專利名稱:晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒pCN305載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域,特別涉及一種可利用自身晚期啟動子高效表達 外源基因的雙靶向(腫瘤靶向)溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法及攜帶所有具有殺 傷、抑制癌癥的外源基因如IL-24、TRAIL、S0CS3、cpp-S0CS3、S0CS1和cpp-SOCSl
的應(yīng)用。
背景技術(shù):
惡性腫瘤嚴重危害人類健康,目前臨床上對絕大多數(shù)晚期腫瘤患者仍然缺 乏有效的治療手段,而常規(guī)治療除了具有一定的毒副作用和耐藥性外,還存有 在殺傷腫瘤細胞的同時,使正常組織和細胞受到損害的難題,尤其是對造血組 織和細胞的損害尤為嚴重。因此,醫(yī)務(wù)工作人員和患者都期望能有一種治療腫 瘤的新的有效治療方法出現(xiàn)。
當(dāng)細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)理論與技術(shù)得到飛速發(fā)展,基因治療腫瘤策略 應(yīng)運而生。而隨著病毒學(xué)和腫瘤學(xué)快速發(fā)展,人們又嘗試將改造后的病毒用于 腫瘤治療的研究工作。
癌癥的耙向基因一病毒治療策略是利用溶瘤病毒在腫瘤細胞內(nèi)特異性裂 解、增殖來提高抗癌基因?qū)Π┘毎膹娏覛饔没蛞种谱饔?。這與傳統(tǒng)腫瘤 基因治療的病毒載體有本質(zhì)上的不同,后者是一種非復(fù)制性病毒,僅僅作為運 載工具將抗癌基因運輸?shù)浇M織或細胞內(nèi),而載體本身無靶向性和復(fù)制能力也無 治療作用。靶向基因一病毒治療充分利用病毒體積小、能復(fù)制和擴散能力強的 優(yōu)點,可在腫瘤原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移灶局部形成高濃度病毒,并激發(fā)免疫系統(tǒng)應(yīng)答 來增強殺瘤效應(yīng);同時還可以將抗癌基因靶向地運至腫瘤細胞內(nèi),抗癌基因能 隨著病毒的復(fù)制而增加拷貝數(shù),提高抗癌基因的表達量,兩者協(xié)同作用從而進 一步提高抗腫瘤的療
目前作為基因治療的載體分為病毒型和非病毒型兩大類。病毒載體包括 腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、和皰疹病毒等。病毒載體轉(zhuǎn)染率 高,表達時間長,但免疫原性強,有一定危險性。非病毒載體包括裸露DNA、脂質(zhì)體和其它物質(zhì)包裹的DNA。非病毒載體則免疫原性小及安全性好,但轉(zhuǎn)染率 低,基因穩(wěn)定性差,表達時間短。目前使用最多還是病毒載體。而在眾多病毒 載體中腺病毒以其宿主范圍廣,致病性低,包裝容量大,產(chǎn)生滴度高等優(yōu)點成 為應(yīng)用最廣的基因治療載體。根據(jù)hUp:〃ww.wiley.co.uk/gemned的最新統(tǒng) 計,全球共有1145個基因治療方案進入臨床,其中67%用于癌癥的治療,而以 腺病毒為載體的研究最為廣泛且高達25%。
但是大多數(shù)載體系統(tǒng)還是存在不能使治療基因特異地在腫瘤細胞內(nèi)高效表 達,因而不能徹底殺滅腫瘤細胞而嚴重阻礙著腫瘤基因治療的臨床療效。在腫 瘤患者體內(nèi),如果只能殺滅部分腫瘤細胞,殘留的少部分細胞將很快生長,導(dǎo) 致腫瘤復(fù)發(fā)。因此研制高效、靶向轉(zhuǎn)染腫瘤細胞的載體系統(tǒng)對目前腫瘤的基因 治療至關(guān)重要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種晚期啟動子耙向性調(diào)控 溶瘤腺病毒pCN305載體的構(gòu)建及其應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒PCN305載體,它具有SEQ ID No. 1 的基因序列。
一種上述晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒PCN305載體的構(gòu)建方法,包括 以下步驟
(1) 設(shè)計如下引物
Ad66: 5' CCAGAATATTGGMCTTTAG 3' BstXI
Ad67: 5, GGATCCATCGAGGATCCTCATTCTTGGGCMTGTATGM 3, BaraHI
Ad68: 5' GGATCCGTCGACTCGCGAGMTCGTTTGTGTTATGTT 3' BamHI
Ad69: 5, CTTMGTGAGCTGCCCGGGGA 3, AflII;
(2) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ301:
用HindIII酶切質(zhì)粒pTG1801,酶切完全后跑電泳回收2937bp大小的片段, 將此片段與同樣用HindIII酶切消化并去磷的載體pGEM-11Zf(+)連接、轉(zhuǎn)化,
取正確的陽性克隆,命名為pCZ301;
(3) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ302:
