專利名稱：PolyLyse-HSP70融合蛋白膜修飾的腸癌細(xì)胞瘤苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于預(yù)防和治療結(jié)直腸癌的聚賴氨酸-熱休克蛋白 70 ( PolyLyse-HSP70 )融合蛋白膜修飾的腸癌細(xì)胞瘤苗及其制備方法。(二) 背景技術(shù)胂瘤的生物治療特別是免疫治療是肺瘤綜合治療的重要內(nèi)容。近年肺 瘤臨床免疫治療獲得重大進(jìn)展某些免疫制劑如赫賽汀、美羅華等單抗與 化療相結(jié)合可大幅度提高腫瘤治愈率和延長(zhǎng)患者生存率。其機(jī)理是這些抗 體激活宿主免疫細(xì)胞與抗體/補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)肺瘤細(xì)胞凋亡， 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性。這些進(jìn)展表明針對(duì)腫瘤 細(xì)胞的抗體在機(jī)體抗肺瘤免疫、提高化療藥的敏感性上發(fā)揮重要作用。免 疫治療成為肺瘤治療研究的重要方面，并出現(xiàn)與化療結(jié)合形成化學(xué)-免疫 治療的趨勢(shì)。腫瘤細(xì)胞在突變過(guò)程中尤其經(jīng)化療后，存活的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜將產(chǎn) 生和暴露出更多的抗原決定蔟并多以半抗原形式存在，結(jié)合載體后形成完 全抗原，有可能產(chǎn)生有效的抗腫瘤抗體。這對(duì)抗腫瘤化學(xué)-免疫治療具有 重要意義。另一方面，已知細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)作用在抗腫瘤免疫中 起重要作用。但誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL的腫瘤抗原(CTL表位)在不同的腫瘤中 卻不同，且分離困難，不具備通用性；腫瘤的抗原調(diào)變也影響瘤苗的CTL 作用。近年發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白(HSP)可通過(guò)獨(dú)特機(jī)制誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免 疫。HSP瘤苗可較好地解決腫瘤抗原調(diào)變，不必分離肺瘤抗原即可誘導(dǎo) CTL,又無(wú)明顯的毒副作用。此外，HSP本身具有免疫佐劑效應(yīng)，應(yīng)用性 強(qiáng)。大量實(shí)驗(yàn)和臨床治療也證明了 HSP瘤苗的諸多優(yōu)越性。HSP抗腫瘤 應(yīng)用研究已成為研究熱點(diǎn)。而HSP全細(xì)胞瘤苗因包含全部腫瘤抗原而成 為重要研究?jī)?nèi)容。但是，目前的HSP全細(xì)胞瘤苗的抗腫瘤效應(yīng)是基于HSP-抗原肽(誘導(dǎo)CTL的抗原成分)在瘤細(xì)胞裂解后釋放的。這不利于HSP-抗原肽與抗原提呈細(xì)胞(APC)上的HSP受體結(jié)合，影響了其抗腫瘤效 應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)用基因工程方法使胞漿中的HSP70表達(dá)到腫瘤細(xì)胞表面， 可促進(jìn)抗肺瘤特異性和非特異性免疫；膜表達(dá)HSP70的瘤苗產(chǎn)生更強(qiáng)的 抗月中瘤效應(yīng)。綜合治療是結(jié)直腸癌臨床治療的發(fā)展方向，化學(xué)-免疫治療則具有獨(dú) 特優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種具有較強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)的腸癌細(xì)胞瘤苗及其制 備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種聚賴氨酸-熱休克蛋白70 ( PolyLyse-HSP70 )融合蛋白膜修飾的 腸癌細(xì)胞瘤苗，所述腸癌細(xì)胞瘤苗為跨膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白 的CT26腸癌細(xì)胞的滅活細(xì)胞，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入腸癌細(xì) 胞細(xì)胞膜、HSP70端游離在腸癌細(xì)胞膜之外；所述PolyLyse為長(zhǎng)度為 60-100個(gè)的多聚賴氨酸肽段。本發(fā)明要點(diǎn)在于以腸癌細(xì)胞跨膜表達(dá)融合 蛋白的方式獲得腸癌細(xì)胞瘤苗，將融合蛋白的PolyLyse端嵌入腸癌細(xì)胞 細(xì)胞膜、HSP70端游離在腸癌細(xì)胞膜之外，在已知這一蛋白表達(dá)方式的 前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)常識(shí)進(jìn)行基因序列的設(shè)計(jì)、載體的構(gòu)建、 細(xì)胞的基因修飾、陽(yáng)性克隆篩選，方便地獲得本發(fā)明所述的腸癌細(xì)胞瘤苗。優(yōu)選的，所述PolyLyse為長(zhǎng)度為60個(gè)的多聚賴氨酸肽段。為增加空間活動(dòng)性，以免融合蛋白中PolyLyse與HSP70相互影響功 能，所述PolyLyse肽段與HSP70之間可插入3~5個(gè)丙氨酸。所述腸癌細(xì)胞瘤苗優(yōu)選為^夸膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白的 CT26腸癌細(xì)胞的滅活細(xì)胞，因?yàn)榭缒け磉_(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白的 CT26腸癌細(xì)胞瘤苗為所保藏的活細(xì)胞，而應(yīng)用于作為瘤苗時(shí)必須經(jīng)過(guò)滅 活處理才可以。所述^爭(zhēng)膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26腸癌細(xì)胞瘤苗活細(xì)胞，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢 大學(xué)，430072,保藏日期2008年6月25日，保藏編號(hào)CCTCC NO: C200826。本發(fā)明還涉及所述腸癌細(xì)胞瘤苗的制備方法，所述方法包括以跨膜 型融合基因修飾腸癌細(xì)胞，使腸癌細(xì)胞跨膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋 白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入腸癌細(xì)胞細(xì)胞膜、HSP70端游離在 腸癌細(xì)胞膜之外，篩選陽(yáng)性克隆，滅活細(xì)胞，得到所述腸癌細(xì)胞瘤苗。