專利名稱：：運用復(fù)合pcr技術(shù)檢測蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明"運用復(fù)合PCR技術(shù)檢測蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的方法"，屬于農(nóng)作物病害防治和植物檢疫
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：盧筍作為一種食藥兼用的高檔蔬菜，不僅口味鮮美，還是當(dāng)今世界發(fā)現(xiàn)和公認(rèn)的防癌抗癌效果最好的植物，深受國內(nèi)外廣大消費者的喜愛。我國是世界上最大的蘆筍生產(chǎn)國和出口國，主要的蘆筍種植區(qū)分布在山東、江蘇、浙江、山西、福建、河北等省份，生產(chǎn)的蘆筍大部分用于出口。腐馬素是一組主要由串珠鐮刀菌(Fwrar/wwver"c////o/<sfey)和再育鐮刀菌(i^yan、wpra/^rartwO等鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的真菌毒素，具有分布廣，毒性強的特點。已成為繼黃曲霉素之后的又一個真菌毒素研究的新熱點?，F(xiàn)已鑒定到28種腐馬素類似物(HlywkaandBullerm叫1999)，它們被分為4組，即A、B、C和P組。其中，B組腐馬素是野生型菌株中產(chǎn)生量最為豐富的一組。目前已發(fā)現(xiàn)的腐馬素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4禾BFP1共11種，其中FBI是其主要組分，占75%以上，而且毒性最強。許多證據(jù)表明，腐馬素對某些牲畜有急性致命毒性及潛在的致癌性，如引起馬腦炎、豬肺水腫或大鼠肝癌等，為畜牧業(yè)帶來很大的損失。流行病學(xué)研究也認(rèn)為，食用腐馬素會引起人類食道癌和神經(jīng)管缺陷，嚴(yán)重威脅食品安全及人類和動物健康。在2003年，國際癌癥研究機構(gòu)(InternationalAgencyofResearchCancer,IARC)估測由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的腐馬素(FBI)為2B組，即可疑人類致癌物。目前，在許多國家如美國、意大利、德國、荷蘭、南非和澳大利亞等的戸筍產(chǎn)區(qū)，鐮刀菌侵染引起的病害己是蘆筍上的主要病害，并且己有研究報導(dǎo)了FB1，F(xiàn)B2在田間蘆筍上的發(fā)生，嚴(yán)重影響戸箅的產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量。而串珠鐮刀菌和再育鐮刀菌是戸筍中極為常見的病原真菌，發(fā)生非常普遍，并且通常情況下大部分植株在田間感染了致病菌之后無明顯癥狀，一些無明顯霉變癥狀的產(chǎn)品也可能有腐馬素污染。中國是世界上已經(jīng)確認(rèn)的食品中腐馬素的污染與食道癌的發(fā)生關(guān)系密切的兩個國家之一，因此控制蘆筍、玉米等食品中腐馬素的污染是當(dāng)務(wù)之急，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全領(lǐng)域都有非常重要的意義。較全面地了解主要產(chǎn)地中蘆筍上腐馬素產(chǎn)毒菌株污染情況，建立完善、快捷的腐馬素及其產(chǎn)毒株的檢測手段和監(jiān)控機制也勢在必行。只有這樣才能及時有效地發(fā)現(xiàn)和控制有關(guān)腐馬素的污染，及時采取措施，從而提高我國農(nóng)產(chǎn)品在國際市場上的質(zhì)量和信譽，保證國際貿(mào)易的順利進行，保護廣大農(nóng)民的切身利益。傳統(tǒng)的腐馬素產(chǎn)毒菌株的分類和鑒定方法主要為形態(tài)學(xué)方法，該法需要較高的專業(yè)素質(zhì)和經(jīng)驗并需要通過菌株分離，培養(yǎng)，純化，促進產(chǎn)孢等一系列過程，需時約30天，費時費力。在生產(chǎn)實際鑒定應(yīng)用和科研中，都有較大局限性。隨著對腐馬素研究的深入，其生物合成途徑巳基本闡明，使利用分子生物學(xué)方法對腐馬素產(chǎn)毒菌株分類和鑒定成為可能。