專利名稱：：人乳頭狀瘤病毒基因分型方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及的是一種人乳頭狀瘤病毒基因分型方法，屬于醫(yī)學基因診斷學
技術領域：
。發(fā)明背景子宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一。據世界范圍統(tǒng)計,其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。全世界每年大約有49.3萬的子宮頸癌新發(fā)病例,27.4萬婦女死于該病，其中83%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，占發(fā)展中國家女性腫瘤的15%,而在發(fā)達國家宮頸癌僅占女性腫瘤的3.6%。我國每年新發(fā)病例13.15萬,占世界宮頸癌新發(fā)病例的四分之一。經過幾十年廣泛開展婦科普査,宮頸癌的發(fā)病率及死亡率降低了近68%，但從全國范圍來看,宮頸癌的患病率仍居婦科惡性腫瘤的第一位。且出現了宮頸癌的年輕病例逐年增加的趨勢。因此宮頸癌的防治成為我國婦科腫瘤的關注重點。宮頸癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟、多基因共同作用的結果,其中高危型HPV(人乳頭瘤病毒)感染WHO于1992年宣布是引起宮頸癌變的首要因素。1993年國際癌癥研究機構專題討論會認為:HPV感染是宮頸癌的主要病因，而對HPV感染的檢測和分型是處理宮頸病變的重要依據，也是宮頸癌篩查中不可缺少的內容。第二代雜交捕獲(hubridcaptureII,HC-II)試驗是迄今為止惟一獲得美國食品與藥品管理局(FDA)認證用于臨床的HPV檢測手段，已廣泛應用于臨床，但其缺點是不能具體對HPV基因型分型，高危型和低危型不能同時檢測，不能判斷多重感染。而HPV分型檢測對判斷疾病類型，治療后的隨訪，HPV流行狀況的分析以及基因疫苗的研制都有重要意義。目前，超過i00種HPV型別己被鑒別，至少40種HPV型別在肛門與生殖道粘膜中被發(fā)現，30種型別在子宮頸癌中被發(fā)現。HPV以是否導致惡性病變及種系間的關系為標準分為高危型和低危型，高危型包括HPV16,18,31,33，35,39，45，51,52,56,58，59,68,73,82;低危型包括HPV6,11，40，42,43，44,54,61,70，72,81,CP6108。此外，HPV26,53,66可能為高危型。不同的高危型與不同的病變相聯(lián)系，例如，在子宮頸鱗癌中以HPV16感染為主，而在腺癌中以HPV18感染為主。由于方法學的限制，不同型別HPV的病因學和持續(xù)感染情況還不清楚。另外，HPV多重感染在病變中很常見，但它在癌癥發(fā)展中的作用也不清楚。針對HPV特定型別在子宮頸病變發(fā)展中的重要作用，考慮到HPV型譜的多樣性和多重HPV聯(lián)合感染的高發(fā)率，準確的HPV檢測和分型技術對臨床子宮頸病變的治療和癌癥的預防顯得至關重要。病毒的各型基因序列與其生物學行為存在著高度相關性,不同基因型的HPV具有不同的致病危險性。HPVDNA的檢測和分型對了解相關病情、判斷預后及指導治療具重要價值，特別是對女性生殖道腫瘤的癌情預報具有重要意義。由于缺乏體外培養(yǎng)系統(tǒng)和可靠的血清反應物，所以HPV的分類幾乎完全依賴于其分子學特性。而且,不同HPV基因型之間的重組非常少,所以用病毒基因組的一部分進行分析作為基因型分類是可靠和穩(wěn)定的。用于病毒分型的基因位置的選擇是嚴格的,這個部位需要有充分的區(qū)分能力來區(qū)分所有不同的基因型甚至亞型。根據定義，如果Ll開放閱讀框中特定的291bp有10%不同就屬于不同的HPV型。目前，對于人乳頭瘤病毒基因型分型方法的研究很多,主要有雜交法和以聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)為基礎的檢測方法兩大類。雜交法l.傳統(tǒng)的雜交法:主要有DNA印跡法(Southernblot)和原位雜交法(insituhybridization,ISH)等。