以質(zhì)粒pTG3602為模板,分別用引物Ad66、 Ad67和Ad68、 Ad69進行PCR, 電泳回收產(chǎn)物并分別命名為A8和A9, A8為341bp, A9為339bp;將用BstXI 和BamHI酶切消化的A8以及載體pGEM-Teasy進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的克隆 并命名為pGEM-T/A8。同樣地,將用BamHI和AflII酶切消化的A9以及載體 pGEM-Teasy進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的克隆并命名為pGEM-T/A9。然后用BstXI 和BamHI酶切消化質(zhì)粒pGEM-T/A8,跑電泳回收片段A8,將其與同樣用BstXI 和BamHI酶切消化過的質(zhì)粒pGEM-T/A9進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命 名為pGEM/A8-A9。用BstXI和AflII酶切得到的質(zhì)粒pGEM/A8-A9,電泳回收650bp 的片段A8-A9,將其與同樣用BstXI和AflII酶切消化過的質(zhì)粒pCZ301進行連 接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為PCZ302;
(4) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ303:
將Sphl酶切質(zhì)粒pTG1801,酶切完全后跑電泳回收10248bp的片段,并使 其自連、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ303。
(5) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ304:
HindIII酶切pCZ302,電泳回收2937bp大小的片段。將其與同樣用HindIII 酶切并去磷的質(zhì)粒pCZ303連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ304。
(6) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ305:
Sphl單酶切pTG3602,電泳回收6126bp的片段。將其與同樣用Sphl酶切 并去磷的載體pCZ304連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ305, pCZ305 具有SEQ ID No. 1的基因序列。
一種應(yīng)用上述的晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒pCN305載體獲得雙耙向 復(fù)制型溶瘤腺病毒的方法,其特征在于,包括以下步驟
(1) 將內(nèi)部核糖體進入位點IRES以及終止信號polyA克隆到載體 pBluescript-sk上,形成含有IRES、MCS和polyA表達框的轉(zhuǎn)移載體pBC/polyA。
(2) 通過電轉(zhuǎn)法在細菌內(nèi)使雙耙向的腺病毒骨架質(zhì)粒pCN103和含有抑癌基因 IL-24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1、 cpp-S0CS1的重組質(zhì)粒pCZ305-IL-24、 pCZ305-TRAIL 、 pCZ305-S0CS3 、 pCZ305-cpp-S0CS3 、 pCZ305-S0CSl 、 pCZ305-cpp-SOCSl進行同源重組,獲得重組質(zhì)粒pCN305-IL-24、 pCN305-TRAIL、 pCN305-S0CS3、 pCN305—cpp-S0CS3、 pCN305-S0CS1、 pCN305-cpp—S0CS1。
(3) 將酶切消化后暴露出包裝信號的重組腺病毒質(zhì)粒pCN305-IL-24 、 pCN305-TRAIL 、pCN305-S0CS3 、pCN305-cpp-S0CS3pCN305-S0CS1 、
pCN305-cpp-SOCSl分別轉(zhuǎn)染到293細胞中,使其包裝成雙靶向復(fù)制型溶瘤腺病 毒AdCN305-IL-24、 AdCN305-TRAIL、 AdCN305-S0CS3、 AdCN305-cpp-SOCS3、 AdCN305-S0CS1和AdCN305-cpp-S0CS1;使其高效表達IL_24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 SOCSl和cpp-S0CS1蛋白分子。
一種應(yīng)用上述的方法獲得雙靶向復(fù)制型溶瘤腺病毒用于制備治療腫瘤的藥 物的用途。
本發(fā)明的有益效果是
1. 本發(fā)明將腫瘤的病毒療法和基因治療有效地結(jié)合了起來,可高效表達外源基 因,相對于單純的病毒療法增強了對腫瘤的殺傷能力。
2. 本發(fā)明采用了一種雙重靶向腫瘤的策略,大大增強了腺病毒基因治療載體的 安全性。
3. 本發(fā)明利用病毒晚身啟動子來調(diào)控表達外源基因,保證了外源基因只有在病 毒復(fù)制的情況下才表達,相對于外源性啟動子,增加了基因表達的特異性。
4. 本發(fā)明通過構(gòu)建的新型腺病毒基因治療載體使所有殺傷抑制癌癥的基因如 IL-24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1和cpp-S0CS1發(fā)揮了較好的腫瘤 殺傷效果。
圖1為穿梭質(zhì)粒pCZ305構(gòu)建流程圖2為穿梭質(zhì)粒pBC/polyA的構(gòu)建流程圖3為雙靶向復(fù)制型溶瘤腺病毒PCN305載體攜帶抑癌基因IL-24的構(gòu)建流程圖; 圖4為采用Western-blot方法所得到的病毒感染后的S0CS3和cpp-S0CS3細胞