目前分子檢測手段大多以分類學(xué)基因和腐馬素生物合成所必需的聚酮化合物合成酶基因FC/M/為基礎(chǔ)的，設(shè)計組特異性或?qū)偬禺愋砸镞M行PCR擴增檢測，耗時可縮短到2天。但是，由于分類學(xué)基因是基于鐮刀菌屬內(nèi)各個種的同源序列設(shè)計的，直接揭示菌株種類，而并不能直接揭示待測菌株的產(chǎn)毒性，很可能將未知的腐馬素產(chǎn)毒菌株排除在外。而目前擴增直接與腐馬素產(chǎn)毒機制相關(guān)基因的弓I物是基于巳知產(chǎn)毒菌株Fvw/ZdWo/tfes的^T/AW基因序列設(shè)計的，但腐馬素的合成是一個比較復(fù)雜的過程，多種基因的參與和調(diào)節(jié)，對于Ff/M/基因的單一檢測并不能完全保證結(jié)果的可靠性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，建立一種簡單、有效、快速的蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR檢測方法。本發(fā)明檢測方法，使用分別根據(jù)腐馬素生物合成所必須的聚酮化合物合成酶FMl//基因和絲氨酸-十六酰基轉(zhuǎn)移酶基因FC/MS設(shè)計的引物對rp32/rp33和rp679/rp680，并與鐮刀菌屬特異性引物ItsF/ItsR—起，通過實驗比較得到了特異性最佳的引物配組。在同一反應(yīng)體系中檢測腐馬素產(chǎn)毒菌株，是對僅根據(jù)分類學(xué)基因及F(/A^基因設(shè)計特異性引物檢測方法的補充和改進。檢測步驟為對待檢樣品進行菌株分離和純化；SDS法提取樣品模板DNA;經(jīng)復(fù)合PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照，最后經(jīng)過譜圖分析可得出檢測結(jié)果。本發(fā)明檢測方法不僅可以檢測到未知的腐馬素產(chǎn)毒菌株而且能同時鑒別所測菌株是否屬于鐮刀菌屬。同時，本方法采用復(fù)合PCR技術(shù)，多對引物在同一反應(yīng)體系中同時擴增，提高了檢測的準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測時間，可以試劑盒的形式在我國大規(guī)模推廣。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)第一步菌株的分離，純化將蘆筍樣品，經(jīng)清洗、切段、消毒、沖洗、無菌條件下，將樣品平鋪到PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；經(jīng)培養(yǎng)后將不同真菌分別接種到PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)；對純化了的菌株進行單孢分離，獲得單孢培養(yǎng)物，保存?zhèn)溆谩５诙礁牧嫉腟DS法提取樣品模板DNA樣品中DNA的提取方法采用改良的SDS提取法將菌株培養(yǎng)在50ml的液體酵母培養(yǎng)基中，27'C200rpm/min的振蕩條件下培養(yǎng)3-5天；用濾紙過濾，抽濾收集孢子，在液氮中磨成粉，將粉末收集在50ml的試管中；在試管中加入4mlDNA提取液(200mMTris-HClpH=8.5，250mMNaCl，25mMEDTApH=8.0，0.5%(W/V)SDS)并且渦旋使其充分混合；力口入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，渦旋振蕩，2500g離心15min;將上清液轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中，每支中加上清液90(^1，氯仿900W，13200rpm離心5min;將上層溶液轉(zhuǎn)移到新的2ml試管中，加入RNaseI(終濃度C^lOOpg/ml);37'C培養(yǎng)2-3h;加入等體積的冷的5M氯化鋰溶液，輕輕振蕩充分混合，在冰上再放置15min;4。C下13200rpm離心lOmin，然后將所有的上清液一起都放在一個50ml的試管中；加入2.5倍體積的100%乙醇，在水和乙醇的交界處形成一層DNA團，然后混合；4'C3000g離心20min，棄取上層清液；加20ml70。/。的冷乙醇，然后在4t:下過夜，讓雜質(zhì)溶解；4。