本發(fā)明以跨膜型融合基因修飾腸癌細(xì)胞，使之表達(dá)多聚賴氨酸 (PolyLyse)與熱休克蛋白70 ( HSP70)的融合蛋白，在細(xì)胞膜上嵌入 具有較強(qiáng)的載體-半抗原效應(yīng)的PolyLyse,其細(xì)胞膜外側(cè)連著HSP70。那 么，PolyLyse可與細(xì)胞膜上的各種半抗原形成完全抗原，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗腫 瘤體液免疫反應(yīng)和抗體形成；HSP70則可將腫瘤抗原肽/人細(xì)胞內(nèi)攜帶出 來(lái)，集中在細(xì)胞表面，促進(jìn)APC的活化和特異性T細(xì)胞免疫；并且HSP70 與APC上的受體的結(jié)合，可促進(jìn)PolyLyse進(jìn)入APC，從而促進(jìn)抗腫瘤體 液免疫和抗體形成。進(jìn)一步，基因修飾的腸癌細(xì)胞經(jīng)化療藥處理，制備的 瘤苗的免疫效應(yīng)更強(qiáng)，并對(duì)體內(nèi)化療后殘存的腸癌細(xì)胞有更好的針對(duì)性?；蛘?，所述方法為以跨膜型融合基因修飾腸癌細(xì)胞，使腸癌細(xì)胞跨 膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入腸癌 細(xì)胞細(xì)胞膜、HSP70端游離在腸癌細(xì)胞膜之外，篩選陽(yáng)性克隆用化療藥 模擬臨床治療進(jìn)行處理，處理后的存活的細(xì)胞用絲裂霉素滅活，得到所述 腸癌細(xì)胞瘤苗。所述化療藥可采用本領(lǐng)域常規(guī)用于腸癌的化療藥(例如 氟尿嘧啶，奧沙利鉑和伊利替康等等)，其用量為臨床化療常規(guī)用量，本 發(fā)明中所述化療藥優(yōu)選為氟尿嘧啶，用量為0.01mg/mL細(xì)胞懸液。優(yōu)選的，所述方法為克隆HSP70基因的全長(zhǎng)cDNA,將HSP70基 因定向克隆接入真核表達(dá)載體pDisplay(其它可跨膜、真核表達(dá)載體也可) 中，得到膜表達(dá)載體pDisplay-HSP70，在載體pDisplay-HSP70中的HSP70 基因粘端連接編碼4個(gè)丙氨酸和60個(gè)賴氨酸的DNA片段，得到融合蛋白膜表達(dá)載體pDisplay-mPolyLyse-HSP70 , 將載體 pDisplay-mPolyLyse-HSP70轉(zhuǎn)染腸癌CT26細(xì)胞，G418篩選陽(yáng)性克隆， 擴(kuò)增后，以每毫升細(xì)胞懸液加入0.01mg5-Fu的量進(jìn)行才莫擬臨床化療處理， 5-Fu處理后存活的CT26細(xì)胞以絲裂霉素滅活，得到所述腸癌細(xì)胞瘤苗。化療后存活的腸癌的細(xì)胞膜可產(chǎn)生和暴露出更多、抗原性更強(qiáng)的半抗 原；但以全細(xì)胞瘤苗的細(xì)胞膜半抗原誘導(dǎo)強(qiáng)大的抗癌體液免疫，目前尚無(wú) 報(bào)道，具有創(chuàng)新性。同時(shí)，現(xiàn)有研究也表明膜表達(dá)HSP70可將抗原肽從 癌細(xì)胞內(nèi)攜帶到膜表面，可明顯促進(jìn)抗腫瘤特異性CTL作用。按照本發(fā)明思路，經(jīng)體液免疫和細(xì)胞免疫均可獲加強(qiáng)的新型腸癌瘤 苗。同時(shí)，以5-Fu模擬化療處理瘤苗細(xì)胞，使瘤苗的免疫原性增強(qiáng)，并 對(duì)體內(nèi)化療后殘存的癌細(xì)胞有更強(qiáng)的針對(duì)性。腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，位居前三，近年來(lái)其發(fā)病又呈持續(xù)上升態(tài)勢(shì)。 腸癌難點(diǎn)是癌細(xì)胞化療耐藥和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)；免疫治療有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，對(duì)化 療后轉(zhuǎn)移或耐藥的癌細(xì)胞更為有效可靠。本發(fā)明所提供的新型腸癌瘤苗， 預(yù)期在治療大腸癌和預(yù)防其復(fù)發(fā)上具有較好的應(yīng)用價(jià)值，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì) 和社會(huì)效益。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種免疫原性更強(qiáng)、抗腫瘤效 應(yīng)更高的腸癌細(xì)胞瘤苗，對(duì)化療后轉(zhuǎn)移或耐藥的癌細(xì)胞更為有效，應(yīng)用于 預(yù)防和治療結(jié)直腸癌，具有重大應(yīng)用前景。

圖1為構(gòu)建的跨膜型PolyLyse-HSP70融合蛋白基因表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為pDisplay-polyLyse-HSP70表達(dá)的DNA電泳結(jié)果；Lane 1和 Lane l， CT26分別帶HSP70和卩-actin的引物；Lane 2和Lane 2，: mock-CT26分別帶HSP70和(3匿actin的引物；Lane 3和Lane3,:CT26-pDisplay陽(yáng)polyLyse陽(yáng)HSP70分別帶HSP70和(3-actin的引物； 圖3為膜表達(dá)并結(jié)合融合蛋白PolyLyse-HSP70后的腫瘤細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡結(jié)果；A細(xì)胞膜表面表達(dá)并結(jié)合HSP70蛋白的，其膜表面呈綠色 熒光(FITC標(biāo)記)；B細(xì)胞膜表面表達(dá)并結(jié)合癌基因c-myc表位的，其膜 表面呈紅色焚光(TRITC標(biāo)記)；C細(xì)胞膜表面結(jié)合HSP70蛋白和癌基因 c-myc表位的，則其細(xì)胞膜表面呈黃色熒光(紅綠疊加色)，表明二段蛋 白(多肽)同時(shí)出現(xiàn)在同一細(xì)胞膜上；D同型匹配抗體(Ig2b)對(duì)照顯 示細(xì)胞膜表面無(wú)二抗結(jié)合(黑色背景) 圖4為HSP70擴(kuò)增結(jié)果； 圖5為PolyLysl擴(kuò)增結(jié)果； 圖6為PolyLys2擴(kuò)增結(jié)果； 圖7為HSP70-PolyLysl拼接結(jié)果； 圖8為HSP70-PolyLysl-PolyLys2拼-接結(jié)果； 圖9為pdisplay-HSP70-PolyLysl-PolyLys2質(zhì)粒； 圖10為pdisplay-HSP70-PolyLysl"PolyLys2質(zhì)粒酶切鑒定圖； 圖11為pdisplay-HSP70-PolyLysl-PolyLys2質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果； 