Southernblot是HPV基因分析的金標準，這項技術曾用于HPV的早期研究，但此方法敏感性低、耗時、需要大量高度純化的DNA,而且需要新鮮樣本，不能用于DNA已降解的組織，故不適合于臨床HPV分型的檢測應用。ISH能夠在組織病理中估計目的核酸或基因的表達，但ISH測定HPV序列的敏感性很低。而在此基礎上發(fā)展起來的分支DNA(branchedDNA,b2DNA)原位雜交法的敏感性較普通原位雜交法高，一個細胞中有12個拷貝的DNA時就能被檢測出來，能非常敏感地區(qū)分出HPV216和HPV218,而且有精確的定位功能。該法能檢測整個細胞和組織樣本中的DNA和mRNA,但檢測范圍較窄。2.新型雜交法:雜交捕獲法:雜交捕獲法n(hyhridcaptureII,HClI)是Digene公司的一種HPVDNA檢測技術，HCII法是目前惟一通過FDA批準的可在臨床使用的HPVDNA檢測技術。該技術敏感性較好,重復性高，在美國己作為巴氏法篩查宮頸癌的輔助檢查,而且在有些國家已經作為宮頸癌篩査的基本方法，可單獨使用或與巴氏法聯(lián)合使用。但此方法對檢測設備要求高，試劑檢測費用較貴，且不能對tIPV某一特定型別進行檢測，也不能檢測出多重感染。HCII檢測方法的最大缺點是不能測定具體的HPV型別。除此之外，HCII作為雜交反應，存在交叉雜交的問題，即與不在混合探針中的其他HPV型起交叉反應引起假陽性結果而降低特異性。以PCR為基礎的檢測方法與雜交法不同的是，以PCR為基礎的檢測方法是用PCR方法先進行目的基因的擴增，然后再用各種方法進行檢測。目前認為以PCR為基礎的檢測方法是進行HPVDNA檢測及分型的最好方法。1.HPVDNA的PCR擴增:對HPVDNA的擴增主要可以分為型特異PCR和普通PCR。(1)型特異PCR:型特異PCR是用型特異PCR引物，針對型間變異最大的區(qū)域，通常是E5/E7區(qū)，設計成能特定擴增單個HPV基因型。用型特異性PCR后即可確定特定型別的HPV,但這種方法費力，為了檢測一個臨床樣本中HPVDNA的存在，需要分別完成多個型特異的PCR反應。(2)通用引物PCR:通用引物PCR是使用通用引物來擴增廣譜的HPV,引物針對不同HPV型別之間的保守區(qū)域。這個保守序列的確定需要來自每個HPV基因型的許多序列。由于在HPV基因組中LI區(qū)是最為保守的區(qū)，目前一些通常使用的通用引物就針對這個區(qū)，如GP5+/6+(擴增150bp左右)、MY09/11及其改良的PGMY(擴增450bp左右)、SPF10(擴增65bp左右)，以往通用引物也有設在El區(qū)的。用普通PCR進行擴增后對陽性的擴增產物就可以用各種方法進行HPV的分型檢測。為提高普通PCR的敏感性，也常用巢式PCR，如先用MY09/11擴增后用其擴增產物作模板再用GP5+Z6+擴增，可檢測到較低的病毒含量。(3)實時熒光定量PCR(real2timequantitativePCR，RQ2PCR):對于HPV的分型檢測，一般的實時熒光定量PCR用型特異性引物，相當于型特異PCR,僅多了定量的功能，而以分子信標為基礎的實時熒光定量PCR還能同時檢測多型HPV。目前已設計的兩個通用探針可檢測40多種型別的HPV，其作用與HCII相似，可檢測一組型別的感染，但不能確定具體型別，可應用于大量樣本的篩查。但也有認為用12個熒光探針不可能完全檢測到所有型別，需要較多探針的混合，但探針的不同特性導致不易標準化。實時PCR閉管操作，可有效消除核酸交叉污染，具有實時、高靈敏度的優(yōu)點，而且具備定量功能。但用于HPV的分型上，型特異實時PCR的工作量太大，而以分子探針為基礎的實時PCR的蝎子引物及探針的有效性需要大量的驗證及改良，而且目前實時熒光PCR實驗成本比較高，也限制了其廣泛應用。2.PCR產物的分型檢測:通用引物PCR的產物需要用各種檢測方法進行分型檢測，主要有直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性分析、雜交法以及目前很具影響力的基因芯片法。(l)PCR產物的直接測序法:直接測序法可以測定PCR產物中的一對引物之間的序列。經測序后當未識別序列<5%時，可以與GeneBank數據庫中的己知序列進行比較確定型別;當與所有已知型別的序列相似性<90%時即可被認為是新的型別。