C3C)00g離心20min，棄去上層清液；沉淀在空氣中干燥15min，然后加入300-400|il重蒸水,在4'C下溶解過夜；用移液器吸取溶液的辦法使其混勻，獲得樣品模板DNA。模板DNA母液貯存條件為-80°C;使用前稀釋成濃度為50ng/pl溶液，存放在-20"C條件下。第三步PCR引物設(shè)計使用分別根據(jù)聚酮化合物合成酶F[/M/基因、絲氨酸-十六?；D(zhuǎn)移酶基因F(7MS設(shè)計的引物對rp32/rp33和rp679/rp680和鐮刀菌屬特異性引物ItsF/ItsR,通過實驗比較得到了特異性最佳的引物配組。其引物序列如下rp32ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGGrp33GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACGrp679CGTAGTAGGAATGAGAAGGATGrp680GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTCItsFAACTCCCAAACCCCTGTGAACATAItsRTTTAACGGCGTGGCCGC其中rp32/rp33引物對在腐馬素產(chǎn)毒菌株中特異性擴增出680bp的產(chǎn)物，rp679/rp680引物對在腐馬素產(chǎn)毒菌株中特異性擴增出920bp的產(chǎn)物，ItsR/ItsF引物對在腐馬素產(chǎn)毒菌株中特異性擴增出431bp的產(chǎn)物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。每管10DU260，儲存液濃度25pmol/L，用滅菌雙蒸水配制。-20°0:保存?zhèn)溆?。第四步?fù)合PCR擴增反應(yīng)反應(yīng)體系總體積為25pl，反應(yīng)物包括2.5^1的10xPCR緩沖液，0.5^1的10MmdNTP，0.5^1的Taq酶，2^1的SDS法提取樣品模板DNA，1.2^1的引物卬32/rp33和rp679/rp680和ItsR/ItsF，其余以重蒸水補足。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性溫度94'C，時間5min;循環(huán)數(shù)33;變性溫度94'C，時間30s;退火溫度53'C，時間45s;延伸溫度72'C，時間lmin;終延伸溫度72'C，時間10min;保存在4。C。第五步檢測結(jié)果判定制備3.0n/。的瓊脂糖EB凝膠(含EB0.5嗎/ml)，取第三步擴增產(chǎn)物10pl點樣，同時以DL2000作為分子量對照，電壓設(shè)置80V(5V/cm)，電泳時間30到50min。電泳結(jié)束后，在紫外光下(波長258cm)，用自動凝膠成像系統(tǒng)觀察、掃描并儲存電泳結(jié)果。本發(fā)明用于檢測蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR方法，與國內(nèi)外現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢1)檢測準(zhǔn)確性高。本方法基于腐馬素生物合成所必須的聚酮化合物合成酶尸t/M7基因、絲氨酸-十六?；D(zhuǎn)移酶基因Ff/MS以及鐮刀菌屬特異性引物ItsF/ItsR，在同一反應(yīng)體系中同時檢測腐馬素產(chǎn)毒菌株。不僅能用于已知腐馬素產(chǎn)毒菌株的檢測，對未知的腐馬素產(chǎn)毒菌株也能檢測到。2)檢測效率高。本發(fā)明不僅能檢測腐馬素產(chǎn)毒菌株，而且可以同時鑒別該菌株是否屬于鐮刀菌屬，兩種檢測，一步完成。3)操作方便快捷。本發(fā)明采用復(fù)合PCR技術(shù)，多對引物在同一反應(yīng)體系中同時擴增。整個過程簡單、快速、高效。4)特異性強。本發(fā)明設(shè)計的三對引物可特異性檢測腐馬素產(chǎn)毒菌株，擴增時均無非特異性條帶。因此本發(fā)明方法實用性強，可滿足植物檢疫及食品安全檢測的需要。圖1是本發(fā)明的實施例1的實驗結(jié)果及引物對rp32/rp33，rp679/rp680及ItsR/ItsF復(fù)合PCR反應(yīng)特異性.其中以串珠鐮刀菌野生型為陽性對照，以桔青霉為陰性對照。