專利名稱：離子交換樹脂載體固定多酚氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以離子交換樹脂為載體來固定多酚氧化酶的方法。
背景技術(shù)：
多酚氧化酶是一類氧化還原酶，其由銅離子輔基和主酶兩部分組成，銅離子輔基不可透析。由于多酚氧化酶與食品加工和蔬菜保鮮與貯藏運(yùn)輸有著密切的關(guān)系，多酚氧化酶一直是研究的熱點(diǎn)，尤其是在其生化、生理學(xué)性質(zhì)方面取得了較大的進(jìn)展。多酚氧化酶在有氧條件下能選擇性催化酚類羥基化，把其氧化成醌，這一特性使得多酚氧化酶在工業(yè)、食品和環(huán)境保護(hù)等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用，如利用多酚氧化酶來催化氧化兒茶素形成茶黃素及茶飲料中獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)，煙草中利用其來形成獨(dú)特的品質(zhì)，利用固定化多酚氧化酶來去除工業(yè)污水中的多酚類有毒物質(zhì)等等。
20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的酶固定化技術(shù)，它是通過化學(xué)或物理的處理方法，使游離酶和固態(tài)的水不溶性載體相結(jié)合或被包埋，將酶束縛或限制在一定的區(qū)域內(nèi)，使酶分子在此區(qū)域進(jìn)行特有和活躍的催化作用，并可回收及長時間重復(fù)使用的一種交叉學(xué)科技術(shù)。游離酶經(jīng)固定化后，不僅保留了酶專一性、高效性、反應(yīng)條件溫和、無污染等特點(diǎn)的屬性，而且使其穩(wěn)定性和活性的半衰期都得到很大的提高，具有了易分離和連續(xù)化使用的優(yōu)點(diǎn)，有效的降低了工業(yè)生產(chǎn)的成本，從而克服了游離酶穩(wěn)定性差、易失活、不能重復(fù)使用，成本高的缺點(diǎn)。目前國內(nèi)外對多酚氧化酶的固定化做了部分研究，所采用的固定化載體主要為海藻酸鈉和殼聚糖。這些固定化方法，把酶蛋白分子包埋到水不溶性的海藻酸鈣和殼聚糖載體中，可以實(shí)現(xiàn)酶分子不溶于水中，達(dá)到酶分子的固定化效果，但是同樣增加了酶分子和底物結(jié)合作用的空間位阻，降低了酶的催化效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種采用離子交換樹脂載體固定多酚氧化酶的方法，以減少底物與固定化酶作用的空間位阻，提高酶的催化效率。
為此，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案離子交換樹脂載體固定多酚氧化酶
的方法，其步驟如下稱取載體離子交換樹脂，采用3 5倍樹脂體積的lmol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液以每小時1 1.5倍柱床體積的速度，以酸洗一堿洗一酸洗的順序?qū)ζ溥M(jìn)行活化，接著加入酶蛋白溶液，在恒溫?fù)u床中進(jìn)行吸附固定化，然后加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，之后過濾，用緩沖液沖洗，得到微球狀顆粒，即為高酶活性的固定化多酚氧化酶。
離子交換樹脂表面有很多可與酶分子作用結(jié)合的功能基團(tuán)，而且還有顆粒小、比表面積大的優(yōu)點(diǎn)，這樣，酶分子與樹脂表面的功能基團(tuán)作用從而連接到樹脂載體上，實(shí)現(xiàn)了多酚氧化酶的固定化，而且由于其樹脂載體的表面積大，以及酶分子都作用在樹脂表面，這樣就不會過多的增加酶分子與底物作用的空間位阻，影響酶的催化效率。
上述的方法，離子交換樹脂載體選用大孔陽離子交換樹脂，其優(yōu)選D152型、D113型或凝膠型陽離子交換樹脂，凝膠型陽離子交換樹脂優(yōu)選JK110型。上述的方法，酶蛋白選用直接鹽析后透析得到的粗多酚氧化酶蛋白、鹽析后超濾得到的較純的多酚氧化酶蛋白或鹽析后經(jīng)過層析柱精制的純多酚氧化酶蛋白。粗酶級別的制備植物組織經(jīng)破碎浸提過濾后得到的濾液，再經(jīng)過鹽析，之后透析得到粗酶溶液，之后再經(jīng)冷凍干燥得到粉狀粗酶；較純酶級別的制備植物組織經(jīng)破碎浸提過濾后得到的濾液，再經(jīng)過鹽析，之后超濾得到較純酶溶液，之后再經(jīng)冷凍干燥得到粉狀較純酶；純酶級別的制備植物組織經(jīng)破碎浸提過濾后得到的濾液，再經(jīng)過鹽析，之后經(jīng)過層析柱純化得到的純酶溶液，之后再經(jīng)冷凍干燥得到粉狀純酶。
上述的方法，加入的樹脂載體與酶蛋白的質(zhì)量比為1: 0.1 100g/mg，加入的多酚氧化酶用4'C pH5.6的磷酸緩沖液溶解；固定化條件為溫度0。C 45。C，搖床轉(zhuǎn)速0 200rpm，吸附固定化的時間為0.5 24小時；所述的交聯(lián)劑為戊二醛，其在溶液中的質(zhì)量百分濃度控制在0.04% 5%，濃度過高會導(dǎo)致多酚氧化酶活性喪失，交聯(lián)時間為0.5 24小時；過濾采用層析柱進(jìn)行過濾清洗；得到的固定化多酚氧化酶經(jīng)過冷凍干燥后直接制成干態(tài)的固定化多酚氧化酶。
