專利名稱：：傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌及相應(yīng)重組脂肪酶的構(gòu)建法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種傾向性水解甘油三酯sn-2位酯鍵脂肪酶工程菌及相應(yīng)重組脂肪酶的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：隨著世界經(jīng)濟(jì)水平的提高，動(dòng)物性食品的攝入增加，進(jìn)而導(dǎo)致膳食脂肪的攝入量大幅上升。中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)調(diào)查報(bào)告顯示，2002年中國居民每日油脂攝入量約為44g，所含能量占膳食總能量的35%，高于世界衛(wèi)生組織推薦的上限30%。脂肪攝入量過高，導(dǎo)致機(jī)體患肥胖、高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。這些疾病及其并發(fā)癥的治療，不但給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也帶來沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。1,3-甘油二酯(DAG)是天然油脂中的微量組成成分。眾多科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，1,3-DAG的攝入可以降低肥胖患者的體重和體脂組成，降低2型糖尿病患者血糖代謝相關(guān)指標(biāo)，例如降低其血清胰島素水平和瘦素水平等，還可降低空腹血清總膽固醇和總甘油三酯(TAG)的濃度。因此，1,3-DAG的攝入可以顯著改善因普通油脂攝入過多所導(dǎo)致的各類代謝綜合癥。同時(shí)，1,3-DAG在風(fēng)味、色澤等方面與TAG基本一致，且具有與TAG相同的能量密度和生物利用度，并對機(jī)體無任何毒副作用。鑒于1，3-DAG所具有的健康功效，其制備得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前國內(nèi)外已有多項(xiàng)關(guān)于1,3-DAG制備的專利和文章，所涉及到的方法主要有直接酯化法、甘油解法、TAG先分解后合成法和部分水解法等。直接酯化法是甘油和FA在1,3-特異性脂肪酶(米黑根毛霉脂肪酶)的催化下，直接發(fā)生酯化反應(yīng)生成1，3-DAG。該方法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)物中1，3-DAG的含量非常高，但缺點(diǎn)是所需的底物成本非常高，還需要不斷除去反應(yīng)體系中生成的水使反應(yīng)得以進(jìn)行，這增加了專利實(shí)施的難度，如中國專利CN1560020A，CN1615365。甘油解法是指在1，3-特異性脂肪酶的作用下，TAG和甘油之間發(fā)生?；D(zhuǎn)移而生成1,3-DAG。該方法所需成本較高，同樣限制了它的應(yīng)用，如中國專利CN1438308A，CN1544412A。甘油三酯先分解后合成法是指甘油三酯在蒸汽或無選擇性脂肪酶(如南極假絲酵母脂肪酶B)的作用下徹底分解生成甘油和FA，兩者在1,3-特異性水解酶的作用下酯化生成1，3-DAG。該法所需的底物成本較低，但反應(yīng)過程中需要不斷除去水分，工藝流程較為繁瑣。如果采用蒸汽對TAG進(jìn)行水解的話，天然油脂中的其它營養(yǎng)成分如維生素E、植物甾醇等遭到破話，還需向最終產(chǎn)物中重新添加此類物質(zhì)，成本相應(yīng)增加，如中國專利CN1267322A。直接水解法是指在化學(xué)催化劑或脂肪酶的作用下，TAGsn-2位酰基被直接水解下來生成1,3-DAG。如果采用化學(xué)催化劑進(jìn)行催化，水解所得產(chǎn)物中1,3—DAG含量較低，而且為了防止高溫下脂肪酸氧化，反應(yīng)需要在真空或惰性氣體的保護(hù)下進(jìn)行，增加了成本，如中國專利CN1635068A、CN1585814。如果采用脂肪酶對TAG進(jìn)行催化水解，由于目前尚未發(fā)現(xiàn)sn-2位?；禺愋运獾闹久?，導(dǎo)致產(chǎn)物中的DAG是1,3-DAG和1,2-DAG的混合物。從代謝途徑來看，1,2-DAG和TAG—樣，經(jīng)酶消化后都轉(zhuǎn)化成sn-2位的MAG和FA，二者進(jìn)入血液以后，都用于合成TAG。因此，過量攝入也會(huì)引起血脂升高等問題。南極假絲酵母脂肪酶A(CAL-A)是目前已知最具TAGsn-2位?；鈨A向的脂肪酶。專利ZL200610049242.5摸索了CAL-A水解TAG制備1,3-DAG的條件，并成功制備高1,3-DAG含量的食用油。但由于CAL-A在其原始菌株中產(chǎn)量非常低，大大限制了該方法的工業(yè)化應(yīng)用。