M.DNALadder2000.A:1和17為串珠鐮刀菌野生型(WT)，2.ZJNB1-1,3.ZJNB2-1,4.ZJNB3-1,5.ZJNB4-1,6.ZJNB5-1,7.ZJFY1-1,8.ZJFY2-1，9.ZJFY3-1，10.ZJFY4-1,11.ZJFY5-1，12.Z乂02-1，13.2!:5陽1，14.2乂€6-1,15.桔青霉，16.無菌水，18.21乂<:1-1,19.2僅€3隱1，20.21乂€4-1.圖2rp32/rp33，rp679/rp680單對引物PCR的敏感性M.DNALadder2000.1-6,8-13孔為串珠鐮刀菌野生型的DNA，濃度為10ng，lng，100pg，10pg,lpg.500fg;7,14孔為無菌水對照.圖3引物rp32/rp33，rp679/rp680及ItsR/ItsF復(fù)合PCR的敏感性M.DNALadder2000.1-5孔為串珠鐮刀菌野生型的DNA,濃度為lOng，lng,lOOpg,lOpg,lpg.6孔為無菌水對照.圖4HPLC-ELSD法檢測FB!的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程LnC:FBi的物質(zhì)的量的自然對數(shù)；Lnpeakarea:峰面積的自然對數(shù)具體實施例方式實施例1在浙江地區(qū)蘆筍中分離菌株檢測腐馬素產(chǎn)毒菌株本實驗使用的蘆筍材料為食用莖，從浙江省內(nèi)各種植基地內(nèi)收集，共16份，其中，寧波5份，富陽5份，新昌6份。第一步菌株的分離、純化將蘆筍樣品清洗后切成2cm長小段，70n/。酒精消毒3min，10%次氯酸鈉消毒7min，然后用無菌水沖洗3次。無菌條件下，將樣品平鋪到PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養(yǎng)基上，封口膜封口。置于培養(yǎng)箱中25'C暗培養(yǎng)。統(tǒng)計每個樣品在PDA培養(yǎng)基上的菌落，觀察真菌的生長，4-5天后在顯微鏡下觀察真菌的性狀特征，分出不同的真菌，將其從菌落中挑出，各自接種到PDA培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)。一種真菌接種于一個培養(yǎng)皿內(nèi)。4-5天后，對純化了的菌株進行單孢分離。準(zhǔn)備3個倒有10inl無菌水的培養(yǎng)皿，用接種針挑取一小塊菌絲放入一個培養(yǎng)皿中，用"L"型玻棒攪勻，蘸取少許溶液(l-2滴)溶解在第二個培養(yǎng)皿中，同樣方法處理第三個培養(yǎng)皿，得到三個不同數(shù)量級濃度的孢子懸浮液。分別從三個不同孢子懸浮液中蘸取少許液體涂在PDA平板上，高濃度一個，中等濃度2個，低濃度3個。25'C暗培養(yǎng)，每隔12h觀察一次，若發(fā)現(xiàn)有菌落產(chǎn)生則用記號筆從培養(yǎng)皿的反面標(biāo)記，用解剖針連同培養(yǎng)基一起挑取到新的PDA平板中。即可獲得單孢培養(yǎng)物。純化后菌株于4'C保存?zhèn)溆?。如果需要長期保藏，則需要在PDA平板上培養(yǎng)幾周。然后，用石蠟封存或用無菌水洗孢子然后保存在15%的甘油中。第二步模板DNA提取1、將菌株培養(yǎng)在50ml的液體酵母培養(yǎng)基中，在27°C,200rpm/min的振蕩條件下培養(yǎng)3-5天。2、用Whatman濾紙過濾，抽濾收集孢子，在液氮中磨成粉，將粉末收集在50ml的試管中。3、在試管中加入4mlDNA提取液(200mMTris-HClpH=8.5，250mMNaCl，25mMEDTApH=8.0,0.5%(W/V)SDS)并且渦旋使其充分混合。4、加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，短時間渦旋振蕩，2500g離心15min。5、將上清液轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中，每支中加90(Hil，然后加900^1氯仿，13200rpm離心5min。6、將上層溶液轉(zhuǎn)移到新的2ml試管中，加入RNaseI(終濃度C2100ng/ml)。然后在37。C培養(yǎng)2-3h。7、將試管和5M氯化鋰溶液在冰上放置15min。8、往試管中加入等體積的冷的5M氯化鋰溶液，輕輕振蕩充分混合，在冰上再放置15min。9、4'C下13200rpm離心10min，然后將所有的上清液一起都放在一個50ml的試管中。10、加入2.5倍體積的100°/。乙醇，在水和乙醇的交界處形成一層DNA團，然后混合。