專利名稱：5′核苷酸酶診斷試劑盒及5′核苷酸酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5'核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定5'核苷 酸酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5'-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見 于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢 性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏 感性高于堿性磷酸酶。因為5'-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒 肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測 定5'-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。5'-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強酸測磷 法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法 為5'-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過離子交換層析柱分析結(jié) 果，求得5'-核苷酸酶活性。或者利用5'-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生 無機磷，再用化學(xué)強酸法分析無機磷含量得以計算出5'-核苷酸酶的活性。同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此 難以切實推廣應(yīng)用。無機磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準確度不好，強酸 污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定5'，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的5'核苷 酸酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行5，核苷酸酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。本發(fā)明5'核苷酸酶活性濃度測定方法原理如下核苷單磷酸+水5'核苷酸酶核苷+磷酸根磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酸+輔酶谷氨酸合成酶谷氨酰胺+ 2-酮戊二酸酯+還原型輔酶核苷可以是腺苷、肌苷、尿苷。這種方法應(yīng)用5'核苷酸酶(5'Nucleotidase; EC3丄3.5)酶(偶)聯(lián)谷氨酰胺 合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3.1.2)、谷氨酸合成酶(glutamate synthase; EC1.4丄13)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。5'核苷酸酶酶解核苷單磷酸反應(yīng)產(chǎn)生磷酸 根，再通過(偶)聯(lián)合谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶的作用，最終將輔酶 (在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)， 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處 吸光度上升的速度，可以測算5'核苷酸酶的活性濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明5'核苷酸酶診斷試劑較為理想緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L谷氨酰胺合成酶 6000 U/L谷氨酸合成酶 8000 U/L核苷單磷酸 9 mmol/L谷氨酰胺 12 mmol/L腺苷二磷酸 6 mmol/L本發(fā)明的5'核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、核苷單磷 酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶。 輔酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二 磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸合成酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶。 輔酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定5，核苷酸酶活性濃度的方法，其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L谷氨酰胺合成酶 6000 U/L谷氨酸合成酶 8000 U/L核苷單磷酸 9 mmol/L谷氨酰胺 12mmol/L 腺苷二磷酸 6 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5'核苷酸酶樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約l分鐘左 右，檢測時間2分鐘左右，理論K值4180。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃 度大小。 實施例二本實施例的5'核苷酸酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L3 mmol/L核苷單磷酸 9 mmol/L谷氨酰胺 12mmol/L 腺苷二磷酸 6 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑谷氨酰胺合成酶 谷氨酸合成酶試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測5'核苷酸酶樣品與試劑100 mmol/L 500 mmol/L6000 U/L8000 U/L1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大 約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃 度大小。 實施例三
本實施例的5，核苷酸酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
核苷單磷酸 谷氨酰胺 腺苷二磷酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
谷氨酸合成酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體」
100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 9 mmol/L 12 mmol/L 6 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L
:試劑，可以直接使用。測定5，核苷酸酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反
應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測5，核苷酸酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5'核苷酸酶的活性濃 度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0006;吸光 度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達500 U/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±4%;試劑測試的精密度(重 復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑在2—8X:下保存，活性可以穩(wěn)定一年;
——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣 應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5’核苷酸酶活性濃度測定方法，其方法原理如下核苷單磷酸+水 5′核苷酸酶 核苷+磷酸根磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸 谷氨酰胺合成酶 氨離子+ 谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酸+輔酶 谷氨酸合成酶 谷氨酰胺+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶核苷可以是腺苷、肌苷、尿苷。將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出5’核苷酸酶的活性濃度大小測定結(jié)果。
2. —種5'核苷酸酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液20-——500 mmol/L穩(wěn)定劑l一—4000 mmol/L輔酶1—6 mmol/L谷氨酰胺合成酶1000—-80000 U/L谷氨酸合成酶1000———80000 U/L核苷單磷酸1-50 mmol/L谷氨酰胺卜50 mmol/L腺苷二磷酸1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、核苷單磷酸、 谷氨酰胺、腺苷二磷酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、核苷單磷酸、 谷氨酰胺、腺苷二磷酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、 核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸組成；試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、 谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶組成。輔酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合 成酶、核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸在試劑1或試劑2中的位置可 以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、核苷單磷酸、 谷氨酰胺、腺苷二磷酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、 核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸組成；試劑.2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、 谷氨酸合成酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶組成。 輔酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二 磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述5'核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l"4000mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的5′核苷酸酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定5′核苷酸酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、核苷單磷酸、谷氨酰胺、腺苷二磷酸、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出5′核苷酸酶的活性濃度大小。
文檔編號C12Q1/68GK101609007SQ200810122820
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司