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(P/c/nV^ortw^)具有表達(dá)量高、可對外源蛋白進(jìn)行修飾及調(diào)控表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到分子生物學(xué)界的重視，目前已經(jīng)有300多種外源蛋白在該系統(tǒng)中得到成功表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，以及利用該工程菌制備重組脂肪酶的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)、CAL-A基因的克隆以南極假絲酵母基因組為模板，利用一對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物的上游引物和下游引物分別如下上游引物(LPU):AATAAG0147TCGCGGCGCTGCCCAACCCCTACGAC，為SEQIDNO:1;下游弓l物(LPD):AAGGAAAAAAGCGGCCGCCATCGACCGTGGGAACTG;為SEQIDNO:2;2)、重組載體的構(gòu)建-利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切、連接，構(gòu)建重組載體；然后將上述重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中，通過PCR鑒定，篩選出陽性重組載體；3)、轉(zhuǎn)化將上述陽性重組載體，采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，并將其電轉(zhuǎn)進(jìn)入宿主菌中；然后采用PCR鑒定，篩選出陽性工程菌。作為本發(fā)明的傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法的改進(jìn)步驟2)中的載體為pPIC9K或pPICZa，步驟3)中的宿主菌為畢赤酵母菌GS115或X33。作為本發(fā)明的傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟2)中的PCR鑒定引物為步驟1)中的特異性引物和該載體自身的標(biāo)準(zhǔn)引物。作為本發(fā)明的傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)中的限制性內(nèi)切酶為Sa/1或&cI。作為本發(fā)明的傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)中的PCR鑒定引物為步驟1)中的特異性引物、該載體自身的標(biāo)準(zhǔn)引物、步驟l)中的特異性引物和該載體自身的標(biāo)準(zhǔn)引物的組合。本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述任意一種方法獲得的工程菌制備重組脂肪酶的方法將所得的陽性工程菌接種至BMGY培養(yǎng)基中，30T:過夜培養(yǎng)至OD6(K)為26;然后離心收集菌體，再用BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD6oo為1，每隔12h添加占總體積0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)120小時(shí)后，將培養(yǎng)液離心，得重組脂肪酶的粗酶液。作為本發(fā)明的制備重組脂肪酶的方法的改進(jìn)將重組脂肪酶的粗酶液進(jìn)行濃縮和純化，得重組脂肪酶。作為本發(fā)明的制備重組脂肪酶的方法的進(jìn)一步改進(jìn)濃縮步驟采用中空羧甲基纖維素膜，純化步驟采用離子交換層析。本發(fā)明是通過將CAL-A基因與酵母表達(dá)載體構(gòu)建重組載體，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入組氨酸缺陷型畢赤巴斯德酵母中，構(gòu)建工程菌；然后采用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，大量制備了重組CAL-A。本發(fā)明的工程菌的構(gòu)建方案可以概括成如下步驟1.從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索出編碼CAL-A的基因序列；2.設(shè)計(jì)一對特異性引物，以擴(kuò)增編碼該脂肪酶的基因序列；3.挑選合適的載體及宿主菌；4.利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切、連接，構(gòu)建重組載體；5.將重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中，通過PCR鑒定，篩選出陽性重組載體；6.