11、4"C下3000g離心20min,小心地棄取上層清液。12、力n20ml70。/。的冷乙醇，然后在4。C下過夜，讓雜質(zhì)溶解。13、4。C下3000g離心20min,小心地棄去上層清液。14、沉淀在空氣中干燥15min，然后加入300-400pl重蒸水，在4。C下溶解過夜。15、用移液器吸取溶液的辦法使其混勻。模板DNA母液貯存在-80'C條件下。使用前稀釋成濃度為50ng&l溶液，存放在-20'C條件下。第三步引物合成使用引物rp32/rp33，rp679/rp680(Proctoretal.,2004)禾口IstF/IstR(Bluhmetal.,2002)(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。每管1ODU260，儲存液濃度25nmol/L，用滅菌雙蒸水配制。-20°C保存?zhèn)溆?。表l本發(fā)明中所設(shè)計的PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*Proctor，2004;**Bluhm，2002.第四步復(fù)合PCR擴增反應(yīng)復(fù)合PCR擴增反應(yīng)體系為反應(yīng)體系總體積為25pl，包括2.5^1的lOxPCR緩沖液，0.5pl的10MmdNTP，0.5^1的Taq酶，2^1第二步得到的模板DNA，1.2^1第三步中的引物，其中rp32和rp33各0.15iil，rp679和rp680各0.25pl，ItsF和ItsR各0.2(J。余以重蒸水補足。PCR反應(yīng)條件為1)預(yù)變性溫度94。C，時間5min;2)循環(huán)數(shù)33，變性溫度94'C，時間30s:退火溫度53'C，時間45s;延伸溫度72。C，時間lmin;3)終延伸溫度72。C，時間10min;4)保存在4"C。第五步檢測結(jié)果判定以制備3.0%的瓊脂糖EB凝膠(含EB0.5叫/ml)，取第四步擴增產(chǎn)物10pl點樣，同時以DL2000作為分子量對照，電壓設(shè)置80V(5V/cm)，電泳時間30到50min。電泳結(jié)束后，在紫外光下(波長258cm)，用自動凝膠成像系統(tǒng)觀察、掃描并儲存電泳結(jié)果。實施結(jié)果在所有的16份材料中分離菌株到16個，其中ZJNB3-1，ZJNB4-1，ZJNB5-1，ZJFY1-1，ZJFY2-1，ZJFY3陽1，ZJFY4-1，ZJXC1-1，ZJXC3-1，ZJXC4-1這10個菌株分別產(chǎn)生約920bp(912-939bp)，680bp(670-684bp),431bp的預(yù)期片段，這10個菌株與陽性對照野生型串珠鐮刀菌產(chǎn)毒株P(guān)CR擴增結(jié)果相一致，F(xiàn)UM1，F(xiàn)UM8，ITS基因陽性，為腐馬素產(chǎn)毒菌株。菌株ZJNB1-1，ZJNB2-1，ZJFY5-1，ZJXC2-1，ZJXC5-1,ZJXC6-1這6個菌株只擴增出ITS條帶，說明這些菌株可能是無產(chǎn)毒基因的鐮刀菌菌株。陰性對照無條帶擴增(圖1，表2)。證明引物對rp32/rp33，rp679/rp680，ItsR/ItsF復(fù)合PCR反應(yīng)檢測串珠鐮刀菌腐馬素產(chǎn)毒菌株的特異性良好。并且分離菌株的復(fù)合PCR檢測結(jié)果與單對引物PCR結(jié)果一致，也證明了本發(fā)明復(fù)合PCR方法的特異性和可靠性(表2)。表2蘆筍上分離菌株單對引物PCR和復(fù)合PCR檢測結(jié)果.編號產(chǎn)地菌株單對引物PCR復(fù)合PCRITS尸腺/ITS1浙江寧波ZJNB1-1—.—+—_2ZJNB2-1一——+—+3Z厠3陽l+++++4ZJNB4-1++++++Z膽5-1++++++6浙江富陽ZJFY1-1++++++ZJFY2-1++++++8ZJFY3-1++++++9ZJFY4-1++++++10ZJFY5-1一—+—一■11浙江新昌ZJXCl國l++++++12ZJXC2-1——+一一+13ZJXC3-1++++++14ZJXC4-1++++++15ZJXC5隱1——+一一+16ZJXC6-1——+一+實施例2:本發(fā)明所設(shè)計的引物檢測腐馬素產(chǎn)毒菌株靈敏度及最小檢出限的測定第一步引物合成操作步驟同實施例1第三步。