中的表達能力圖; 圖5為抗癌因子S0CS3和cpp-S0CS3誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡示意圖; 圖6為病毒AdCN305-S0CS3和cpp-S0CS3在正常細胞和在腫瘤細胞中的復(fù)制能 力示意圖7的(a) (e)分別為MTT法檢測病毒AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3 在正常細胞和腫瘤細胞經(jīng)10M0I (multiplicity of infection)的不同病 毒處理后5天的存活率示意圖8的(a)和(b)分別為AdCN305-S0CS3和AdCN305-c卯-S0CS3在裸鼠體內(nèi) 治療腫瘤細胞移植瘤的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了一種可利用自身晚期啟動子調(diào)控表達所有殺傷抑制癌癥的外
源基因如S0CS1、 cpp-S0CS1、 S0CS3、 c卯-S0CS3、 TRAIL和IL-24的雙耙向復(fù) 制型溶瘤腺病毒基因治療載體PCN305的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
該發(fā)明提供載體例如pCN305-IL-24 、 pCN305-TRAIL、 pCN305-S0CS3 、 pCN305-cpp-S0CS3、 pCN305-S0CS1和pCN305-cpp-S0CS1的構(gòu)建方法.其步驟包 括
一、通過刪除腺病毒Fiber基因下游的終止信號,構(gòu)建成與pCN103含有同 源臂的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pCZ305。
構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pCZ305的方法具體如下
1. 首先設(shè)計如下引物
Ad66: 5, CCAGAATATTGGMCTTTAG 3, BstXI
Ad67: 5, GGATCCATCGAGGATCCTCATTCTTGGGCMTGTATGAA 3, BamHI
Ad68: 5, GGATCCGTCGACTCGCGAGAATCGTTTGTGTTATGTT 3, BamHI
Ad69: 5, CTTAAGTGAGCTGCCCGGGGA 3, AflII
2. 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ301:
用HindlII酶切質(zhì)粒pTG1801,酶切完全后跑電泳回收2937bp大小的片段。 將此片段與同樣用HindIII酶切消化并去磷的載體pGEM-llZf(+)連接、轉(zhuǎn)化, 取正確的陽性克隆,命名為pCZ301。
3. 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ302:
以質(zhì)粒pTG3602為模板,分別用引物Ad66、 Ad67和Ad68、 Ad69進行PCR (詳見Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. , Joseph Sambrook and David W. Russell),電泳回收產(chǎn)物并分別命名為A8(341bp)和A9(339bp)。 將用BstXI和BamHI酶切消化的A8以及載體pGEM-Teasy進行連接、轉(zhuǎn)化,取 正確的克隆并命名為pGEM-T/A8。同樣地,將用BamHI和AflII酶切消化的A9 以及載體pGEM-Teasy進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的克隆并命名為pGEM-T/A9。然 后用BstXI和BamHI酶切消化質(zhì)粒pGEM-T/A8,跑電泳回收片段A8,將其與同 樣用BstXI和BamHI酶切消化過的質(zhì)粒pGEM_T/A9進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的
陽性克隆命名為pGEM/A8-A9。用BstXI和AflII酶切得到的質(zhì)粒pGEM/A8-A9, 電泳回收650bp的片段A8-A9,將其與同樣用BstXI和AflII酶切消化過的質(zhì)粒 pCZ301進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ302。
4. 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ303:
將Sphl酶切質(zhì)粒pTG1801,酶切完全后跑電泳回收10248bp的片段,并使 其自連、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為PCZ303。
5. 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ304:
HindIII酶切pCZ302,電泳回收2937bp大小的片段。將其與同樣用HindIII 酶切并去磷的質(zhì)粒PCZ303連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ304。
6. 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ305:
Sphl單酶切pTG3602,電泳回收6126bp的片段。將其與同樣用Sphl酶切 并去磷的載體pCZ304連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ305, pCZ305 具有SEQ ID No. 1的基因序列。
二、 將內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)以及終止信號polyA克隆到載體 pBluescript-sk上,形成含有IRES、MCS和polyA表達框的轉(zhuǎn)移載體PBC/PolyA。
三、 通過電轉(zhuǎn)法在細菌內(nèi)使雙靶向的腺病毒骨架質(zhì)粒pCN103和含有抑癌基 因如IL-24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1和cpp-S0CS1 (上述各種基因在 基因庫中均可查到)重組質(zhì)粒pCZ305-IL-24、 pCZ305-TRAIL、 pCZ305-S0CS3、 pCZ305-cpp-S0CS3、 pCZ305-S0CS1和pCZ305-cpp-SOCSl進行同源重組,獲得 重組質(zhì)粒pCN305-IL-24、 pCN305-TRAIL、 pCN305-S0CS3、 pCN305-c卯-S0CS3、 pCN305-S0CS1和pCN305-cpp-S0CS1。
四、 將酶切消化后暴露出包裝信號的重組腺病毒質(zhì)粒如pCN305-IL-24、 pCN305-TRAIL 、 pCN305-SOCS3 、 pCN305-cpp-S0CS3 pCN305-S0CS1 和 pCN305-cpp-S0CS1分別轉(zhuǎn)染到293細胞中,使其包裝成病毒如AdCN305-IL-24、 AdCN305-TRAIL 、 AdCN305-SOCS3 、 AdCN305-cpp-S0CS3 、 AdCN305-S0CSl和 AdCN305-cpp-S0CS1使其高效表達如IL-24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1 和cpp-S0CS1蛋白分子。
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明,應(yīng)理解以下實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。
下面根據(jù)附圖和具體實施例詳細說明本發(fā)明,本發(fā)明的目的和效果將變得 更加明顯。
下面以抑癌基因IL-24和S0CS3為例,說明雙靶向復(fù)制型溶瘤腺病毒PCN305 載體的構(gòu)建方法及其用于制備治療腫瘤的藥物的構(gòu)建流程和治療效果。 實施例l:
可攜帶外源基因的腫瘤靶向的腺病毒載體載體PCN305的構(gòu)建和病毒如 AdCN305-IL-24、 AdCN305-S0CS3和AdCN305-c卯-S0CS3等獲得。 A、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCZ305的構(gòu)建-
首先設(shè)計如下引物-
Ad66: 5, CCAGMTATTGGAACTTTAG 3, BstXI
Ad67: 5' GGATCCATCGAGGATCCTCATTCTTGGGCMTGTATGAA 3' BamHI
Ad68: 5, GGATCCGTCGACTCGCGAGMTCGTTTGTGTTATGTT 3, BamHI
Ad69: 5' CTTAAGTGAGCTGCCCGGGGA 3' AflII
① 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ301:
用HindIII酶切質(zhì)粒pTG1801,酶切完全后跑電泳回收2937bp大小的片段。 將此片段與同樣用HindIII酶切消化并去磷的載體pGEM-llZf (+)連接、轉(zhuǎn)化, 取正確的陽性克隆,命名為pCZ301。
② 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ302:
以質(zhì)粒pTG3602為模板,分別用引物Ad66、 Ad67和Ad68、 Ad69進行PCR (詳見Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. , Joseph Sambrook and David W. Russell),電泳回收產(chǎn)物并分別命名為A8(341bp)和A9(339bp)。 將用BstXI和BamHI酶切消化的A8以及載體pGEM-Teasy進行連接、轉(zhuǎn)化,取 正確的克隆并命名為pGEM-T/A8。同樣地,將用BamHI和AflII酶切消化的A9 以及載體pGEM-Teasy進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的克隆并命名為pGEM-T/A9。然 后用BstXI和BamHI酶切消化質(zhì)粒pGEM-T/A8,跑電泳回收片段A8,將其與同 樣用BstXI和BamHI酶切消化過的質(zhì)粒pGEM-T/A9進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的 陽性克隆命名為pGEM/A8-A9。用BstXI和AflII酶切得到的質(zhì)粒PGEM/A8-A9, 電泳回收650bp的片段A8-A9,將其與同樣用BstXI和AfIII酶切消化過的質(zhì)粒 pCZ301進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ302。