提取陽性重組載體，采用合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，并將其電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母中；7.采用PCR鑒定，篩選陽性工程菌。發(fā)明人利用了所得的工程菌采用甲醇誘導(dǎo)重組酵母，考察了甲醇添加量、添加批次、誘導(dǎo)時(shí)間對重組脂肪酶產(chǎn)酶量的影響，從而優(yōu)化了產(chǎn)酶的條件。發(fā)明人采用中空羧甲基纖維素膜對重組脂肪酶的粗酶液進(jìn)行濃縮，再采用離子交換層析對粗酶液進(jìn)行純化，并研究了重組脂肪酶的最適反應(yīng)溫度和pH、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性、以及不同化學(xué)物質(zhì)對重組脂肪酶活性的影響。本發(fā)明所得的重組脂肪酶能用于水解甘油三酯食用油(TAG)，從而制備1，3-DAG;最后可用棒狀薄層色譜和高效液相色譜來檢測反應(yīng)體系中各種甘油酯的組成比例。甘油三酯食用油為動(dòng)物油、植物油、微生物油、動(dòng)物油精煉脂肪、植物油精煉脂肪和微生物油精練脂肪中的至少一種；植物油可選用菜籽油、大豆油、棉籽油、玉米油、亞麻籽油、紅花籽油、棕櫚油、椰子油、橄欖油、米糠油、葵花籽油、茶籽油、花生油、可可酯或類可可酯；動(dòng)物油可選用牛油、羊油、豬油、魚油或乳酯。綜上所述，本發(fā)明的方法是一種在畢赤巴斯德酵母表達(dá)系統(tǒng)對CAL-A進(jìn)行表達(dá)的方法。與現(xiàn)有的技術(shù)和專利相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.采用酵母分泌型載體PPIC9K等為載體，與目的基因片段構(gòu)建重組載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)入組氨酸缺陷型畢赤巴斯德酵母中。誘導(dǎo)過程中，重組脂肪酶分泌進(jìn)入培養(yǎng)基中，可直接離心收集，避免了胞內(nèi)酶所需的難度較大的酵母細(xì)胞破壁過程。2.分泌型載體PPIC9K自身分泌的雜蛋白較少，有利于所得重組脂肪酶的純化。實(shí)驗(yàn)證明，誘導(dǎo)表達(dá)的上清僅需中空羧甲基纖維素膜超濾濃縮和離子交換層析兩步純化，即可得到電泳純的重組脂肪酶。3.所得重組脂肪酶最適反應(yīng)溫度比原始脂肪酶有所提高。原始脂肪酶的最適反應(yīng)溫度約為50-70度，而重組脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為75度。4.所得重組脂肪酶對重金屬離子的毒害作用具有一定的抵抗性。在所有測試的金屬離子中，只有Hg+離子對重組脂肪酶的活性具有較強(qiáng)的抑制作用。5.所得重組脂肪酶對甘油三酯sn-2位酰基水解的傾向性比原始脂肪酶略高。6.所得工程菌誘導(dǎo)過程簡單，僅用價(jià)格低廉的甲醇即可進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，生產(chǎn)成本較低。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明的重組脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)曲線圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、一種傾向性水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、CAL-A基因的克隆選用pPPIC9K上的￡coRI和iVwI為限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對特異性引物。上游引物(LPU):AATAAG0^47TCGCGGCGCTGCCCAACCCCTACGAC下游引物(LPD):AAGGAAAAAAGCGGCCGCCATCGACCGTGGGAACTG以Camfetoa加ar"!'ca基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系如下Buffer(無Mg2+)5^L、Mg2+溶液5^L、dNTP溶液4|aL、上游弓l物1|aL、下游弓l物1^L、模板1、Taq酶0.5^L，加水補(bǔ)足50pL。擴(kuò)增條件如下95°C5min;94°C1min，65°C1min，72°C1min，30個(gè)循環(huán)；72。C保溫10min。擴(kuò)增完畢后，采用Takara公司的試劑盒(TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer.2.0)進(jìn)行純化。2)、重組載體的構(gòu)建'使用限制性內(nèi)切酶￡coRI和油/1分別對pPIC9K和上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切體系如下pPIC9K或PCR產(chǎn)物30nL、10xBuffer10pL、五coRI2pL、M&I2|liL，加水補(bǔ)足lOO)aL。