圖12為各瘤苗免疫治療作用中的NK活性； 圖13為各瘤苗免疫保護(hù)作用中的NK活性； 圖14為各瘤苗免疫治療作用中的CTL活性； 圖15為各瘤苗免疫保護(hù)作用中的CTL活性； 圖16為各瘤苗免疫保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中IL-2水平； 圖17為各瘤苗免疫保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中INF-y水平； 圖18為各瘤苗免疫保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中IL-4水平； 圖19為各瘤苗免疫保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中IL-10水平； 圖20為各組瘤苗對(duì)荷瘤鼠的抑瘤作用； 圖21為各組瘤苗對(duì)荷瘤鼠的生存延長(zhǎng)作用； 圖22為各組瘤苗免疫鼠的瘤體生長(zhǎng)(瘤苗抗瘤攻擊作用)； 圖23為各組瘤苗免疫鼠瘤攻擊后的生存(瘤苗抗瘤攻擊作用)。 具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1: HSP70全長(zhǎng)基因cDNA克隆 1.1鼠肝組織總RNA的提取BALB/c小鼠鮮活肝組織100毫克剪碎，42。C熱處理20分鐘后置于 研缽中加少許PBS研成漿。移入Eppendorf管，力。lmlTrisol試劑(Gibco, BRL)混勻后轉(zhuǎn)移至專用Eppendorf管，25。C水浴，5 min。加入0.2ml 氯仿(上海生工公司)混勻后15 30。C溫浴，2min。4。C離心12000r/minxl5 min，即出現(xiàn)分層。吸取上層水相500ul移入新的Eppendorf管，加入等 體積異丙醇，溫和混勻。25。C溫浴，10min。 4。C離心12000 r/minx 15 min， 吸去上清，管底沉淀加入1 ml 70%乙醇搖混后25。C溫浴， 5 min。 再4。C 離心10000 r/minx 10 min，吸去上清，沉淀在空氣中干燥數(shù)分鐘。加經(jīng)D EPC處理^7]<溶解RNA沉淀。轉(zhuǎn)移RNA溶液至專用Eppendorf管。留5 |il用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度為300(ig/ml。 1.2 RT-PCR法獲取HSP基因cDNA根據(jù)試劑盒M-MuLV( Gibco, BRL)說(shuō)明書(shū)，取RNA摸板10jal ( 3pg )， 加oligo (dT) 18 primer (試劑盒自帶)lpl和去離子水10 pl， 70。C溫浴 5 min。取出即放在冰上，順序加入5xRT buffer (試劑盒自帶)4^1; RNasin (試劑盒自帶)20U); 10MmdNTPmix (試劑盒自帶)2pl 。 短暫離心，37。C溫浴5min。加逆轉(zhuǎn)錄酶(試劑盒自帶)200U, 42°C溫浴 1 h后70。C溫浴10min。終止反應(yīng)，短暫離心，獲逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品，作為下一 步PCR的模板。實(shí)施例2:膜表達(dá)HSP70的真核表達(dá)載體的構(gòu)建 2.1載體的選才奪能在真核細(xì)胞中表達(dá)的載體pDisplay (Invitrogen公司，USA)，在多克隆酶切位點(diǎn)的上游有小鼠K鏈信號(hào)肽序列，多克隆酶切位點(diǎn)的下游有血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)跨膜序列。故其適合構(gòu)建表達(dá) HSP70蛋白嵌合于細(xì)胞膜表面的載體。 2.2目的基因的擴(kuò)增根據(jù)GeneBank中的HSP70的基因序列，設(shè)計(jì)并合成(上海生工公 司)1對(duì)引物P1和P2，分別包含&cll和&311酶切位點(diǎn)。上游引物P1: 5'- GCCGCGGCATGGCCAAAGCCGCrGCAGTCGGCAT-3'(有下劃線部 分為&cll酶切位點(diǎn)，第24位斜體r為突變后石威基)；下游引物P2: 5'-CGGTCGACATCTACCTCCTCAATGGTG -3'(有下劃線部分為&11酶 切位點(diǎn))。以此作為引物，以RT-PCR法獲得的HSP70全長(zhǎng)cDNA作為模 板，PCR擴(kuò)增HSP70 cDNA。使用高保真酶Pfu, 95。C熱變性3min,循 環(huán)條件94。C變性，45 s; 58。C退火，45 s; 72。C延伸3 min 50 s。 28個(gè)循 環(huán)后72。C延伸10 min。產(chǎn)物4。C保存?zhèn)溆茫∩僭S凝膠電泳觀察結(jié)果。 2.3目的基因定向克隆構(gòu)建策略為分步酶切，定向克隆。將HSP70 DNA和載體pDisplay (購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司)分別進(jìn)行分步酶切先以&cII酶(Fermentas, USA)切5"acII位點(diǎn)，DNA膠回收純化后以&1 I酶(Fermentas， USA) 再作I位點(diǎn)酶切。已酶切好的，具有兩個(gè)粘端的HSP70 DNA和載體 pDisplay各4.5 |il，力口 T4 DNA連才妄酶(Promega )、 2 x buffer, 4。C過(guò)^！ 后則載體構(gòu)建完成。 2.4構(gòu)建載體的證實(shí)將已構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (浙江大學(xué)免疫學(xué)研究所保 存)，在氨千抗性培養(yǎng)亞篩選陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增，提質(zhì)粒。以質(zhì)粒酶切產(chǎn)物 電泳和質(zhì)粒DNA測(cè)序證實(shí)載體pDisplay-mbHSP70的構(gòu)建完成。實(shí)施例3:膜型polyLyse-HSP70融合蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建在已構(gòu)建好的pDisplay-HSP70載體的HSP70粘端連接3~5個(gè)丙氨酸和60個(gè)賴氨酸，構(gòu)建策略將hsp70部分序列擴(kuò)增與合成的片斷拼接， 然后利用hsp70自身的酶切位點(diǎn)SmlI與其其余部分及載體pDisplay相連。 具體過(guò)程如下需要合成的氨基酸的序列208bpGGAGGTAGAT gcc gce ecg gcc aag aag aaa a犯aag aag鄉(xiāng)aaa a犯叫a犯a犯aag aaa aagHsp70粘端 4個(gè)丙氨酸 60個(gè)賴氨酸aag aag aag aag aag aag aag aag aag aag aaa aag a賜aag aag aag aag aag aag aag aaa aag aag犯g aag aag a犯aaa aag aag aag犯g aag: aag鄉(xiāng)aaa aag aag鵬糾g,脇g.