PCR產物直接測序法能檢測所有型別，并可以避免雜交反應所固有的交叉反應。對HPV型特異性檢測是一種比較可靠的方法，特別是對檢測少見型和發(fā)現新的型別有著重要的作用，但直接測序法對于混合感染中同步檢測不同序列的敏感性不高，有時由于混合型別的存在使測序時序列無法讀出從而無法判斷型別，標本中含量少的型別容易被忽略而僅僅檢測到占主導地位的基因型。雖然目前的快速測序法可對臨床樣本進行高通量的常規(guī)檢測，但序列分析這一步驟仍相對費時、昂貴。(2)PCR產物的限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR2restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR2RFLP):不同的HPV有不同的序列，如果在限制性位點上有差異，核酸內切酶則不能識別而不能特異性酶解DNA,從而產生不同的限制性片段，產生不同的電泳條帶模式。選擇合適的限制性核酸內切酶，或選擇幾種內切酶的組合，就可以根據特定的條帶模式判斷HPV的型別。這種方法相對比較簡單易行，不需要特殊昂貴的儀器設備，費用低。選擇內切酶的最佳組合可以檢測HPV的具體型別，特別是可以檢測出HCII所不包含的少見的型別，當酶切出現不能判斷的條帶模式時，結合序列分析可以發(fā)現新的型別。用PCRRFLP的方法產生的條帶模式判斷型別時，可以設計簡單的軟件協(xié)助判斷，從而優(yōu)化此方法的分型判斷。但RFLP對PCR產物的特異性要求比較高，非特異性條帶的出現會導致酶切后分型上的不確定性，所以需要擴增目的片段的通用引物的特異性比較高，而且需要優(yōu)化PCR反應條件，增加目的條帶的特異性。(3)PCR產:物的雜交分析:雜交分析是最常用的檢測PCR產物序列的方法。型特異雜交法敏感性較高，-次可檢測多個PCR產物，并對多重感染的檢測能力較高，但其缺點是只能用于檢測已知的一定的常見型，對未知型及變異型的HPV不能檢測而且不能排除雜交固有的問題，即有交叉雜交存在的可能性。-Pyrosequencing(焦磷酸測序)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。Pyrosequencing技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，在每一輪測序-反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種dNTP,繼續(xù)DNA鏈的合成。Gharizadeh等(2001)采用焦磷酸測序技術對67例人乳頭瘤病毒(humanloapillomavimses,HPV)樣品進行了鑒定和分型，并與傳統(tǒng)測序相互驗證，結果證明該技術也非常適用于HPV等病原體的大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究。為提高HPV檢測的敏感性,采用巢式PCR,先用MY09/11擴增后用其擴增產物作模板再用05'+/6+擴增，然后用GP5作為測序引物，測序結果與GeneBank數據庫中的已知序列進行比較確定型別;為解決多重感染問題，用焦磷酸測序方法產生的測序模式判斷型別時，可以設計軟件協(xié)助判斷，從而優(yōu)化此方法的分型判斷。與傳統(tǒng)測序方法相比，該方法具有成本低廉，操作方便，能夠檢測多重感染的優(yōu)點；與雜交方法相比，具有成本低廉，操作方便，特異性強的特點；與PCR為基礎的其他方法相比，具有成本低廉，同時檢測多種型別的優(yōu)勢。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現有技術存在的不足，而提供一種在現有技術基礎上進行改良的，操作方便，特異性強，能夠同時檢測多重感染的人乳頭狀瘤病毒基因分型方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術方案來完成的，它主要結合了焦磷酸測序技術和以PCR為基礎的檢測方法，通過設計軟件對HPV常見40種亞型GP5后面25bp的序列進行了排列組合，具體方法如下1常見40種HPV亞型單一型別GP5后面25bp的序列；2常見40種HPV亞型任意兩種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；3常見40種HPV亞型任意三種組合后GP5后面25bp的混合序列模式;4常見40種HPV亞型任意四種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；5常見40種HPV亞型任意五種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；6常見40種HPV亞型任意六種組合后GP5后面25bp的混合序列模式。