③ 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ303:
將Sphl酶切質(zhì)粒pTG1801,酶切完全后跑電泳回收K)248bp的片段,并使 其自連、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ303。
④ 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ304:
HindlII酶切pCZ302,電泳回收2937bp大小的片段。將其與同樣用Hindni 酶切并去磷的質(zhì)粒pCZ303連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ304。
⑤ 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ305:
Sphl單酶切pTG3602,電泳回收6126bp的片段。將其與同樣用Sphl酶切 并去磷的載體pCZ304連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ305。
B、 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBC/polyA的構(gòu)建
設(shè)計一段含有酶切位點Ncol, Sacl的polyA的Linker:
5" -CATGGTTGCGGCCGCGGATCCTCTAGMATAAAAGATCTTAAGTTTCATTAGATCTGTGTGTTG GTTTTTTGTGTGGTCGACGAGCT -3,
將EcoRI和Xbal酶切載體pCITE-1 (含有IRES序列),酶切完全后電泳回收 1752bP片段。將此片段與用EcoRI和Xbal酶切消化過的載體pBluescript-Sk 連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆,命名為pBC。用Ncol和Sacl酶切質(zhì)粒pBC, 電泳回收3495bp的片段,并將其與Linker進行連接轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆 即為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBC/polyA。
C、 pCN305-IL-24、 pCN305-S0CS3、 pCN305_cpp-S0CS3構(gòu)建
① 轉(zhuǎn)移載體PCZ305-IL-24、 pCZ305-S0CS3和pCZ305-cpp-S0CS3構(gòu)建
使用Ncol和Notl分別酶切質(zhì)粒pMD/IL-24、pMD/S0CS3、PMD/-cpp-S0CS3、 pMD/SOCSl和pMD/-cpp-S0CS1,酶切完全后電泳分別回收691bp、680bp和720bp 條帶。將其與同樣用Ncol和Notl酶切消化過的質(zhì)粒pBC/polyA進行連接、轉(zhuǎn) 化,取正確的陽性克隆分別被命名為pBC/polyA-IL-24 pBC/polyA- S0CS3和 PBC/polyA-cpp-S0CS3。用Sail酶切此得到的質(zhì)粒PBC/polyA-IL-24,酶切完全 后電泳回收的片段。將其與同樣用Sail酶切并去磷的PCZ305進行連接連接、 轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆即為重組質(zhì)粒pCZ305-IL-24、 pCZ305-SOCS3和 pCN305-cpp-S0CS3。
② 細菌內(nèi)同源重組
分別使用SnaBI酶切消化質(zhì)粒PCZ305-IL-24 、 pCZ305-SOCS3和 pCZ305-cpp-S0CS3,酶切完全后用無水乙醇醋酸鈉沉淀回收大片段。將質(zhì)粒 pCN103 (由本實驗室構(gòu)建,用hTERT替換了ElA的啟動子并缺失ElA上可與Rb 相互作用的CR2區(qū))與回收得到的片段通過電轉(zhuǎn)的方法在感受態(tài)細胞BJ5183內(nèi) 進行同源重組,取正確的陽性克隆即為重組質(zhì)粒pCN305-IL-24、 pCN305-S0CS3 和pCN305-cpp-S0CS3。
D、 病毒AdCN305-IL-24、 AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3包裝
分別使用pacl酶切質(zhì)粒pJN103/IL-24、pJN103/SOCS3和pJN103/cpp-S0CS3 (暴露出腺病毒的包裝信號),酶切完全后用無水乙醇醋酸鈉沉淀回收大片段, 通過轉(zhuǎn)染使其可以在293細胞(含E1A區(qū))中進行包裝形成病毒。此種方法包 裝病毒不會產(chǎn)生野生型病毒的污染。將病毒在293細胞進行大量的繁殖,應(yīng)用 氯化銫梯度離心純化病毒。
實施例2:病毒感染后SOCS3細胞中的表達能力。
將病毒AdCN305-S0CS3分別按5M0I感染MRC5、 BEL7404、 H印3B、 H460和 Bcap37五種細胞,48hr后,提取細胞的總蛋白,通過Western-blot對S0CS3 蛋白的表達進行分析。如圖4所示,從左至右分別表示AdCN305-S0CS3在人胚 肺細胞MRC5、人肝癌細胞株BEL7404、人肝癌細胞株H印3B、人肺癌細胞株H460 中表達S0CS3、人乳腺癌細胞株Bcap37中表達S0CS3蛋白水平。在正常細胞MRC5 中,S0CS3蛋白表達水平較低,說明病毒復(fù)制率低。而在四種腫瘤細胞中,S0CS3 蛋白表達水平較高,說明病毒復(fù)制率較高。 實施例3: S0CS3誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。
