專利名稱：普陀鵝耳櫪種胚培養(yǎng)基及組培快繁方法
普陀鵝耳櫪種胚培養(yǎng)基及組培快繁方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物組織的培養(yǎng)基和組培快繁方法。背景技術(shù)：
普陀鵝耳櫪("/^/""s /7"foe/7s/y )，隸屬于鵝耳櫪屬 Cai^'加^:，樺木科"e"7aceae。普陀鵝耳櫪是我國特有的珍稀 樹種，其分布范圍極為狹窄，僅見于浙江舟山群島，是我國io種 幾近滅絕樹種之一。由于該樹萌芽性差、花粉壽命短，花粉活力 于七日內(nèi)遞降敗育和種子發(fā)芽率低，，受生態(tài)和人為破壞等因素 而導(dǎo)致瀕臨滅絕。才艮據(jù)調(diào)查資料，野生狀態(tài)下的普陀鵝耳櫪現(xiàn)在 僅在普陀山殘存1抹。鑒于此，普陀鵝耳櫪的物種保護引起植物 學(xué)研究機構(gòu)的重視。目前經(jīng)過多年的育苗、造林試驗，采用播種、 扦插、嫁接等方法培育苗木379抹，速度過慢，滿足不了快速恢 復(fù)這一稀有物種的迫切需求，探索與嘗試用組培快繁方法擴大該 樹的栽種量，有其積極的現(xiàn)實意義，然而，經(jīng)檢索和調(diào)查，至今 尚無人涉足，未見對該樹種通過生物技術(shù)組培快繁方法育苗的有 關(guān)資料報道和實物問世。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是用普陀鵝耳櫪種胚為外植體，配 制一種有效的組織培養(yǎng)基，提供整套普陀鵝耳櫪組培快繁方法。 解決上述問題的技術(shù)方案是提供的普陀鵝耳櫪組織培養(yǎng)基，WPM鹽類、MT維生素、0. 001-0. lmg/L的BA即節(jié)^J^腺噪呤、50-150mg/L的肌醇、占 培養(yǎng)基總重量0. 2%-0. 4%的水晶洋菜和1. 5%-4. 5%的蔗糖，培養(yǎng) 基的pH值5. 0_6. 0。用上述培養(yǎng)基，對本普陀鵝耳櫪進行組培快繁的方法包括如 下步驟l)外植體的采集與選擇要求種子的長度5-6毫米，種胚 的長度O. 8-1. 2mm，發(fā)育成熟的種子；(2)種子的洗凈、滅菌與取種胚將成熟種子沖水四個小 時并用蒸餾水清洗干凈后，放入1%次氯酸鈉的溶液中真空抽濾 滅菌10min，然后無菌水沖洗5次，在無菌操作臺上，利用解剖顯微鏡用剪刀及小鑷子剝?nèi)シN殼并用刀尖挑取種胚；(3 )接種與培養(yǎng)將切得的普陀鵝耳櫪種胚接種到WPM鹽 類、MT維生素、0. 001-0. lmg/L的BA即節(jié)氛基腺嘌呤、50-150mg/L 的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0. 2%-0. 4%的水晶洋菜和1. 5%-4. 5%的 蔗糖種胚培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16h/d、光照 強度2500Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25 ± 21C中繼續(xù)培養(yǎng)26d， 共28d，便出現(xiàn)新綠色的生有根的試管苗；(4) 繼代與誘導(dǎo)生根將該生根的試管苗去根進行繼代培 養(yǎng)，每4周繼代一次，經(jīng)1-2次繼代，即可誘導(dǎo)植林生根；(5) 馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室、光照強度 20000Lux、馴化l-2周，將苗從試管取出，用溫水沖洗苗根部培 養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比為蛭石珍珠巖泥炭=1: 1: 1混合而成的盆裝人工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，每 隔3天將袋子剪一小口 ， 9-12d去袋移至溫室即成。本發(fā)明的有益效果是首創(chuàng)了普陀鵝耳櫪用種胚作外植體組培快繁的整套方法，提供了普陀鵝耳櫪種胚育苗的優(yōu)良培養(yǎng)基， 為進一步探索普陀鵝耳櫪的基因工程、拓寬外植體材料等奠定了 基礎(chǔ)。另一方面，彌補了該樹萌芽性差、花粉壽命短和發(fā)芽率低， 有效授粉期不足的繁殖生理缺陷，拯救了幾乎滅絕的普陀鵝耳櫪 物種資源。
具體實施方式本發(fā)明下面結(jié)合實施例予以闡明WPM鹽類、MT維生素均 可市售獲得，按商品說明書所示常規(guī)方法配用，為行業(yè)所通用。 BA的合適加入量為0. 001-0.1 mg/L,最佳量0. 01 mg/L;肌醇 的加入合適量50-150 mg/L，最佳量100mg/L;水晶洋菜的加入 合適量占培養(yǎng)基總重量0. 2%-0. 4%，最佳量0. 25%,蔗糖的加入 合適量占培養(yǎng)基總重量的1.5%-4. 5%，最佳量3%;培養(yǎng)基的pH 值5. 0—6. 0,最佳值5.7。下面將實施例1-7列表表示于下原料1234567WPM鹽類常規(guī)方法配成MT維生素常規(guī)方法配成BA 0. 001-0. 1 (mg/L)0. 010. 0010.10. 050. 0050.10. 001肌醇50-150 (mg/L)100501501207050150水晶洋菜0.2-0.4 (%)0.250. 20.40. 30.230.40. 2蔗糖1.5-4. 5 (%)31.54. 52. 51. 81. 54.5PH 5.0-6.05. 75. 06. 05. 35. 66. 05. 