以上各種模式均以ATCG順序與緊跟GP5后面的堿基配對，并記錄配對的個數，如此循環(huán)進行，直到GP5后面25bp的序列全部配對，產生了1-6重不同亞型感染的焦磷酸測序模式數據庫；將樣品經DNA抽提、MY09/11擴增、其擴增產物作模板再用GP5+Z6+擴增，然后用GP5作為測序引物，測序結果與焦磷酸測序模式數據庫比對判斷型別。該方法能一次測序區(qū)分HPV常見40個亞型及不同型別的混合感染，可用于HPV感染分型的臨床診斷；它具有成本低廉，操作方便，特異性強，能夠同時檢測多重感染的優(yōu)點。具體實施方式下面將通過具體實施例對本發(fā)明作詳細的介紹本發(fā)明所述的人乳頭狀瘤病毒基因分型方法，它是1)通過設計軟件對HPV常見40種亞型GP5后面25bp的序列進行了排列組合，具體方法如下1常見40種HPV亞型單一型別GP5后面25bp的序列；2常見40種HPV亞型任意兩種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；3常見40種HPV亞型任意三種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；4常見40種HPV亞型任意四種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；5常見40種HPV亞型任意五種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；6常見40種HPV亞型任意六種組合后GP5后面25bp的混合序列模式。以上各種模式均以ATCG順序與緊跟GP5后面的堿基配對，并記錄配對的個數，如此循環(huán)進行，直到GP5后面25bp的序列全部配對，產生了l-6重不同亞型感染的焦磷酸測序模式數據庫；2)樣品DNA抽提；3)以人乳頭狀瘤病毒基因組為摸板，分別設計通用引物MY09/11和GP5十/6+，其中GP5+用生物素標記，巢式PCR擴增HPV基因組中L1區(qū)；4)PCR產物單鏈純化；5)用GP5作為測序引物焦磷酸測序；6)測序結果與焦磷酸測序模式數據庫比對判斷型別。實施例11、樣本處理充分洗脫宮頸刷上的樣本，并在管壁上擠干后，丟棄宮頸刷；把洗脫液全部轉移到1.5ml微量離心管中，13000rpm離心IO分鐘，棄上清，保留管底的細胞塊；加入50ul裂解液懸浮沉淀，100。C水浴加熱IO分鐘。13000rpm離心IO分鐘，保留上清待用；2、PCR擴增PCR擴增采用巢式PCR，即第一次用MY09/MY11引物對進行擴增；第二次以第一次PCR產物為模版用05+/06+引物對進行擴增;具體的PCR體系及PCR條件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、試樣預處理，單鏈分離純化*在使用前，保證所有溶液都達到室溫；*在PSQ96板中加入45^1annealingbuffer,然后每孔加入GP5+測序引物(10uM)lul;*使用Vertex混勻Sepharosebeads,將需要使用的sepharoebeads總量(每樣本3^)轉移到一個Eppendorf管中,在sepharosebead中加入bindingbuffer,使得平均每個樣品約有50(J的體積，將混合物混勻；*將以上混合物加入PCR產物(50W反應體積)中，每樣本50^1,將PCR產物在常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結合；*在Vacuumprepworkstation中，四個樣品板中依次加入180ml高純水、70%乙醇、washingbuffer禾卩120