站SJ^ig^ gtc鵬Acc I由于序列重復(fù)太多而導(dǎo)致無(wú)法合成，現(xiàn)在多聚賴氨酸中間插入酶切位點(diǎn)變成兩段序列合成(1) 這段序列共118bp,其中包含4個(gè)丙氨酸以及30個(gè)賴氦酸的序列即90bp 序列(PolyLysl)GGAGGTAGAT gcc scg gcg gcc躲g.a雜.,鵬'與g aag aag aag a汰汰—aag…aag &ag a賜…aagL汰助.'將g 4個(gè)丙氨酸 30個(gè)賴氨酸 稱g—翻g,巡g aag aag aag aag aau aag aag ;i;m ;1;1g ，ttcEcoRI(2) 這段序列共102bp,包含30個(gè)賴氨酸的序列90bp: (PolyLys2)gaattc aag aag aag aag aag aaa aag a犯aag aag aag aaa aag aag aag aag aag aag aag aaa aag aag aag aag aag aag aag aag aag gtcgacAcc I實(shí)驗(yàn)步驟 1、 PCR擴(kuò)增①?gòu)膒Display-HSP70載體中擴(kuò)增部分HSP70序列 引物序列Length: 615 bpPrimer F: HSP70-4: 5'畫(huà)GGTGCTGATCCAGGTGTAC-3' Primer R: HSP70國(guó)2: 5'-ATCTACCTCCTCAATGGTGG-3' PCR反應(yīng)體系40ullOxBuffer 4.0 ulMg2+ (25mmol/L) 3.2 ul反應(yīng)條件:dNTPs (各10mmo1/1)PrimerF (20pmol/ul) PrimerR ( 20pmol/ul) Taq酶(5U/ul) H20模板(100ug/ml)94 °C 3min94 °C 20s58°C 20s0.8 ul 0.5 ul 0.5 ul 0.3 ul 28.7 ul 2.0 ul72 °C 30s72 °C 5min3 5 cycles②從載體中擴(kuò)增第一段序列(PolyLysl): 引物序列Length: 121 bpPrimerF: PolyLysl-1: 5'-GGAGGTAGATGCCGCGGC-3' PrimerR: PolyLys 1-3: 5'-ccgGAATTCCTTCTTCTTCTTTTTC隱: PCR反應(yīng)體系40ul10xBuffer 4.0 ulMg2+(25mmol/L) 3.2 111dNTPs (各10 mmol/l) 0.8 ulPrimerF (20pmo歸) 0.5 ulPrimerR ( 20 pmol/ul) 0.5 ulTaq酶(5U/ui) 0.3 ulH20 28.7 ul才莫板(100ug/ml) 2.0 ul反應(yīng)條件:94 °C 3min94 °C 15s58°C 20s72 。C 20s72 °C lOmin③擴(kuò)增第二段序列(PolyLys2): 引物序列Length: 179 bpPrimer F: PolyLys2-l: 5'- CCGCTCTAGAACTAGTGGATC -3' Primer R: PolyLys2-2: 5'- CGACTCACTATAGGGCGAAT -3' PCR反應(yīng)體系40ul10xBuffer 4.0 ulMg2+(25mmol/L) 3.2 uldNTPs (各10mmo1/1) 0,8 ulPrimerF (20pmol/ul) 0.5 ulPrimerR ( 20 pmol/ul) 0.5 ulTaq酶(5U/ul) 0.3 ulH20 28.7 ul模板(100ug/ml) 2,0 ul反應(yīng)條件:94 °C 3min94 °C 15s58°C 20s72 °C 20s72 °C lOmin35cycles2、 PCR產(chǎn)物純化(純化試劑盒，購(gòu)自QIAGEN， USA):① 用瓊脂糖膠電泳，將目的DNA片斷切下，放入1.5ml離心管中。② 加入500ul Solution SN液，置于65。C水浴中指月交完全融化，中途混 勻幾次。膠融化后加入lOOul Solution B液，混勻。③ 將3S柱放入2ml收集管中，將融化后的膠溶液轉(zhuǎn)移至3S柱中，室 溫靜置2min, lOOOOrpm離心lmin。④ 取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，加入600ul Wash Solution, lOOOOrpm離心lmin。⑤重復(fù)步驟④(D取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，10000rpm離心2min。 ⑦將3S柱放入一新的1.5ml離心管中，在3S柱膜中央加入30ul水， 室溫放置2min, 10000rpm離心lmin,離心管中液體即為回收的 DNA片斷。 3、 PCR拼接拼接HSP70和PolyLysl: 引物序列Length: 726 bpPrimer F: HSP70-4: 5'-GGTGCTGATCCAGGTGTAC畫(huà)3' PrimerR: PolyLysl-3: 5'-ccgGAATTCCTTCTTCTTCTTTTTC-3 PCR反應(yīng)體系40ul BufferMg2+ (25mmol/L) dNTPs (各10mmo1/1)PrimerF (20pmol/ul)PrimerR (20pmoi/ul) Taq酶(5U/ul) H20模板l(100ug/ml) 模板2(100ug/ml)反應(yīng)條件:94 °C 3min94 °C 20s58°C 20s4.0 ul 3.2 ul 0.8 ul 0.5 ul 0.5 ul 0.3 ul 26.7 ul 2.0 ul 2.0 ul72 °C 40s72 °C 5min40cycles4、酶切對(duì)HSP70-PolyLysl拼接產(chǎn)物和PolyLys2進(jìn)行EcoRI酶切10x Buffer 2ul EcoRI酶(10U/ul) lul模板(ioug/ui)_^hL37。