第二步模板DNA稀釋以無菌水稀釋串珠鐮刀菌野生型染色體DNA濃度為10ng，lng，100pg，10pg，1pg，第三步復(fù)合PCR擴增把第二步稀釋的模板DNA直接加入到實施例1第四步中的PCR反應(yīng)體系中進行復(fù)合PCR擴增。第四步檢測結(jié)果判定同實施例1第五步。實施結(jié)果測得引物對rp32/rp33，rp679/rp680的檢出限均為為10pg(圖2)，未加DNA的水對照結(jié)果為陰性，復(fù)合PCR檢出限為100pg(圖3)。實施例3:離體條件下分離菌株的產(chǎn)毒力檢測本實驗所使用的菌株材料均為前期實驗從各地收集的蘆等樣品上分離的菌株。第一步菌株孢子懸浮液制備取15mlGYP液體培養(yǎng)基(葡萄糖-蛋白胨-酵母提取物)，加入到50ml的三角瓶中，用接種環(huán)從保存的野生型串珠鐮刀菌(fveW/d"^'J^)或供試菌株的試管中挑出少量菌體放入三角瓶，放在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中200rpm/min，27'C，培養(yǎng)40-48h。取2ml培養(yǎng)液加入到2ml離心管中12000rpm/min離心10min，小心棄去上層液體，加入1ml無菌水，12000rpm/min離心10min，棄去上層清液，再加入lml無菌水，12000rpm/min，10min，倒掉上層清液，重復(fù)兩次。將下層沉淀溶解在lml無菌水中，制成孢子懸浮液，通過鏡檢，用無菌水稀釋成需要的濃度。第二步產(chǎn)毒培養(yǎng)將上述制備的菌懸液(大約8xl07個野生型菌株的孢子)接種CMK(5g)培養(yǎng)基。充分搖勻，置28'C培養(yǎng)2周，每3-5天搖勻一次以便于培養(yǎng)物的發(fā)散。然后置4t冰箱l周，再置于28'C培養(yǎng)1周。表現(xiàn)為三角瓶中充滿了白色菌絲。然后以流動蒸汽熏蒸殺菌(100。C,30min)。獲后的培養(yǎng)物經(jīng)粉碎機粉碎后，用冷凍干燥機凍干，密封包裝，于-2(TC下保存，待測。空白對照的處理同上。第三步樣品前處理準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)物凍干粉10g，放入100ml的三角瓶中，加入25ml乙腈/水(1:1,v/v)，搖床振蕩過夜(150rpm，25°C)，用Whatman濾紙真空抽濾，將濾出液(10ml)加入到一個放有300mg已經(jīng)被甲醇活化5小時的離子交換樹脂XAD-4的離心管中。然后先用去離子水，再用4ml100^甲醇清洗XAD-4樹脂，毒素會被100%甲醇洗脫下來，洗脫液置于-65'C下冷凍真空干燥，然后溶解在400nl水中。溶液用0.2tmi注射過濾器過濾，然后取濾液IO^d直接用于HPLC-ELSD檢測。第四步HPLC-ELSD法測定腐馬素測定腐馬素組分與含量的方法是在Bojja等(2004)報導(dǎo)的程序基礎(chǔ)上做出修改而建立的HPLC-ELSD方法。HPLC流動相A:水/三氟乙酸(trifluoroaceticacid，TFA)(100:0.025v/v)，B:乙腈/TFA(100:0.025，v/v)，按0-5min(0-20%B,100-80%A)，5-10min(20%-40%B,80-60%A)，10-15min(40-80%B,60-20%A)，15-20min(80%B,20%A),20-25min(80-0%B,20-100%A)線性梯度條件。流速是1.0ml/min。ELSD(ELSD2000,Alltech,USA)的條件設(shè)置是蒸發(fā)光檢測器溫度45"C，氮氣流流速=2.0L/min，靈敏度值為1，撞擊器開，在該條件下，信噪比最佳。在定量分析中，用于HPLC-ELSD分析的FB2、FB3、FB4標(biāo)準(zhǔn)溶液(1ngVl)進樣量為10pl，F(xiàn)Bl標(biāo)準(zhǔn)溶液(10pg4U)用上述相同的方法稀釋成4種不同的濃度:25ng4tl，50ng/^il,100ng4d。每種濃度重復(fù)分析三次。根據(jù)峰面積的自然對數(shù)與FB1物質(zhì)的量的自然對數(shù)對應(yīng)關(guān)系得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及每樣品的峰面積計算樣品中腐馬素的濃度。實施結(jié)果浙江省內(nèi)蘆筍樣品上分離的10個菌株均能在離體條件下產(chǎn)生FB1(125-19251jig/g平均值7450.96Ug/g)。