgaatatgccaag22SEQIDNO:2cacgaacacaaaaagagttggc22SEQIDNO:3aactggcatgtgaggctctatc22SEQIDNO:4cagaaggttatetcggtaccca22SEQIDNO:5aaatcgtcaccaatggtttcc21SEQIDNO:6aattcctccacctgaattgga21SEQIDNO:7aagagatggcatttatgcacg21SEQIDNO:8aatccagaggataatccagtg21SEQIDNO:9gatccatcgtcaccaatggtttccttcaagagaggaaaccattggtgacgattta55SEQIDNO:10agcttaaatcgtcaccaatggtttcctctcttgaaggaaaccattggtgacgatg55SEQIDNO:11gatccttcctccacctgaattggattcaagagatccaattcaggtggaggaatta55SEQIDNO:12agcttaattcctccacctgaattggatctcttgaatccaattcaggtggaggaag55SEQIDNO:13gatccgagatggcatttatgcacgttcaagagacgtgcataaatgccatctcttaSEqiDNO:14agcttaagagatggcatttatgcacgtctcttgaacgtgcataaatgccatctcgSEQIDNO:15gatcctccagaggataatccagtgttcaagagacactggattatcctctggattaSEQIDNO:16agcttaatccagaggataatccagtgtctcttgaacactggattatcctctggag權(quán)利要求1、一種豬Sirt1小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟1)、通過RACE技術(shù)克隆得到pSirt1全長cDNA序列；2)、根據(jù)載體的信息和靶序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)含9個(gè)核苷酸的loop環(huán)的siRNA引物，所述9個(gè)核苷酸為TTCAAGAGA；3)、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建siRNA引物退火后與雙酶切的RNAi載體連接轉(zhuǎn)化，得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟2)為根據(jù)步驟1)所得的pSirrtl全長基因序列，篩選并設(shè)計(jì)4對(duì)siRNA引物；所述4對(duì)siRNA引物分別為引物I:引物n:引物III:引物IV-3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟3)為將；Sz7e"cer4.J-CMVneo質(zhì)粒進(jìn)行5aw//1和歷wdIII雙酶切后，與siRNA弓|物退火后得到的DNA片段連接，采用熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟l)為設(shè)計(jì)并合成pSirtl的特異性引物PlP4，利用3'-RACE、5-RACE技術(shù)和pSirtl的特異性引物P1P4，克隆得到豬3'和5'端序列并對(duì)序列進(jìn)行測序鑒定；將Sirtl的5'和3'序列拼接得到pSirtl全長cDNA序列，將pSirtl全長cDNA序列登錄到GenBank，利用NCBI上的BLAST工具對(duì)pSirtl堿基序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；所述特異性引物P1P4是Pl:5'-GTTAGGAGGTGAATATGCCAAG-3';P2:5'-CACGAACACAAAAAGAGTTGGC-3';P3:5'隱AACTGGCATGTGAGGCTCTATC-3';P4:5'-CAGAAGGTTATCTCGGTACCCA-3'。5、根據(jù)權(quán)利要求14中任意一種豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是將步驟3)所得的RNAi表達(dá)載體進(jìn)行鑒定通過抗生素篩選，將陽性克隆采用PCR和測序鑒定；PCR反應(yīng)的引物為特異性上游引物和RNAi干擾載體的本身引物5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3';測序引物為5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3'。6、如權(quán)利要求l5中任意一種方法所得的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的用途，其特征是用于研究pSirtl基因?qū)χ敬x產(chǎn)生的影響。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的豬Sirtl小干擾RNA表達(dá)載體的用途，其特征是包括以下步驟(1)、將含pSirtl的siRNA表達(dá)載體的大腸桿菌擴(kuò)培后，提取高純轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒；(2)、將含pSirtl的siRNA表達(dá)載體的高純轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬脂肪細(xì)胞等細(xì)胞，37°C，5%的C02中保溫4~6h后更換不含抗生素的培養(yǎng)基；(3)、轉(zhuǎn)染48h后，分析siRNA表達(dá)載體對(duì)pSirtl及脂肪代謝關(guān)鍵功能基因ATGL、HSL、PPARY等表達(dá)的影響，研究Sirtl的功能。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬Sirt1小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)通過RACE技術(shù)克隆得到pSirt1全長cDNA序列；2)根據(jù)載體的信息和靶序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)含9個(gè)核苷酸的loop環(huán)的siRNA引物，所述9個(gè)核苷酸為TTCAAGAGA；3)RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建siRNA引物退火后與雙酶切的RNAi載體連接轉(zhuǎn)化，得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還公開了上述豬Sirt1小干擾RNA表達(dá)載體的用途用于研究pSirt1基因?qū)χ敬x產(chǎn)生的影響。文檔編號(hào)C12N15/63GK101353657SQ20081012073公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年9月2日優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日發(fā)明者婷伍,單體中,汪以真,佳郭,韓菲菲申請(qǐng)人:浙江大學(xué)