C水浴3h5、 連接對(duì)酶切后的HSP70-PolyLysl拼接產(chǎn)物和PolyLys2用T4 DNA 連接酶連接25ul連接體系T4 ligase Buffer 2.5ul T41igase(10U/ul) lul HSP70-PolyLysl (50ng/ui) 10ul PolyLys2(40ngM) 11.5ul放置過(guò)夜6、 PCR擴(kuò)增HSP70-PolyLysl-PolyLys2:以連接產(chǎn)物為模板，用HSP70-4 上游引物和PolyLys2下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列Length: 862 bpPrimer F: HSP70-4: 5'-GGTGCTGATCCAGGTGTAC-3' Primer R: PolyLys2-2: 5'- CGACTCACTATAGGGCGAAT陽(yáng)3' PCR反應(yīng)體系40ul10xBuffer 4.0 ulMg2+ (25mmol/L)3.2 uldNTPs (各10mmo1/1)0.8 ulPrimerF (20pmol/ui)0.5 ulPrimerR ( 20pmol/ul)0.5 ulTaq酶(5U/ul)0.3 ulH2026.7 ul模板l(100ug/ml)2.0 ul模板2(100ug/ml)2.0 ul反應(yīng)條件94°C 94°C 58°C 72°C 72°C 3min 20s 20s 45s 5min40cycles7、 酶切將pDisplay-HSP70載體、HSP70與第一4殳序列的拼接產(chǎn)物進(jìn)行Blpl酶和 ACCI酶切10xM Buffer 2ul ACC I酶(10U/ul) lul模板(10ug/ul)_17ul37。C水浴3h NEB4 Buffer 2ul Blp I酶(10U/ul) 0.5ul模板(10ug/ul)_17.5ul37"C水浴3h8、 連接轉(zhuǎn)化連接25ul連接體系T4 ligase Buffer 2.5ul T4 ligase(10U/ul) lul DNA(10ug/ul) 15ul質(zhì)粒(10ug/ul)_6.5ul放置過(guò)夜轉(zhuǎn)化取10ul連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中 丄水浴30min 丄42。C熱激90s丄冰浴3min 丄加入lmlLB培養(yǎng)基丄150轉(zhuǎn),搖lh丄均勻平鋪到LB培養(yǎng)皿上，37。C放置3h丄吸干殘液，將平板倒置，37"C過(guò)4艾 丄挑取克隆加入到加有1%?？股氐呐囵B(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜 9、質(zhì)粒抽提(質(zhì)粒抽提試劑盒，購(gòu)自QIAGEN， USA )① 將過(guò)夜培養(yǎng)的2ml細(xì)菌高速離心lmin，徹底去除上清。② 加入100ul Solution I ,用才&頭充分懸浮細(xì)菌。③ 加入200ul Solutionll,立即上下顛倒混勻，使細(xì)菌裂解，室溫放置2min 至溶液變成澄清。④ 加入400ulSolutionin,立即上下顛倒5-10次，使之充分中和，室溫放 置2min。⑤ 15000rpm,離心10min。⑥ 將3S柱放入2ml收集管中，將上清轉(zhuǎn)移到3S柱，室溫放置2min， 12000rpm離心lmin。⑦ 取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中，加入 700ul Wash Solution, 12000rpm離心lmin。⑧ 重復(fù)步驟⑦⑨ 取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一收集管中， 12000rpm離心2min。⑩ 將3S柱放入一新的1.5ml離心管中，在3S柱膜中央加入50ul水，室 溫》文置2min, 12000rpm離心lmin,離心管中液體即為質(zhì)粒。
Agarose電;永4企測(cè)。10、測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果1、 PCR擴(kuò)增結(jié)果圖4~圖6分別為HSP70、PolyLysl和PolyLys2的PCR 電泳4全測(cè)圖。2、 PCR拼接結(jié)果對(duì)HSP70和PolyLysl進(jìn)行拼接，目的片段約726bp, HSP70-PolyLysl拼 接結(jié)果見(jiàn)圖7; HSP70-PolyLysl-PolyLys2拼接產(chǎn)物見(jiàn)圖8，經(jīng)電泳4企測(cè)， 目的片4爻約810bp。3、 質(zhì)粒提取及酶切鑒定將HSP70-PolyLys 1 -PolyLys2拼接產(chǎn)物構(gòu)建到pdisplay質(zhì)粒中后，用 電泳;險(xiǎn)測(cè)所抽質(zhì)粒的完整性，pdisplay-HSP70-PolyLysl-PolyLys2質(zhì)粒電 泳結(jié)果見(jiàn)圖10, M為lkb marker; 1為抽取的質(zhì)4立。為了鑒定HSP70-PolyLysl-PolyLys2拼接產(chǎn)物是否成功構(gòu)建到pdisplay 質(zhì)粒中，首先用Blpl和ACCI酶切鑒定，pdisplay-HSP70-PolyLys1-PolyLys2 質(zhì)粒酶切鑒定圖見(jiàn)圖11， M為Marker; 1、 2、 3分別為質(zhì)粒雙酶切、未 酶切和單酶切。在雙酶切的質(zhì)粒中，在750bp以上有目的帶。4、 測(cè)序結(jié)果將提取的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，pdisplay-HSP70-PolyLysl-PolyLys2質(zhì) 粒測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖11，拼接基本正確，其中共有58個(gè)賴氨酸，前30個(gè)賴 氨酸中1個(gè)突變?yōu)榫彼?AGG),缺失3個(gè)堿基GAA導(dǎo)致1個(gè)賴氨酸 缺失。實(shí)施例4:融合基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腸癌CT26細(xì)胞及陽(yáng)性克隆鑒定已構(gòu)建成的表達(dá)膜型融合基因的載體pDisplay和空pDisplay,轉(zhuǎn)染鼠 腸癌細(xì)胞CT26。經(jīng)G418抗性篩選，獲得并擴(kuò)增陽(yáng)性克隆。具體過(guò)程如 下轉(zhuǎn)種CT26細(xì)胞24孔板3孔中，常規(guī)培養(yǎng)。次日，l(ig欲轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA，加無(wú)血清、蛋白或抗生素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至60 |_il。 混合數(shù)秒鐘。力。5(^1 SuperFect-Transfection-Reagent (QIAGEN, USA) 到DNA溶液中混合。室溫孵育10 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。同時(shí)以PBS 洗培養(yǎng)板中細(xì)胞一遍。將350 fxl RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含血清、蛋白 或抗生素)加到含轉(zhuǎn)染復(fù)合體的管中。吹吸兩次即轉(zhuǎn)移到24孔板中的細(xì) 胞中。常規(guī)孵育2—3h后，以PBS洗細(xì)胞一遍，加新鮮配置的RPMI-1640 培養(yǎng)液(含血清、蛋白或抗生素)孵育。