某些菌株能產(chǎn)生FB2，F(xiàn)B3和FB4中的一種或多種。產(chǎn)生FB2為14-2171pg/g(平均值671.21ng/g)，產(chǎn)生FB3為74-460pg/g(平均值247.75ng/g)，產(chǎn)生FB4為79-2715Hg/g(平均值698.03ng/g)。10個菌株中有4個(40%)能檢測到全部FB1，F(xiàn)B2，F(xiàn)B3和FB4，5個菌株(50%)能檢測到FBl,FB2禾口FB4，僅1個菌株只能檢測到FBI和FB2(表3)。產(chǎn)毒力測定結(jié)果與實施例l中復(fù)合PCR結(jié)果一致，證明了本發(fā)明檢測戸筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株復(fù)合PCR實驗方法的可靠性。表3蘆筍上分離菌株腐馬素產(chǎn)毒力的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1、一種運用復(fù)合PCR技術(shù)檢測蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的方法，其特征在于使用分別根據(jù)腐馬素生物合成所必須的聚酮化合物合成酶FUM1基因和絲氨酸-十六酰基轉(zhuǎn)移酶基因FUM8設(shè)計的引物對rp32/rp33和rp679/rp680和鐮刀菌屬特異性引物ItsF/ItsR，通過實驗比較得到了特異性最佳的引物配組；在同一反應(yīng)體系中同時檢測腐馬素產(chǎn)毒菌株；其檢測步驟為對待檢樣品進行菌株分離和純化；SDS法提取樣品模板DNA；復(fù)合PCR反應(yīng)；經(jīng)電泳、染色、漂洗，用自動凝膠成像系統(tǒng)觀察、掃描并儲存電泳結(jié)果，最后經(jīng)過譜圖分析，得出檢測結(jié)果。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于所述菌株的分離和純化的操作步驟為蘆筍樣品清洗后切成2cm長小段，70%酒精消毒3min，10%次氯酸鈉消毒7min，然后用無菌水沖洗3次；無菌條件下，將樣品平鋪到PDA培養(yǎng)基上，封口膜封口；置于培養(yǎng)箱中25。C暗培養(yǎng)，統(tǒng)計每個樣品在PDA培養(yǎng)基上的菌落，觀察真菌的生長，4-5天后在顯微鏡下觀察真菌的性狀特征，分出不同的真菌，將其從菌落中挑出，各自接種到PDA培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)；一種真菌接種于一個培養(yǎng)皿內(nèi)，4-5天后，對純化了的菌株進行單孢分離，準(zhǔn)備3個倒有10ml無菌水的培養(yǎng)皿，用接種針挑取一小塊菌絲放入一個培養(yǎng)皿中，用"L"型玻棒攪勻，蘸取少許溶液溶解在第二個培養(yǎng)皿中，同樣方法處理第三個培養(yǎng)皿，得到三個不同數(shù)量級濃度的孢子懸浮液；分別從三個不同孢子懸浮液中蘸取少許液體涂在PDA平板上，高濃度一個，中等濃度2個，低濃度3個；25。C暗培養(yǎng)，每隔12h觀察一次，若發(fā)現(xiàn)有菌落產(chǎn)生則用記號筆從培養(yǎng)皿的反面標(biāo)記，用解剖針連同培養(yǎng)基一起挑取到新的PDA平板中；獲得單孢培養(yǎng)物，純化后菌株于4'C保存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于所述SDS法提取樣品模板DNA，其操作步驟為-1)將菌株培養(yǎng)在50ml的液體酵母培養(yǎng)基中，在27°C，200rpm/min的振蕩條件下，培養(yǎng)3-5天；2)用Whatman濾紙過濾，抽濾收集孢子，在液氮中磨成粉，將粉末收集在50ml的試管中；3)在試管中加入4mlDNA提取液并且渦旋使其充分混合；4)加入2ml的苯酚和1.5ml氯仿，短時間渦旋振蕩，2500g離心15min;5)將上清液轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中，每支中加900ul，然后加900ul氯仿，13200rpm離心5min:6)將上層溶液轉(zhuǎn)移到新的2ml試管中，力n入RNasel終濃度C^100ng/ml，然后在37。