專利名稱：：普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)基及組培快繁方法普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)M組培快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種組織培養(yǎng)基及組培快繁方法，是針對(duì)瀕臨滅絕的喬木普陀鵝耳櫪的芽體培養(yǎng)基及組培快繁方法。
背景技術(shù)：
：普陀鵝耳櫪(Car/7/'/7z^;7"&e/w/s)，隸屬于鵝耳櫪屬Car;;//"",樺木科"Wz;/aceae。普陀鵝耳櫪是我國(guó)特有的珍稀樹種，其分布范圍極為狹窄，僅見于浙江舟山群島，是我國(guó)io種幾近滅絕的樹種之一。由于該樹萌芽性差、花粉壽命短，花粉活力于七曰內(nèi)遞降敗育、種子發(fā)芽率低，，受生態(tài)和人為破壞等因素而導(dǎo)致瀕臨滅絕。4艮據(jù)調(diào)查資料，野生狀態(tài)下的普陀鵝耳櫪現(xiàn)在僅在普陀山殘存l林。鑒于此，普陀鵝耳櫪的物種保護(hù)引起植物學(xué)研究機(jī)構(gòu)的重視。目前經(jīng)過多年的育苗、造林試驗(yàn)，采用播種、扦插、，等方法培育苗木379株，速度過慢，滿足不了快速恢復(fù)這一稀有物種的迫切需求，探索與嘗試用組培快繁方法擴(kuò)大該樹的栽種量，有其積極的現(xiàn)實(shí)意義，然而，經(jīng)檢索和調(diào)查，至今尚無人涉足，未見對(duì)該樹種通過生物技術(shù)組培快繁方法育苗的有關(guān)資料報(bào)道和實(shí)物問世。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是用普陀鵝耳櫪芽體為外植體，配制一種有效的組織培養(yǎng)基，提供整套普陀鵝耳櫪組培快繁方法。解決上述問題的技術(shù)方案是提供普陀鵝耳櫪組織培養(yǎng)基，由下列成份及配比而成，0-l/3MS鹽類(即需用MS鹽類的則用其1/3重量的大量元素鹽和全額的微量元素鹽)或0-60mg/L的IBA即吲哚丁酸、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖，分別配制成芽體成活生長(zhǎng)培養(yǎng)基、一階段生根培養(yǎng)基和二階段生根培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的pH值均為5.0—6.0。由1/3MS鹽類、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖配制成普陀鵝耳櫪芽體成活生長(zhǎng)培養(yǎng)基。由40-60mg/L的IBA、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5°y4-4.5%的蔗糖配制成普陀鵝耳櫪一階段生根培養(yǎng)基。由1/3MS鹽類、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖配制成普陀鵝耳櫪二階段生4M^養(yǎng)基。用上述培養(yǎng)M本普陀鵝耳櫪進(jìn)行組培快繁的方法包括如下步驟(1)外植體的采集與消毒對(duì)兩年生樹苗進(jìn)行噴藥殺菌、殺蟲處理1-2周后，采集其芽體帶回實(shí)驗(yàn)室，自來水沖洗2小時(shí)，在稀釋10倍的5。/。NaCI0溶液中，真空條件下浸泡10min，用無菌水沖洗5-6次，再在相同濃度的NaCI0溶液中浸泡4-5秒，無菌水沖洗5次后，顯^L鏡下切取長(zhǎng)0.5-lcm的芽尖組織；(2)無菌芽培養(yǎng)將切得的芽尖接種于由1/3MS鹽類、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖制成的芽體成活生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，pH值5.0-6.0，在25士2X:、光照強(qiáng)度2500Lux、16h/d光照下培養(yǎng)，兩周后新葉萌發(fā)，培育出普陀鵝耳栃無菌芽；(3)兩段式誘導(dǎo)生根將該無菌芽接種到一階段生根培養(yǎng)基中，即由40-60mg/LIBA、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖配制成的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4-7天后，移植到二階段生根培養(yǎng)基中，即由1/3MS鹽類、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖配制成的培養(yǎng)基中，pH值5,0-6.0,在25土21C、光照強(qiáng)度3700Lux、16h/d光照下培養(yǎng)，10-14天后開始生成根；(4)馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室，光照強(qiáng)度20000Lux，馴化l-2周，將苗從試管取出，用溫水沖洗苗根部培養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比為絰石珍珠巖泥炭=1:1:1混合而成的盆裝人工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，每隔3天將袋子剪一小口，9-12d去袋移至溫室即成。