將病毒Ad-wt、 AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3按5M0I感染人肺癌 細胞H460,作用48hr后,通過Hochest染色法檢測S0CS3誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的 能力。如圖5所示,其中,a表示PBS空白對照組Hochest染色,b表示Adit 作用于H460細胞后Hochest染色,c表示AdCN305-S0CS3作用于H460細胞后 Hochest染色,d表示AdCN305-cpp-S0CS3作用于H460細胞后Hochest染色。 可見,病毒AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3可以誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡, 而PBS和Adit卻沒有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。(箭頭所指為凋亡細胞)
實施例4: AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3重組腺病毒在正常細胞和腫瘤 細胞中復(fù)制能力分析。 將3乂105的正常細胞或腫瘤細胞鋪于6孔板,24h后,加入5M0I的病毒將 Adit、 AdCN305-HcRed、 AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3四種病毒按5M0I 感染MRC5、 BEL7404、 H印3B、 H460和Bcap37五種細胞。48小時后,收集細胞 上清與細胞,在-2(TC與37'C反復(fù)凍融3次以釋放病毒。將病毒稀釋,檢測病毒 滴度。293細胞鋪于60mra dish, 24小時后細胞接近長滿,加入含不同稀釋度 (1(T1 10—8)的病毒,37'C感染2小時后,鋪8ml低熔點膠(5%FBS, 1.25% Agarose)。 9天左右記數(shù)。計算每PFU病毒產(chǎn)生的病毒數(shù)目。
由圖6結(jié)果可見,在正常細胞MRC5中,野生型病毒Ad-wt有較高的復(fù)制能 力,而我們改造后的靶向型病毒卻呈現(xiàn)出很低的復(fù)制水平。在四種腫瘤細胞中,
我們的重組病毒與野生型病毒都有著較高的復(fù)制能力,相差無幾。這些說明了 重組病毒的安全性以及在腫瘤細胞中特異性復(fù)制的能力。并且外源基因的插入 也未對病毒自身在腫瘤細胞中的復(fù)制能力造成的影響。用上述實驗方法
AdCN305-TRAIL和AdCN305-IL-24也可得到相同的實驗結(jié)果。
實施例5:病毒AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-SOCS3在體外對正常細胞和腫瘤 細胞的殺傷能力檢測。 細胞經(jīng)病毒處理后的存活率由MTT法檢測。步驟如下將肝癌癌細胞株 BEL7404、 S固CC7721及正常人胚肺細胞NHLF和正常人肺細胞MRC-5以5000每 孔的量鋪入96孔板,培養(yǎng)24小時后分別加入10 M0I的病毒,作用1天,然后 每天一次,連續(xù)四天將含病毒的培養(yǎng)液移去,換成含5mg/mlMTT的正常培養(yǎng)液, 培養(yǎng)4小時后將含MTT的培養(yǎng)液移去,以DMS0裂解,搖勻,然后以655nm處吸 光度為參比測定595nm處吸光度。
細胞存活率(%) =A595 (樣品)/A595 (對照)X100%。
結(jié)果如圖7所示,AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3對腫瘤細胞有很強
的殺傷作用,而對正常細胞毒性很小,具有腫瘤選擇性。用同樣的方法對病毒 AdCN305-IL-24和AdCN305-TRAIL也能產(chǎn)生相同的治療效果。 實施例6:病毒AdCN305- S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3在裸鼠體內(nèi)治療腫瘤細 胞移植瘤。
將4 5周齡的裸鼠皮下接種肝癌細胞株BEL7404, 12天后進行動物分組。 治療組給予1 X 109pfu的AdCN305-S0CS3進行治療,試驗結(jié)果如圖8-1所示,單 純的野生型病毒Ad-wt或者空載體病毒AdCN305-HcRed可以表現(xiàn)出一定的溶瘤 效果,但是攜帶治療基因的AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3可以顯著的 抑制腫瘤的生長,并且融合了穿膜肽的S0CS3的病毒抑制效果更好。用同樣的 方法對AdCN305-IL-24和AdCN305-TRAIL裸鼠體內(nèi)治療腫瘤細胞移植瘤療效相 同。
實施例7:病毒AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3移植瘤及肝臟的病理學(xué)和 免疫組化分析