C培養(yǎng)2-3h;7)將試管和5M氯化鋰溶液在冰上放置15min;8)往試管中加入等體積的冷的5M氯化鋰溶液，輕輕振蕩充分混合，在冰上再放置15min;9)4。C下13200rpm離心10min，然后將所有的上清液一起都放在50ml的試管中；10)加入2.5倍體積的100%乙醇，在水和乙醇的交界處形成一層DNA團，然后混合；11)4'C下3000g離心20min，棄取上層清液；12)加20ml70。/。的冷乙醇，然后在4。C下過夜，讓雜質(zhì)溶解；13)4。C下3000g離心20min，棄去上層清液；14)沉淀在空氣中干燥15min，然后加入300-40(^1重蒸水，在4'C下溶解過夜；15)用移液器吸取溶液的辦法使其混勻，獲得樣品模板DNA。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于復(fù)合PCR反應(yīng)所用引物rp32/rp33和rp679/rp680和ItsR/ItsF序列如下rp32ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGGrp33GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACGrp679CGTAGTAGGAATGAGAAGGATGrp680GCAAGCTTTGTGGCTGATTGTCItsFAACTCCCAAACCCCTGTGAACATAItsRTTTAACGGCGTGGCCGC其中rp32/rp33引物對在腐馬素產(chǎn)毒菌株中特異性擴增出680bp的產(chǎn)物，rp679/rp680引物對在腐馬素產(chǎn)毒菌株中特異性擴增出920bp的產(chǎn)物，ItsR/ItsF引物對在腐馬素產(chǎn)毒菌株中特異性擴增出431bp的產(chǎn)物。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于所述復(fù)合PCR反應(yīng)體系為反應(yīng)體系總體積為25^1，反應(yīng)物包括2.5^1的10xPCR緩沖液，0.5pl的10MmdNTP，0.5^1的Taq酶，2^1的SDS法提取樣品模板DNA，1.2pl的引物rp32/rp33和rp679/rp680和ItsR/ItsF，其余以重蒸水補足。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于1.2nl的引物中rp32和rp33各0.15ixl，rp679和rp680各0.25|il，ItsF和ItsR各0.2|xl。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR檢測方法，其特征在于所述復(fù)合PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性溫度94t:，時間5min;循環(huán)數(shù)33，變性溫度94T:，時間30s;退火溫度53。C，時間45s;延伸溫度72。C，時間lmin;終延伸溫度72。C，時間10min;保存溫度4'C。全文摘要一種運用復(fù)合PCR技術(shù)檢測蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的方法，使用分別根據(jù)腐馬素生物合成所必須的聚酮化合物合成酶FUM1基因和絲氨酸-十六?；D(zhuǎn)移酶基因FUM8設(shè)計的引物對rp32/rp33和rp679/rp680和鐮刀菌屬特異性引物ItsF/ItsR。在同一反應(yīng)體系中同時檢測腐馬素產(chǎn)毒菌株，不僅可以檢測到未知的腐馬素產(chǎn)毒菌株，而且能同時鑒別所測菌株是否屬于鐮刀菌屬。采用復(fù)合PCR技術(shù)，多對引物在同一反應(yīng)體系中同時擴增，提高了檢測的準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測時間，是一種簡單、有效、快速的蘆筍中腐馬素產(chǎn)毒菌株的復(fù)合PCR檢測方法?？梢栽噭┖械男问酱笠?guī)模推廣。文檔編號C12Q1/68GK101418338SQ200810120758公開日2009年4月29日申請日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日發(fā)明者瑩周,杜良成,汪俏梅,王建升,佳魏申請人:浙江大學(xué)