30。C酶切3h后，采用步驟l)中的試劑盒進(jìn)行純化。將雙酶切的pPIC9K和PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系如下PCR產(chǎn)物lpL、pPIC9K1iliL、10XBuffer1pL、DNA連接酶0.5pL，加水補(bǔ)足10^L。對照連接體系中的PCR產(chǎn)物用水替代。16'C連接12h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5a。轉(zhuǎn)化步驟如下1.向100nL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中加入5|aL連接體系，混勻并冰浴30min;2.將感受態(tài)細(xì)胞放置于42'C的水浴鍋中，精確保溫45s。3.將感受態(tài)細(xì)胞冰浴1min，然后加入600|xLLB培養(yǎng)基，立即放入37。C水浴鍋中保溫5min，再將其放入37'C搖床中，劇烈振蕩培養(yǎng)1h;4.吸取200pL，涂布于含Kan抗生素的LB平板，37。C進(jìn)行培養(yǎng)，直到長出單菌落。采用菌落PCR法對篩選平板上的單菌落進(jìn)行鑒定。在PCR鑒定以前，挑取單個(gè)菌落于0.3ml含抗生素培養(yǎng)基的1.5ml離心管中，37'C搖床培養(yǎng)至培養(yǎng)基微渾，然后以該培養(yǎng)液為模板進(jìn)行PCR鑒定，PCR體系及流程同步驟1)。采用步驟l)中的一對特異性引物、pPIC9K載體的標(biāo)準(zhǔn)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增(這是為了確保正確性，因此僅僅使用上述任意一種引物也是可以的)，并利用瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。若PCR擴(kuò)增出與編碼脂肪酶的基因片段大小一致的條帶(即步驟l)中的PCR條帶的大小)，則表明該菌落為陽性轉(zhuǎn)化子。挑取該陽性重組子于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并大量提取重組載體。3)、畢赤酵母的轉(zhuǎn)化采用限制性內(nèi)切酶Sa/I對上述重組載體進(jìn)行酶切線性化，酶切體系同步驟2)，并將其與80pLGS115感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴5min后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)條件為1.5KV下電擊5ms。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，立即加入lml冰預(yù)冷的山梨醇溶液并將菌體混勻，轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，然后將菌體懸液涂布于MD平板上，每200pL涂布一塊平板，30。C培養(yǎng)，直至長出單菌落。挑取單菌落，分別點(diǎn)到MM和MD平板上，以鑒定重組轉(zhuǎn)化子的表型。在MD平板上生長正常而在MM平板上生長緩慢的為Muts型，在MD和MM平板上均生長正常的轉(zhuǎn)化子為Mut+型。挑取Mut+型重組子于YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并以其基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，鑒定流程同步驟l)。分別采用步驟l)中的一對特異性引物、pPIC9K載體的標(biāo)準(zhǔn)引物、一條特異性引物和一條標(biāo)準(zhǔn)引物為組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增(這是為了確保正確性，因此僅僅使用上述任意一種引物也是可以的)，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增出目的片段大小條帶(即步驟1)中PCR產(chǎn)物大小)的轉(zhuǎn)化子即為陽性轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例2、一種利用實(shí)施例1所獲得的工程菌制備重組脂肪酶的方法，采用酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)，具體步驟如下將實(shí)施例1所得的陽性轉(zhuǎn)化子接種至BMGY培養(yǎng)基中，30。C過夜培養(yǎng)至OD6QQ為2到6，然后離心收集菌體。將所得的菌體用BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD6oo為1，每隔12h添加占總培養(yǎng)液體積0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24小時(shí)取1.5ml培養(yǎng)液離心，上清即為重組脂肪酶的粗酶液。