取注射病毒7天后的裸鼠腫瘤組織,按常規(guī)服E染色方法進行,分別進行 脫水和石蠟包埋,石蠟切片厚4um,常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化后,蘇木素染10min, 鹽酸酒精分化數(shù)秒,水洗,伊紅染3min,水洗,脫水,透明,中性樹膠封固。 實驗結(jié)果如圖8-2所示單純的野生型病毒Adit或者空載體病毒 AdCN305-HcRed可以表現(xiàn)出一定的溶瘤效果,但是攜帶治療基因的
AdCN305-S0CS3和AdCN305-c卯-S0CS3可以顯著的抑制腫瘤的生長,并且融合了 穿膜肽的SOCS3的病毒抑制效果更好。通過病理學(xué)和免疫組織化學(xué)對注射腫瘤 及小鼠的肝臟進行了分析,AdCN305-SOCS3和AdCN305-cpp-S0CS3抑制了腫瘤內(nèi) phospho-Stat3的表達水平并且使腫瘤出現(xiàn)了大量的壞死。野生型病毒Ad-wt的 病毒顆??梢栽诟闻K中被檢測到,而AdCN305-S0CS3和AdCN305-cpp-S0CS3卻 沒有表現(xiàn)出對肝臟的毒性,進一步的說明了重組病毒的安全性。
序列表
<110>浙江理工大學(xué)
<120>晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒pCN305載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3.1
<210〉 1
<211> 1357
〈212> DNA
〈400〉 1
gcttgatatcgaattccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccg60
cttggaat犯ggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttt120
tggc組gtg鄉(xiāng)gcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcct鄉(xiāng)ggtct180
ttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtga鄉(xiāng)aagcagttcctct240
ggaagcttcttgaagac幼acaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaacccccc300
acctggcgacaggtgcctctgcggcc犯aagccacgtgtataagatacacctgcaaaggc360
ggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga卿agtcaaatggctctc420
ctcaagcgteittcaacaaggggctg犯ggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatc480
tgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtct3540
ggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacggitgataatatggccac600
aaccatggtcatgaattttcgcaaagcctgtggactttagccagaccctt660
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權(quán)利要求
1. 一種晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒pCN305載體,其特征在于,它具有SEQ ID No.1的基因序列。
2. —種權(quán)利要求1所述晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒PCN305載體的構(gòu)建方 法,其特征在于,包括以下步驟(1) 設(shè)計如下引物Ad66: 5, CCAGAATATTGGMCTTTAG 3, BstXIAd67: 5' GGATCCATCGAGGATCCTCATTCTTGGGCMTGTATGM 3' BamHIAd68: 5, GGATCCGTCGACTCGCGAGMTCGTTTGTGTTATGTT 3, BamHIAd69: 5, CTTAAGTGAGCTGCCCGGGGA 3, AflII。(2) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ301:用HindIII酶切質(zhì)粒pTG1801,酶切完全后跑電泳回收2937bp大小的片段, 將此片段與同樣用HindIII酶切消化并去磷的載體pGEM-11Zf (+)連接、轉(zhuǎn)化, 取正確的陽性克隆,命名為pCZ301。(3) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ302:以質(zhì)粒pTG3602為模板,分別用引物Ad66、 Ad67和Ad68、 Ad69進行PCR, 電泳回收產(chǎn)物并分別命名為A8和A9, A8為341bp, A9為339bp;將用BstXI 和BamHI酶切消化的A8以及載體pGEM-Teasy進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的克隆 并命名為pGEM-T/A8。同樣地,將用BamHI和AflII酶切消化的A9以及載體 pGEM-Teasy進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的克隆并命名為pGEM-T/A9。