本發(fā)明的有益效果是首創(chuàng)了普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)基及組培快繁方法，為進(jìn)一步探索普陀鵝耳櫪的基因工程、拓寬外植體材料等奠定了基礎(chǔ)。另一方面，彌補(bǔ)了該樹萌芽性差、花粉壽命短和發(fā)芽率低，有效授粉期不足的繁殖生理缺陷，為該樹提供了繁殖及^M!"的技術(shù)措施，拯救了幾乎滅絕的普陀鵝耳櫪物種資源。具體實(shí)施方式本發(fā)明下面結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明MS鹽類、MT維生素，可市售獲得，按商品說明書所示常規(guī)方法配用，為行業(yè)所通用。M本發(fā)明中所用的MS，只用其l/3重量的大量元素鹽和全量的微量元素鹽，為簡(jiǎn)明起見，用1/3MS鹽類表示。本發(fā)明在不同培育階段分別應(yīng)用的芽體成活生長(zhǎng)培養(yǎng)基中不含有IBA，一階段生根培養(yǎng)基中不含有1/3MS鹽類，二階段生根培養(yǎng)基中不含IBA,這一方面是因?yàn)槿齻€(gè)階段是連續(xù)進(jìn)行的，前一階段采用的1/3MS鹽類或IBA,對(duì)組培體尚存效果，后一階段可不用。二方面是經(jīng)過反復(fù)多次的對(duì)比試驗(yàn)，后階段不重復(fù)用對(duì)組培體的生長(zhǎng)更有利，而且還節(jié)省成本，因此作上述選定。凝固劑中水晶洋菜比瓊脂純凈，因而透明易觀察，價(jià)廉，故選前者。糖類營(yíng)養(yǎng)劑選蔗糖是因其成本低。這是同行技術(shù)人員明白的，故在實(shí)施例中未列入瓊脂及其它糖類營(yíng)養(yǎng)劑。三個(gè)階段的培養(yǎng)基中需要用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IBA的，加入的合適量是40-60mg/L,最佳是50mg/L;肌醇的加入合適量50-150mg/L，最佳量100mg/L;水晶洋菜的加入合適量占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%，最佳量O.25%,蔗糖的加入合適量占培養(yǎng)基總重量的(為簡(jiǎn){^見，以下不再說明，只給出百分?jǐn)?shù))1.5%-4.5%，最佳量3%;培養(yǎng)基的pH值5.0—6.0，最佳值為5.7?，F(xiàn)將三種培養(yǎng)基的四個(gè)實(shí)施例的原料與配比值列于表中:<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>參照上表，以最佳方案的實(shí)施例1分步驟來說明本發(fā)明(1)外植體的采集與消毒采對(duì)溫室盆栽兩年生樹苗進(jìn)行噴藥殺菌、殺蟲處理l-2周后，采集其芽體帶回實(shí)驗(yàn)室，自來水沖洗2小時(shí)，在稀釋10倍的5WaCI0溶液中，真空條件下滅菌10min，用無菌水沖洗5-6次，再在相同濃度的NaCIO溶液中浸泡4-5秒，無菌水沖洗5次后，顯微鏡下切取長(zhǎng)0,5-lcm的芽尖組織；(2)無菌芽培養(yǎng)將切得的芽尖接種于由1/3MS鹽類、MT維生素、100mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.25%的水晶洋菜和3%的蔗糖配制成的芽體成活生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，pH值為5.7,在25±2*C、光照強(qiáng)度2500Lux、16h/d光照下培養(yǎng)，兩周后新葉萌發(fā)，培育出普陀鵝耳櫪無菌芽；(3)兩段式誘導(dǎo)生根將該無菌芽接種到一階段生根培養(yǎng)基中，即由50mg/LIBA、MT維生素、100mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.25%的水晶洋菜和3%的蔗糖配制成的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4-7天后，移植到二階段生根培養(yǎng)基，即由1/3MS鹽類、MT維生素100mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.25%的水晶洋菜和3%的蔗糖配制成的培養(yǎng)基中，pH值5.7,在25土2X:、光照強(qiáng)度"00Lux、16h/d光照下培養(yǎng)，10-14天后開始生成才艮；(4)馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室，光照強(qiáng)度20000Lux,馴化l-2周，將苗從試管取出，用溫水沖洗苗4艮部培養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比為蛭石珍珠巖泥炭-l:1:1混合而成的盆裝人工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，每隔3天將袋子剪一小口，9-12d去袋移至溫室即成。其余實(shí)施例2-4參照表中相應(yīng)原料及配比值，與實(shí)施列1相同步驟，均能分化、誘導(dǎo)、快繁出普陀鵝耳櫪樹苗，只是分化率、生根率、壯弱程度上的差異。