誘導(dǎo)持續(xù)至第5天停止。實(shí)施例3、采用氫氧化鈉滴定法測定脂肪酶活性聚乙烯醇橄欖油乳化液的制備向100mL超純水中加入4g聚乙烯醇，微波加熱溶解，成聚乙烯醇溶液。然后將聚乙烯醇溶液與橄欖油以4:1(w:w)的比例混合，高速組織勻漿機(jī)攪拌3次，每次lmin，間隔3min;得聚乙烯醇橄欖油乳化液。脂肪酶活性測定步驟如下在三角燒瓶中加入0.025mol/L，pH7.5的磷酸緩沖液5mL和聚乙烯醇橄欖油乳化液4mL，40。C水浴5min。然后加入實(shí)施例2所得的1mL粗酶液，反應(yīng)15min，加入95%乙醇15mL終止反應(yīng)，再加入酚酞指示劑3滴。用0.05mol/L氫氧化鈉滴定至溶液成粉紅色，減去空白消耗的氫氧化鈉。將每分鐘分解橄欖油釋放1pmol游離脂肪酸所需酶量定義為1個(gè)脂肪酶活單位(U)[136]。酶液的酶活可用以下公式計(jì)算酶液活力_消耗的氫氧化鈉的體積(mL)x0.05x1000具體內(nèi)容如圖l所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長，發(fā)酵液上清中重組脂肪酶的活性逐漸升高，到第5天時(shí)，發(fā)酵液上清中的酶活達(dá)到10.68U/mL，而原始Ow^faa"torc"ra中脂肪酶A幾乎檢測不到。實(shí)施例4、重組脂肪酶的純化采用中空纖維膜對實(shí)施例2所得的粗酶液進(jìn)行超濾濃縮，超濾膜的截流分子量為10kD。當(dāng)酶液濃縮至較小體積時(shí)，不斷加入25mmol/L的磷酸緩沖液，對濃縮液進(jìn)行透析洗滌。離子交換層析使用DEAE-cellulose介質(zhì)。先用20mmol/LpH6.0的磷酸緩沖液進(jìn)行平衡，然后將用20mmol/LpH6.0的磷酸緩沖液透析好的濃縮酶液施于離子交換柱上端，之后用00.5mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速為2mL/min。收集所有的洗脫液，間隔10管測定酶活性，并采用SDS-PAGE進(jìn)行檢測，將只有重組脂肪酶條帶的收集管進(jìn)行合并，得純的重組脂肪酶。實(shí)施例5、重組脂肪酶的性質(zhì)1)、重組脂肪酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性在308(TC范圍內(nèi)，以1(TC為梯度，測定不同溫度下的酶活。當(dāng)測得最適溫度后，再加測最適溫度加減5T時(shí)的酶活。以測定酶活最高時(shí)溫度下的酶活力定義為100%,計(jì)算其它溫度下酶的相對活性。將酶液在3080'C下，以IO'C為梯度保溫30min后，再于40。C下測定其活力。以在O。C下保存的脂肪酶活力定義為100%，計(jì)算其他溫度下處理后酶的相對剩余活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為75度，比原始脂肪酶(50-70°C)略高；重組CAL-A具有很好的熱穩(wěn)定性，只有當(dāng)環(huán)境溫度超過70'C時(shí)，才會(huì)對其活性產(chǎn)生影響。而原始脂肪酶在60"C以下具有較好的穩(wěn)定性。2)、重組脂肪酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性在pH3.010.0的緩沖液中，40。C下測定該脂肪酶活性。以測定酶活力最高時(shí)pH值下的酶活定義為100%，計(jì)算其它pH值下的相對活性。將重組脂肪酶液分別在pH3.010.0的相應(yīng)緩沖液體系中25'C保存16h，再于4(TCpH7.5下測定其酶活，做出酶的相對活力曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組脂肪酶的最適反應(yīng)pH為7，與原始脂肪酶相同；重組脂肪酶在pH4-8的范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，與原始脂肪酶基本一致。3)、不同化學(xué)物質(zhì)對重組脂肪酶活性的影響將酶液加入到含不同化學(xué)物質(zhì)的溶液中于25'C處理30min，然后在磷酸緩沖液反應(yīng)體系中測定酶活。以水為對照物，計(jì)算其它化學(xué)物質(zhì)對脂肪酶活力的影響。結(jié)果如下表1所示表l、不同化學(xué)物質(zhì)對重組脂肪酶活力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例6、重組脂肪酶對甘油三脂sn-2位酯鍵水解能力的測定向油水比為3:1(w/w)的混合液中添加2%的重組脂肪酶(油w%)，60'C反應(yīng)35h后，反應(yīng)體系中U-DAG的含量約為13.60%,1,2(2,3)-DAG的含量為4.73%。由此可見，重組脂肪酶水解TAGsn-2位?