mlDenaturationbuffer;*打開vacuumprepworkstation的泵，將vacuumpreptool在高純7夂中清洗30秒,然后將vacuumpreptool移至!jPCR板中，抓取sepharosebeads,將vacuumpreptool方文入70%乙醇中5秒,然后移到denatureationbuffer中5秒,再移到washingbuffer中清洗10秒，把吸頭放在相應含有測序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關掉泵,將vacuumpreptool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放sepharosebeads);*使用高純水清洗vacuumpreptool。將放有樣品的PSQ96板放在ThermoPlate上加熱到80°C2分鐘，再冷卻到室溫后放入測序儀中；4、運行pyrosequencing禾呈序，點擊Run，進行焦磷酸領U序；5、分析結果測序結果與焦磷酸測序模式數據庫比對判斷型別。本發(fā)明能一次測序區(qū)分HPV常見40個亞型及不同型別的混合感染，用于HPV感染分型的臨床診斷。權利要求1、一種人乳頭狀瘤病毒基因分型方法，它主要結合了焦磷酸測序技術和以PCR為基礎的檢測方法，其特征在于通過設計軟件對HPV常見40種亞型GP5后面25bp的序列進行了排列組合，具體方法如下1常見40種HPV亞型單一型別GP5后面25bp的序列；2常見40種HPV亞型任意兩種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；3常見40種HPV亞型任意三種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；4常見40種HPV亞型任意四種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；5常見40種HPV亞型任意五種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；6常見40種HPV亞型任意六種組合后GP5后面25bp的混合序列模式。以上各種模式均以ATCG順序與緊跟GP5后面的堿基配對，并記錄配對的個數，如此循環(huán)進行，直到GP5后面25bp的序列全部配對，產生了1-6重不同亞型感染的焦磷酸測序模式數據庫；將樣品經DNA抽提、MY09/11擴增、其擴增產物作模板再用GP5+/6+擴增，然后用GP5作為測序引物，測序結果與焦磷酸測序模式數據庫比對判斷型別。全文摘要一種人乳頭狀瘤病毒基因分型方法，該方法是通過設計軟件對HPV常見40種亞型GP5后面25bp的序列進行了排列組合，具體方法如下1.常見40種HPV亞型單一型別GP5后面25bp的序列；2.常見40種HPV亞型任意兩種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；3.常見40種HPV亞型任意三種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；4.常見40種HPV亞型任意四種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；5.常見40種HPV亞型任意五種組合后GP5后面25bp的混合序列模式；6.常見40種HPV亞型任意六種組合后GP5后面25bp的混合序列模式。以上各種模式均以ATCG順序與緊跟GP5后面的堿基配對，并記錄配對的個數，如此循環(huán)進行，直到GP5后面25bp的序列全部配對，產生了1-6重不同亞型感染的焦磷酸測序模式數據庫，樣品經DNA抽提、MY09/11擴增、其擴增產物作模板再用GP5+/6+擴增，然后用GP5作為測序引物，測序結果與焦磷酸測序模式數據庫比對判斷型別；它具有成本低廉，操作方便，特異性強，能夠同時檢測多重感染的優(yōu)點。文檔編號C12Q1/68GK101397590SQ20081012172公開日2009年4月1日申請日期2008年10月27日優(yōu)先權日2008年10月27日發(fā)明者任緒義申請人:杭州迪安醫(yī)學檢驗中心有限公司