然后用BstXI 和BamHI酶切消化質(zhì)粒pGEM-T/A8,跑電泳回收片段A8,將其與同樣用BstXI 和BamHI酶切消化過的質(zhì)粒pGEM-T/A9進行連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命 名為pGEM/A8-A9。用BstXI和AfIII酶切得到的質(zhì)粒pGEM/A8-A9,電泳回收650bp 的片段A8-A9,將其與同樣用BstXI和AfIII酶切消化過的質(zhì)粒pCZ301進行連 接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ302。(4) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ303:將Sphl酶切質(zhì)粒pTG1801,酶切完全后跑電泳回收10248bp的片段,并使 其自連、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ303。
(5) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ304:HindIII酶切pCZ302,電泳回收2937bp大小的片段。將其與同樣用HindIII 酶切并去磷的質(zhì)粒pCZ303連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ304。(6) 構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pCZ305:Sphl單酶切pTG3602,電泳回收6126bp的片段。將其與同樣用Sphl酶切 并去磷的載體pCZ304連接、轉(zhuǎn)化,取正確的陽性克隆命名為pCZ305, pCZ305 具有SEQ ID No. 1的基因序列。
3. —種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒pCN305載體獲 得雙靶向復(fù)制型溶瘤腺病毒的方法,其特征在于,包括以下步驟(1) 將內(nèi)部核糖體進入位點IRES以及終止信號polyA克隆到載體 pBluescript-sk上,形成含有IRES、MCS和polyA表達框的轉(zhuǎn)移載體pBC/polyA。(2) 通過電轉(zhuǎn)法在細菌內(nèi)使雙靶向的腺病毒骨架質(zhì)粒pCN103和含有抑癌基因 IL-24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1、 c卯-S0CSl的重組質(zhì)粒pCZ305-IL-24、 pCZ305-TRAIL 、 pCZ305-SOCS3 、 pCZ305-cpp-S0CS3 、 pCZ305-SOCSl 、 pCZ305-cpp-S0CS1進行同源重組,獲得重組質(zhì)粒pCN305-IL-24、 pCN305-TRAIL、 pCN305-S0CS3、 pCN305-c卯-S0CS3、 pCN305-S0CSl、 pCN305-cpp-S0CS1。(3) 將酶切消化后暴露出包裝信號的重組腺病毒質(zhì)粒pCN305-IL-24 、 pCN305-TRAIL 、pCN305-S0CS3 、pCN305-cpp-S0CS3pCN305-S0CS1 、 pCN305-c卯-S0CS1分別轉(zhuǎn)染到293細胞中,使其包裝成病毒AdCN305-IL-24、 AdCN305-TRAIL 、 AdCN305-SOCS3 、 AdCN305-cpp-S0CS3 、 AdCN305-S0CS1和 AdCN305-cpp-SOCSl;使其高效表達IL-24、 TRAIL、 SOCS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1 和c卯-S0CS1蛋白分子。
4. 一種應(yīng)用權(quán)利要求3所述的方法獲得的雙靶向復(fù)制型溶瘤腺病毒用于制備治 療腫瘤的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種晚期啟動子靶向性調(diào)控溶瘤腺病毒pCN305載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用;該載體是在具有靶向性的pCN103載體的基礎(chǔ)上加以構(gòu)建,通過引入內(nèi)部核糖體進入位點IRES和多克隆位點,利用病毒自身的晚期啟動子來調(diào)控表達所有具有殺傷和抑制各類癌癥的外源基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1、cpp-SOCS1,且通過在體內(nèi)外實驗均顯現(xiàn)出很好的抗癌效果。應(yīng)用本發(fā)明構(gòu)建的所有雙靶向復(fù)制型溶瘤腺病毒如AdCN305-IL-24、AdCN305-TRAIL、AdCN305-SOCS3、AdCN305-cpp-SOCS3、AdCN305-SOCS1和AdCN305-cpp-SOCS1都可用于治療各類腫瘤,并可以開發(fā)出有效的治療腫瘤的病毒—基因抗癌新藥。
文檔編號C12N15/861GK101381742SQ200810121718
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者立 劉, 威 姜, 強 崔, 榮 蔡, 程 錢 申請人:浙江理工大學(xué)