本發(fā)明與海藻酸鈉、殼聚糖作為固定化載體等其它一些固定化方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)機(jī)械強(qiáng)度高，穩(wěn)定性高，水不溶性好，減少了底物與固定化酶作用的空間位阻，酶催化效率高。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
稱取10g未經(jīng)活化的離子交換樹脂D113，經(jīng)活化后加入50mg粗多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4°C pH5.6的磷酸緩沖液溶解)，在3(TC下的恒溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn)速吸附固定化2h，之后過濾，用4°C pH 5.6的磷酸緩沖液沖洗5次，之后，加入50ml0.04X的戊二醛溶液在3(TC下的恒溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn)速交聯(lián)2h，之后過濾，用4°C pH 5.6的緩沖液沖洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化多酚氧化酶的單位酶活性為0.222U/g*min，固定化效率為98.75%。
稱取10g未經(jīng)過活化的離子交換樹脂載體D152(細(xì))，經(jīng)活化后加入10mg純多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4°C pH5.6的磷酸緩沖液溶解)，在30°C下的恒溫?fù)u床下，以80rpm轉(zhuǎn)速吸附固定化2h，之后過濾，用4°C pH5.6的磷酸緩沖液沖洗5次，之后，加入50ml0.04^的戊二醛溶液在3(TC下的恒溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn)速交聯(lián)2h，之后過濾，用4°C pH 5.6的緩沖液沖洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化多酚氧化酶的單位酶活性為0.348U/g*min，固定化效率為96.08。％。
實(shí)施例3
稱取lOg經(jīng)過活化的離子交換樹脂載體JKllO，加入50mg較純多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4°C pH5.6的緩沖液溶解)，在3(TC下的恒溫?fù)u床下，以180rpm轉(zhuǎn)速吸附固定化2h，之后，加入50ml 0.04%的戊二醛溶液在3(TC下的恒溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn)速交聯(lián)2h，之后過濾，用4°C pH 5.6的磷酸緩沖液沖洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化多酚氧化酶的單位酶活性為0.383 U/g*min，固定化效率為95.37% 。
實(shí)施例4稱取10g經(jīng)過活化的離子交換樹脂載體D152 (細(xì))，加入50mg純多酚氧 化酶(多酚氧化酶以50ml 4°C pH5.6的磷酸緩沖液溶解)，在3(TC下的恒 溫?fù)u床下，以180rpm轉(zhuǎn)速吸附固定化2h,之后，加入400p1 25%的戊二醛 溶液使得溶液中的戊二醛濃度為0.2%,在3(TC下的恒溫?fù)u床下，以120rpm 轉(zhuǎn)速交聯(lián)2h，之后過濾，用4。C pH5.6的磷酸緩沖液沖洗5次，得到固定化 多酚氧化酶。得到的固定化多酚氧化酶的單位酶活性為0.647U/g*min，固定 化效率為97.18%。
實(shí)施例5
稱取10g未經(jīng)過活化的離子交換樹脂載體D152(細(xì))，經(jīng)活化后加入50mg 純多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4°C pH5.6的磷酸緩沖液溶解)，在30°C 下的恒溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn)速吸附固定化2h，之后過濾，用4°C pH5.6的 磷酸緩沖液沖洗3 5次，之后，加入50ml 0.04X的戊二醛溶液在3(TC下的 恒溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn)速交聯(lián)2h，之后過濾，用4°C pH 5.6的磷酸緩沖 液沖洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化酶的單位活性為 0.521U/g*min，固定化效率為95.08%。
實(shí)施例6