48h后，轉(zhuǎn)染的基因開(kāi)始表達(dá)。 消化、轉(zhuǎn)種細(xì)胞，分別加入含G418 700、 800、 900、 1000、 1100、 1200|ig/ml 的培養(yǎng)基0.5ml，設(shè)對(duì)照，篩選G418抗性克隆。2 4d換液一次，當(dāng)對(duì)照 組細(xì)胞大部分死亡時(shí)，G418濃度降為200 jig/ml維持。4周后發(fā)現(xiàn)含 1200嗎/mlG418的培養(yǎng)孔，CT26細(xì)胞全部死亡，而1100嗎/ml G418的培 養(yǎng)孔，少量CT26細(xì)胞存活，有限稀釋抗性克隆轉(zhuǎn)入96孔板，抗性克隆 擴(kuò)增后供檢測(cè)。在陽(yáng)性克隆，即細(xì)胞膜表面表達(dá)polylyse-HSP70的CT26腫瘤細(xì)胞 100nl懸液中，加入使用濃度(200嗎/ml)的鼠抗HSP70單抗和鼠抗血凝 素A單抗各2|il,室溫共孵育1 h; PBS離心洗滌后，加入二抗Goat anti-mouse IgG/FITC。 4。C共孵育1 h; PBS離心洗滌，調(diào)整細(xì)胞的濃度 為lx106/ ml,留200jil送流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取1滴滴于載玻片，蓋玻片 輕蓋后四周用指甲油粘封固定。制作3張供免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀 察。以上各組均設(shè)立無(wú)修飾B16細(xì)胞、用PBS代替一抗等作空白抗體對(duì) 照。經(jīng)RT-PCR、激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)細(xì)胞的表面修 飾膜表達(dá)并結(jié)合融合蛋白PolyLyse-HSP70。結(jié)果如圖2、圖3。實(shí)施例5:腸癌細(xì)胞的5-Fu處理經(jīng)抗性篩選的基因或空載體轉(zhuǎn)染的CT-26細(xì)胞陽(yáng)性克隆在擴(kuò)增后， 即以腸癌常用化療藥氟尿嘧啶(5-Fu)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，使每毫升細(xì)胞懸液含O.Olmg 5-Fu ,進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)5天，洗滌去除細(xì)胞懸液中的5-Fu 后培養(yǎng)， 一月后重復(fù)上述過(guò)程1次。絲裂霉素lOOpg/ml在37。C處理0.5h 滅活細(xì)胞即成2組腸癌瘤苗Polylyse-HSP70的CT26 (即CCTCC NO: C200826的滅活細(xì)胞)和mock-CT26各lxl0 個(gè)細(xì)胞。實(shí)施例6:新型腸癌瘤苗的免疫效應(yīng) 1)瘤苗的細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)刺激原為lxl06/ml滅活的各種修飾細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞；增殖細(xì)胞為 lxl06/ml正常的BALB/c小鼠脾細(xì)胞。兩者各取50|lU混合加入96孔板常 規(guī)培養(yǎng)3天，用MTT比色法測(cè)定吸光值(A),以增殖指數(shù)PI表示細(xì)胞 增殖效應(yīng)；PI=實(shí)^r組A值/對(duì)照組A值。結(jié)果如下表表l:瘤苗的體外細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)PIl.PBS0.522.AntiHSP十CT隱26-polylys-HSP700. 403. CT-260.764. CT-26畫(huà)polylysHSP701.06結(jié)論體外淋巴細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示所研制的瘤苗熱休克蛋 白70和多聚賴氨酸的融合蛋白修飾的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 ) 具有強(qiáng)大的淋巴細(xì)胞增殖刺激效應(yīng)。這種作用有賴于熱休克蛋白70與受 體作用。2) NK細(xì)胞活性的檢測(cè)YAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞；處死免疫鼠，常規(guī)取脾分離淋巴細(xì)胞作為 效應(yīng)細(xì)胞。乳酸脫氯酶釋放法(LDH法)檢測(cè)NK細(xì)胞活性按試劑盒 要求將輩巴細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞、1640和NP-40分別加入各孔100|il (耙細(xì)胞 和效應(yīng)細(xì)胞均為2xl(^個(gè))，常規(guī)培養(yǎng)。1000轉(zhuǎn)/分離心取上清至新孔，加 入酶底物。置于37 。C 10 min后加終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值(A)。殺傷活性=(A殺傷孔-A靶細(xì)胞釋放孔)/ ( A靶細(xì)胞最大釋放孔-A耙 細(xì)胞釋放孔)xl00%。結(jié)果見(jiàn)圖12、圖13。結(jié)論NK細(xì)胞活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示所研制的瘤苗熱休克蛋白70 和多聚賴氨酸的融合蛋白修飾的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 )具有 強(qiáng)大的誘導(dǎo)NK淋巴細(xì)胞活性的免疫學(xué)效應(yīng)。3) CTL殺傷活性的測(cè)定將免疫鼠的脾細(xì)胞與瘤苗細(xì)胞,按1:2的細(xì)胞數(shù)比例加入96孔板(各 孔細(xì)胞數(shù)為lxlO6, lOOjil)各孔細(xì)胞數(shù)一致，孵育7天，收集懸浮細(xì)胞作 為CTL效應(yīng)細(xì)胞。以活CT26細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行4-h 51Cr釋放殺傷實(shí) 驗(yàn)CT26細(xì)胞用200 uCi Na51Cr04標(biāo)記2 h,然后細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗 3遍，靶細(xì)胞按不同的效耙比(E: T)與效應(yīng)細(xì)胞共育。取上清于y 計(jì)數(shù)儀上測(cè)cpm值。BALB/c小鼠B淋巴瘤A20細(xì)胞作為對(duì)照把細(xì)胞。 最大釋放組為靶細(xì)胞加1%SDS;自發(fā)釋放組為靶細(xì)胞加培養(yǎng)基。