權(quán)利要求1、一種普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)基，由下列成份及配比而成，MS鹽類、MT維生素，其特征是需取用MS的則用其1/3重量的大量元素鹽和全額的微量元素鹽即1/3MS鹽類或0-60mg/L的IBA即吲哚丁酸、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2％-0.4％的水晶洋菜和1.5％-4.5％的蔗糖，分別配制成芽體成活生長(zhǎng)培養(yǎng)基、一階段生根培養(yǎng)基和二階段生根培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的pH值均為5.0-6.0。2、如權(quán)利要求1所述的普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)基，其特征是由1/3MS鹽類、MT維生素、100mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.25%的水晶洋菜和3。/。的蔗糖配制成普陀鵝耳櫪芽體成活生長(zhǎng)培養(yǎng)基。3、如權(quán)利要求1所述的普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)基，其特征是由40-60mg/L的IBA、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖配制成普陀鵝耳櫪一階段生糾養(yǎng)基。4、如權(quán)利要求1所述的普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)基，其特征是由1/3MS鹽類、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖配制成普陀鵝耳櫪二階段生根培養(yǎng)基。5、一種用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)基進(jìn)行組培快繁的方法，其特征是經(jīng)過下列步驟(1)外植體的采集與消毒對(duì)兩年生樹苗進(jìn)行噴藥殺菌、殺蟲處理l-2周后，采集其芽體帶回實(shí)驗(yàn)室，自來水沖洗2小時(shí)，在稀釋10倍的5'/。NaCI0溶液中，真空條件下浸泡10min,用無菌水沖洗5-6次，再在相同濃度的NaCIO溶液中浸泡4-5秒，無菌水沖洗5次后，顯孩￡鏡下切取長(zhǎng)0.5-lcm的芽尖組織；(2)無菌芽培養(yǎng)將切得的芽尖接種于由1/3MS鹽類、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量O.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖配制成的芽體成活生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，pH值5,0-6.0,在25土2"C、光照強(qiáng)度2500Lux、16h/d光照下培養(yǎng)，兩周后新葉萌發(fā)，培育普陀鵝耳栃無菌芽；(3)兩段式誘導(dǎo)生根將該無菌芽接種到一階段生根培養(yǎng)基中，即由40-60mg/LIBA、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5%的蔗糖配制成的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4-7天后，移植到二階段生根培養(yǎng)基，即由1/3MS鹽類、MT維生素、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2%-0.4%的水晶洋菜和1.5%-4.5J4的蔗糖配制成的培養(yǎng)基中，pH值5.0-6.0,在25土21C、光照強(qiáng)度3700Lux、16h/d光照下培養(yǎng)，10-14天后開始生成才艮；(4)馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室，光照強(qiáng)度20000Lux，馴化l-2周，將苗從試管取出，用溫水沖洗苗根部培養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比為蛭石珍珠巖泥炭=1:1:1混合而成的盆裝人工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，每隔3天將袋子剪一小口，9-12d去袋移至溫室即成。全文摘要一種普陀鵝耳櫪芽體培養(yǎng)基由1/3MS鹽類、MT維生素、0-60mg/l的IBA即吲哚丁酸、50-150mg/l的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2％-0.4％的水晶洋菜和1.5％-4.5％的蔗糖配制而成，能有效培養(yǎng)無菌試管芽和誘導(dǎo)生根，快速培育、大量繁殖出再生苗。用本組織培養(yǎng)基組培快繁普陀鵝耳櫪經(jīng)過下列四個(gè)步驟一是外植體的采集與消毒，二是無菌芽的培養(yǎng)，三是二段化誘導(dǎo)生根，四是馴化移栽。首創(chuàng)了用芽體作外植體組培快繁普陀鵝耳櫪樹苗的方法，克服了該樹萌芽性差、花粉壽命短和發(fā)芽率低，有效授粉期不足的生理缺陷，為該樹提供了繁殖及保存的生物工程技術(shù)措施，拯救了幾乎滅絕的普陀鵝耳櫪物種資源。文檔編號(hào)C12N5/04GK101402936SQ20081012161公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年10月14日優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日公開號(hào)200810121614.X發(fā)明者俞慈英,張翠萍,李修鵬,林新春,黃麗春申請(qǐng)人:浙江林學(xué)院