稱取10g經(jīng)過活化的離子交換樹脂載體D152 (細(xì))，加入50mg純多酚氧 化酶(多酚氧化酶以50ml 4°C pH5.6的磷酸緩沖液溶解)，在30"C下的恒 溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn)速吸附固定化2h，之后加入400lU 25%的戊二醛溶 液使得溶液中的戊二醛濃度為0.2%，在3(TC下的恒溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn) 速交聯(lián)lh，之后過濾，用4'C pH5.6的磷酸緩沖液沖洗5次，得到固定化多 酚氧化酶。得到的固定化酶的單位活性為0.799U/g*min，固定化效率為實(shí)施例7
稱取10g經(jīng)過活化的離子交換樹脂載體，加入50mg純多酚氧化酶(多酚 氧化酶以50ml 4°C pH5.6的磷酸緩沖液溶解)，在3(TC下的恒溫?fù)u床下， 以120rpm轉(zhuǎn)速吸附固定化2h，之后加入400 u 1 25°%的戊二醛溶液使得溶液 中的戊二醛濃度為0.2%，在3(TC下的恒溫?fù)u床下，以120rpm轉(zhuǎn)速交聯(lián)lh， 之后過濾，用4'C pH5.6的磷酸緩沖液沖洗5次，得到固定化多酚氧化酶， 然后采用冷凍干燥得到干態(tài)的固定化多酚氧化酶。得到的固定化酶的單位活 性為2.497U/g*min，固定化效率為93.28%。
.本發(fā)明的保護(hù)范圍并不只限于以上實(shí)施例，凡與本發(fā)明的技術(shù)路線、方 案相同或等同的內(nèi)容均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、離子交換樹脂載體固定多酚氧化酶的方法，其步驟如下采用酸洗-堿洗-酸洗的順序?qū)﹄x子交換樹脂載體進(jìn)行活化，接著加入酶蛋白溶液，在恒溫?fù)u床中進(jìn)行吸附固定化，然后加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，之后過濾，用緩沖液沖洗，得到微球狀顆粒，即為高酶活性的固定化多酚氧化酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的離子交換樹脂載體選 用大孔陽離子交換樹脂。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的大孔陽離子交換樹脂 選用D152型、D113型或凝膠型陽離子交換樹脂。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的凝膠型陽離子交換樹 脂選用JK110型。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶蛋白選用直接鹽析 后透析得到的粗多酚氧化酶蛋白、鹽析后超濾得到的較純的多酚氧化酶蛋白 或鹽析后經(jīng)過層析柱精制的純多酚氧化酶蛋白。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于所加入的樹脂載體與酶 蛋白的質(zhì)量比為l: 0.1 100g/mg。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于固定化條件為溫度0"C 45°C，搖床轉(zhuǎn)速0 200rpm，吸附固定化的時間為0.5 24小時。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑為戊二醛，其 在溶液中的質(zhì)量百分濃度控制在0.04% 5%，交聯(lián)時間為0.5 24小時。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的過濾采用層析柱進(jìn)行 過濾清洗。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于得到的固定化多酚氧化酶 經(jīng)過冷凍干燥后直接制成干態(tài)的固定化多酚氧化酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以離子交換樹脂為載體來固定多酚氧化酶的方法。目前固定多酚氧化酶的載體主要為海藻酸鈉和殼聚糖，可以實(shí)現(xiàn)酶分子不溶于水中，達(dá)到酶分子的固定化效果，但是同樣增加了酶分子和底物結(jié)合作用的空間位阻，降低了酶的催化效率。本發(fā)明的特征在于采用酸洗-堿洗-酸洗的順序?qū)﹄x子交換樹脂載體進(jìn)行活化，接著加入酶蛋白溶液，在恒溫?fù)u床中進(jìn)行吸附固定化，然后加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，之后過濾，用緩沖液沖洗，得到微球狀顆粒，即為高酶活性的固定化多酚氧化酶。本發(fā)明減少了底物與固定化酶作用的空間位阻，酶催化效率高。
文檔編號C12N11/06GK101492666SQ20081012163
公開日2009年7月29日 申請日期2008年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月16日
發(fā)明者劉曉輝, 張建勇, 江和源, 袁新躍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所