殺傷活 性=(實(shí)驗(yàn)組cpm -自發(fā)釋放組cpm )/(最大釋放組cpm -自發(fā)釋放組cpm) xl00%;各瘤苗免疫治療作用中的CTL活性見(jiàn)圖14,各瘤苗免疫保護(hù)作用中 的CTL活性見(jiàn)圖15。結(jié)論CTL細(xì)胞活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示所研制的瘤苗熱休克蛋白70 和多聚賴氨酸的融合蛋白修飾的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 )具有 強(qiáng)大的誘導(dǎo)CTL淋巴細(xì)胞活性的免疫學(xué)效應(yīng)。即具有誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免 疫的作用。4) 細(xì)胞因子的檢測(cè)各組鼠脾細(xì)胞與瘤苗細(xì)胞共孵育48 h,收集培養(yǎng)上清，按ELISA試 劑盒說(shuō)明，檢測(cè)上清中IFN-y、 IL畫(huà)2、 IL-4和IL-10的水平。各瘤苗免疫保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中IL-2水平見(jiàn)圖16,各瘤苗免疫保護(hù)作用 實(shí)驗(yàn)中INF-Y水平見(jiàn)圖17,各瘤苗免疫保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中IL-4水平見(jiàn)圖18， 各瘤苗免疫保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中IL-10水平見(jiàn)圖19。結(jié)論細(xì)胞因子活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，所研制的瘤苗熱休克蛋白 70和多聚賴氨酸的融合蛋白修飾的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 )具 有強(qiáng)大的誘導(dǎo)IFN-Y、 IL-2、 IL-4等細(xì)胞因子活性的免疫學(xué)效應(yīng)。5) T細(xì)胞亞群體內(nèi)刪除實(shí)驗(yàn)在瘤苗治療前5天開(kāi)始，于鼠腹腔注射相應(yīng)的阻斷抗體，l次/2天， 共5次。小鼠共分為4組，分別為IgG2b抗-CD4組；IgG2b抗-CD8組； 大鼠IgG對(duì)照組；PBS對(duì)照組。這一過(guò)程經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)，確認(rèn) 鼠外周血和脾臟中特定亞群>98%被刪除。6) 熱休克蛋白功能阻斷實(shí)驗(yàn)瘤苗在免疫小鼠之前加鼠anti-HSP70MAb至4iig/m1,室溫共孵育1 h,離心洗滌后接種到治療模型中的實(shí)驗(yàn)鼠，設(shè)立對(duì)照。具體免疫學(xué)效應(yīng) 結(jié)果詳見(jiàn)上述圖12 圖19中相應(yīng)瘤苗組。結(jié)論各免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示所研制的瘤苗熱休克蛋白70和多聚賴氨 酸的融合蛋白修飾的CT26瘤苗(CT-26-polylysHSP70 )具有強(qiáng)大的特異 性和非特異性免疫刺激效應(yīng)。這種作用有賴于熱休克蛋白70作用；阻斷 熱休克蛋白70與受體作用，可阻斷瘤苗免疫刺激效應(yīng)。實(shí)施例7:瘤苗抗肺瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以化療藥5-Fu處理后存活的CT26腸癌細(xì)胞建立移植瘤才莫型。分別 在種植移植瘤之前和之后，給予瘤苗免疫接種。觀察瘤體生長(zhǎng)和荷瘤鼠的 平均生存期。研究瘤苗對(duì)荷瘤鼠的治療作用和抗瘤攻擊的保護(hù)作用。具體 方法1)抗腫瘤攻擊的免疫保護(hù)作用小鼠分成4組，分別在皮下注射以下滅活的癌細(xì)胞或PBS，每周1 次，共3次1、 CT26-mPolyLys-HSP70 (表示膜表達(dá)融合蛋白的CT26 細(xì)胞，其它組類推)，2、空pDisplay-CT26 (空pDisplay轉(zhuǎn)染的CT26細(xì) 胞)，3、 PBS， 4、同組1 (供無(wú)關(guān)肺瘤A20攻擊)。免疫結(jié)束后，第4組用A20淋巴瘤細(xì)胞其余用CT26攻擊(野生型，5-Fu處理后存活細(xì)胞)。 1周后每組取3只處死取脾，測(cè)NK和CTL活性。余5只檢測(cè)瘤體大小 并觀察小鼠生存期。各組瘤苗對(duì)荷瘤鼠的抑瘤作用見(jiàn)圖20,各組瘤苗對(duì) 荷瘤鼠的生存延長(zhǎng)作用見(jiàn)圖21。結(jié)論所研究的瘤苗比較未修飾瘤苗，具有較強(qiáng)的抗瘤攻擊的保護(hù)作 用，即有較強(qiáng)的抗腫瘤復(fù)發(fā)作用。這種作用具有特異性(只對(duì)同種肺瘤細(xì) 胞)。2)對(duì)荷瘤鼠的免疫治療作用于小鼠右后肢皮下注射5xl()S個(gè)5-Fu處理后存活的CT26細(xì)胞第5 天將荷瘤鼠分成4組。分別注射上述4組制劑。3天1次，共4次。l周 后每組取3只鼠處死取脾，LDH釋》文法測(cè)NK活性，51Cr釋放法測(cè)CTL 活性。余5只檢測(cè)瘤體大小并觀察小鼠生存期。各組瘤苗免疫鼠的瘤體生 長(zhǎng)(瘤苗抗瘤攻擊作用)見(jiàn)圖22,各組瘤苗免疫鼠瘤攻擊后的生存(瘤 苗抗瘤攻擊作用)見(jiàn)圖23。結(jié)論所研究的瘤苗比較未修飾瘤苗，具有較強(qiáng)的對(duì)荷瘤鼠的治療作 用，這種作用具有特異性(只對(duì)同種腫瘤細(xì)胞有作用)。序列表—ST25SEQUENCE LISTING<110〉常新，黃〈120〉 PolyLyse-HSP70融合蛋白膜修飾的腸癌細(xì)胞瘤苗及其制備方法<130〉<160> 11<170> Patentln version 3.4<210> 1<211> 34<212〉 DNA<213〉 Unknown<220〉<223〉人工序列 <400〉 1gccgcggcat ggccaaagcc gctgcagtcg gcat 34<210> 2<211〉 27<212>_ DNA<213> Unknown<220〉<223〉 人工序列<■〉 2cggtcgacat ctacctcctc aatggtg 27<210> 3<211> g08<212' DM''<213> Unknown〈220><223>人工序列 〈400〉 3ggaggtagat gccgcggcgg ccaagaagaa Mag33ga3g aags肪3aga agaagaag3a 60 gaaaa3g3ag aagsagasga agaagaagaa g33g33ga幼aagaagsaga agaagMgsa 120 g33gaag333 33g3agaaga agaagaagaa aa3gaag肪g肌g肪g3ag3 