0下面用最佳方案的實施例1 (對照表中實施例l對應(yīng)的原料及配比值)，分步驟說明本發(fā)明l)外植體的采集與選擇要求種子的長度5-6毫米，種胚的長度0.8-1. 2mm，發(fā)育成熟的種子；(2)種子的洗凈、滅菌與取種胚將成熟種子沖水四個小 時并用蒸餾水清洗干凈后，放入1%次氯酸鈉的溶液中真空抽濾 滅菌10min，然后無菌水沖洗5次，在無菌操作臺上，利用解剖 顯微鏡用剪刀及小鑷子剝?nèi)シN殼并用刀尖挑取種胚；(3 )接種與培養(yǎng)將切得的普陀鵝耳櫪種胚接種到WPM鹽 類、MT維生素、0. 01mg/L的BA即節(jié)M腺嘌呤、100mg/L的肌 醇、占培養(yǎng)基總重量0.25%的水晶洋菜和3%的蔗糖種胚培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)基的pH值5. 7，暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16h/d、光 照強度2500Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25 ± 2*C中繼續(xù)培養(yǎng)26d， 共28d，便出現(xiàn)新綠色的生有根的試管苗；(4) 繼代與誘導(dǎo)生根將該生根的試管苗去根進行繼代培 養(yǎng)，每4周繼代一次，經(jīng)1-2次繼代，即可誘導(dǎo)植林生根；(5) 馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室、光照強度 20000Lux、馴化l-2周，將苗從試管取出，用溫水沖洗苗根部培 養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比為蛭石珍珠巖泥炭-l: 1: 1混合而成的盆^A工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，每 隔3天將袋子剪一小口 ， 9-12d去袋移至溫室即成。其余實施例2-7，均對照表中相應(yīng)原料及配比值，用實施例 l相同步驟也能解決本發(fā)明的技術(shù)問題，只是分化率、生根率、 壯弱程度上的差異，總的說，數(shù)值越接近最佳值越理想。如有需 要，本申請人將隨時提供各階段實物苗照片，以供審核。
權(quán)利要求
1、一種普陀鵝耳櫪種胚培養(yǎng)基，其特征是由下列原料配比而成WPM鹽類、MT維生素、0.001-0.1mg/L的BA即芐氨基腺嘌呤、50-150mg/L的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2％-0.4％的水晶洋菜和1.5％-4.5％的蔗糖，培養(yǎng)基的pH值5.0-6.0。
2、 一種用如權(quán)利要求1所述的普陀鵝耳櫪種胚培養(yǎng)基進行組 培快繁方法，包括如下操作步驟1)外植體的采集與選擇要求種子的長度5-6毫米，種胚的長度O. 8-1.2mm,發(fā)育成熟的種子；(2)種子的洗凈、滅菌與取種胚將成熟種子沖水四個小時 并用蒸餾水清洗干凈后，放入1%次氯酸鈉的溶液中真空抽濾滅菌 10min，然后無菌水沖洗5次，在無菌操作臺上，利用解剖顯微鏡用剪刀及小鑷子剝?nèi)シN殼并用刀尖挑取種胚；(3 )接種與培養(yǎng)將切得的普陀鵝耳櫪種胚接種到WPM鹽類、 MT維生素、0. 001-0. lmg/L的BA即節(jié)Jt^腺嘌呤、50-l50mg/L 的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0. 2%-0. 4%的水晶洋菜和1. 5%-4. 5%的蔗 糖種胚培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2d后再置于光照周期16h/d、光照強度 2500Lux的冷光燈下、環(huán)境溫度25土2X:中繼續(xù)培養(yǎng)26d,共28d,便出現(xiàn)新綠色的生有才艮的試管苗；(4 )繼代與誘導(dǎo)生根將該生根的試管苗去根進行繼代培養(yǎng)， 每4周繼代一次，經(jīng)l-2次繼代，即可誘導(dǎo)植林生根；(5)馴化移栽將生根良好的幼苗移至馴化室、光照強度20000Lux、馴化1-2周，將苗從試管取出，用溫水沖洗苗根部培 養(yǎng)基，再用冷水沖洗，移栽至體積比為蛭石珍珠巖泥炭=1: 1: 1混合而成的盆^A工基質(zhì)中，每盆苗套上透明塑料袋，每隔3 天將袋子剪一小口， 9-12d去袋移至溫室即成。
全文摘要
一種普陀鵝耳櫪種胚培養(yǎng)基，由下列原料配比而成WPM鹽類、MT維生素、0.001-0.1mg/l的BA即芐氨基腺嘌呤、50-150mg/l的肌醇、占培養(yǎng)基總重量0.2％-0.4％的水晶洋菜和1.5％-4.5％的蔗糖，培養(yǎng)基的pH值5.0-6.0。用本培養(yǎng)基組培快繁包括下列操作步驟外植體的采集與選擇、種子的洗凈滅菌與取種胚、接種與培養(yǎng)、繼代與誘導(dǎo)生根、移栽培養(yǎng)。本發(fā)明通過組培快繁方法，能大批量獲得普陀鵝耳櫪再生苗，拯救了這一作為地球獨一的種質(zhì)資源。并向社會公開了一種優(yōu)良培養(yǎng)基與種苗快繁方法，為普陀鵝耳櫪的進一步研究、探索新的生物工程打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/04GK101402937SQ20081012161
公開日2009年4月8日 申請日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日 公開號200810121615.發(fā)明者俞慈英, 張翠萍, 李修鵬, 林新春, 黃麗春 申請人:浙江林學(xué)院