；哪芰κ撬鈙n-l(3)位酰基能力的2.83倍，比原始脂肪酶高(原始脂肪酶為1.84倍)最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若千個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表SEQIDNO:1aataaggaattcgcggcgctgcccaacccctacgac36SEQIDNO:2aaggaaaaaagcggccgccatcgaccgtgggaactg3權(quán)利要求1、一種傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟1)、CAL-A基因的克隆以南極假絲酵母基因組為模板，利用一對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異性引物的上游引物和下游引物分別如下上游引物AATAAGGAATTCGCGGCGCTGCCCAACCCCTACGAC，下游引物AAGGAAAAAAGCGGCCGCCATCGACCGTGGGAACTG；2)、重組載體的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切、連接，構(gòu)建重組載體；然后將上述重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中，通過PCR鑒定，篩選出陽性重組載體；3)、轉(zhuǎn)化將上述陽性重組載體，采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，并將其電轉(zhuǎn)進(jìn)入宿主菌中；然后采用PCR鑒定，篩選出陽性工程菌。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟2)中的載體為pPIC9K或pPICZa，步驟3)中的宿主菌為畢赤酵母菌GS115或X33。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟2)中的PCR鑒定引物為步驟l)中的特異性引物或該載體的標(biāo)準(zhǔn)引物。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟3)中的限制性內(nèi)切酶為S"/I或SacI。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟3)中的PCR鑒定引物為步驟l)中的特異性引物、該載體的標(biāo)準(zhǔn)引物或步驟l)中的特異性引物和該載體的標(biāo)準(zhǔn)引物的組合。6、利用權(quán)利要求15中任意一種方法獲得的工程菌制備重組脂肪酶的方法，其特征是將所得的陽性工程菌接種至BMGY培養(yǎng)基中，30'C過夜培養(yǎng)至OD6oo為26;然后離心收集菌體，再用BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD6o。為1，每隔12h添加占總體積0.5。/。的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)120小時(shí)后，將培養(yǎng)液離心，得重組脂肪酶的粗酶液。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備重組脂肪酶的方法，其特征是將重組脂肪酶的粗酶液進(jìn)行濃縮和純化，得重組脂肪酶。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備重組脂肪酶的方法，其特征是所述濃縮步驟采用中空羧甲基纖維素膜，所述純化步驟采用離子交換層析。全文摘要本發(fā)明公開了一種傾向水解TAGsn-2位酯鍵酶工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)CAL-A基因的克隆；2)重組載體的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切、連接，構(gòu)建重組載體；然后將重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌中，通過PCR鑒定，篩選出陽性重組載體；3)轉(zhuǎn)化將陽性重組載體采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，并將其電轉(zhuǎn)進(jìn)入宿主菌中；然后采用PCR鑒定，篩選出陽性工程菌。本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述方法所得工程菌制備重組脂肪酶的方法。本發(fā)明所得的重組脂肪酶能用于水解甘油三酯食用油。文檔編號C12N1/19GK101407819SQ20081012229公開日2009年4月15日申請日期2008年11月17日優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日發(fā)明者張治國,徐同成,鐸李申請人:浙江大學(xué)