3gaaa肪g33 180 gaagaagaag aa.gaagaaga aggtcgac 208〈210> 4<211> 118<212> DNA<213> Unknown<220〉<223〉人工序列 <400> 4ggaggtagat gccgcggcgg cc3agaaga3 3aagaagaag aaga肪33ga agaagaag3a 60 gas3朋g38g 33gasgaag3 3g朋g朋g33 g33g朋g3a3 aagaageiaga 3gg肪ttc 118<210> 5<211> 102<212> DNA<213> Unknown<220〉<223〉人工序列序列表—ST25<400〉 5gaattcaag3 3gMgaag肪gaa肪agasg 33gasgMg3 3ga33ei3g33 g33gaagaag 60 33gaaga紛a sgasgaagas gaag朋g紛g Mgaaggtcg sc 102<210〉 6<211> 19<212〉 腿<213〉 Unknown<220〉<223>人工序列 <柳〉6ggtgctgatc caggtgtac 19<210〉 7<^1〉 20<212> 腿<213〉 Unknown〈220〉<223>人工序列<400> 7atctacctcc tcaatggtgg 20〈210〉 8<211> <212〉18 腿<213> Unknown <220〉〈223>人工序列 <400> 8ggaggtagat gccgcggc 18<210〉 9<211〉 25〈212> 脆〈213〉 Unknown<220><223〉人工序列<400> 9ccggaattcc ttcttcttct ttttc 25<210〉 10〈211〉 21<212〉 腿<213〉 Unknown〈220><223>人工序列<400> 10ccgctctaga actagtggat c 21<210> 11〈211> 20<212> DNA<213> Unk膽n<220><223〉人工序列序列表—ST25<400〉 11cgactcacta tagggcgaat 20
權(quán)利要求
1.一種聚賴氨酸-熱休克蛋白70(PolyLyse-HSP70)融合蛋白膜修飾的腸癌細(xì)胞瘤苗，所述腸癌細(xì)胞瘤苗為跨膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26腸癌細(xì)胞，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入腸癌細(xì)胞細(xì)胞膜、HSP70端游離在腸癌細(xì)胞膜之外；所述PolyLyse為長(zhǎng)度為60～100個(gè)多聚賴氨酸肽段。
2. 如權(quán)利要求1所述的腸癌細(xì)胞瘤苗，其特征在于所述PolyLyse為長(zhǎng)度 為60個(gè)的多聚賴氨酸肽段。
3. 如權(quán)利要求2所述的腸癌細(xì)胞瘤苗，其特征在于所述PolyLyse肽段與 HSP70之間插入有3~5個(gè)丙氨酸。
4. 如權(quán)利要求1所述的腸癌細(xì)胞瘤苗，其特征在于所述腸癌細(xì)胞瘤苗為 跨膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26腸癌細(xì)胞的滅活細(xì)胞，所 述跨膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26腸癌細(xì)胞，保藏于中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏曰期 2008年6月25日，保藏編號(hào)CCTCCNO: C200826。
5. 制備如權(quán)利要求1 3之一所述腸癌細(xì)胞瘤苗的方法，所述方法包括 以跨膜型融合基因修飾腸癌細(xì)胞，使腸癌細(xì)胞跨膜表達(dá) PolyLyse-HSP70融合蛋白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入腸癌細(xì)胞 細(xì)胞膜、HSP70端游離在腸癌細(xì)胞膜之外，篩選陽(yáng)性克隆，滅活細(xì)胞， 得到所述腸癌細(xì)胞瘤苗。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法為以跨膜型融合基 因修飾腸癌細(xì)胞，使腸癌細(xì)胞跨膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入腸癌細(xì)胞細(xì)胞膜、HSP70端游離在腸癌 細(xì)胞膜之外，篩選陽(yáng)性克隆用化療藥模擬臨床治療進(jìn)行處理，處理后 的存活的細(xì)胞用絲裂霉素滅活，得到所述腸癌細(xì)胞瘤苗。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述化療藥為氟尿嘧啶，用量 為0.01mg/mL細(xì)胞懸液。
8. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法為克隆HSP70基因 的全長(zhǎng)cDNA,將HSP70基因定向克隆接入真核表達(dá)載體pDisplay中， 得到膜表達(dá)載體pDisplay-HSP70，在載體pDisplay-HSP70中的HSP70 基因粘端連接編碼4個(gè)丙氨酸和60個(gè)賴氨酸的DNA片段，得到融合 蛋白膜表達(dá)載體 pDisplay-mPolyLyse-HSP70 , 將載體 pDisplay-mPolyLyse-HSP70轉(zhuǎn)染腸癌CT26細(xì)胞，G418篩選陽(yáng)性克隆， 擴(kuò)增后，以每毫升細(xì)胞懸液加入0.01mg5-Fu的量進(jìn)朽-才莫擬臨床化療處 理，5-Fu處理后存活的CT26細(xì)胞以絲裂霉素滅活，得到所述腸癌細(xì)胞 瘤苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種聚賴氨酸-熱休克蛋白70(PolyLyse-HSP70)融合蛋白膜修飾的腸癌細(xì)胞瘤苗及其制備方法，所述腸癌細(xì)胞瘤苗為跨膜表達(dá)PolyLyse-HSP70融合蛋白的腸癌細(xì)胞，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入腸癌細(xì)胞細(xì)胞膜、HSP70端游離在腸癌細(xì)胞膜之外；所述PolyLyse為長(zhǎng)度為60～100個(gè)多聚賴氨酸肽段。本發(fā)明所提供的新型腸癌瘤苗，提供了一種免疫原性更強(qiáng)、抗腫瘤效應(yīng)更高的治療腸癌的細(xì)胞型瘤苗，對(duì)化療后轉(zhuǎn)移或耐藥的腸癌細(xì)胞更為有效，應(yīng)用于預(yù)防和治療結(jié)直腸癌，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101402942SQ20081012193
公開(kāi)日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者黃常新 申請(qǐng)人:黃常新