專利名稱：：一種在大腸桿菌-鏈霉菌-假單胞菌之間穿梭表達(dá)的bac載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一個(gè)在大腸桿菌一鏈霉菌一假單胞菌三個(gè)宿主之間穿梭表達(dá)的BAC載體，以及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：微生物是臨床使用的藥物的主要來源。1981年至2006年間，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的34%的小分子藥物是微生物來源的天然產(chǎn)物或其直接的半合成衍生物；總共155個(gè)抗癌藥物中，47%是天然產(chǎn)物或其直接的半合成衍生物。隨著微生物分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，越來越多的微生物基因組被解析，微生物基因組資源的充分利用成為微生物藥物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。在諸多的基因工程手段中，生物合成基因蔟的異源表達(dá)被證明是迄今最為有效的。異源表達(dá)在針對(duì)常規(guī)方法難以或不能培養(yǎng)的生理活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的遺傳操作、對(duì)產(chǎn)量極低而通常發(fā)酵難以進(jìn)行的化合物的研究、因結(jié)構(gòu)復(fù)雜而使得化學(xué)合成難以進(jìn)行或因收率極低而不能運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)的化合物的研究等等方面，均有著其它方法無可比擬的優(yōu)越性。大腸桿菌(E.coli)，鏈霉菌(Streptomyces)和假單胞菌(Pseudomonas)是最為常見的三種生物合成基因蔟異源表達(dá)的宿主菌。三者各有其優(yōu)點(diǎn)。大腸桿菌是最為通用的宿主菌，生長(zhǎng)迅速，克隆和表達(dá)體系完善，目的產(chǎn)物的提取，分離和純化工藝成熟高效。但缺點(diǎn)是不產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成所需的多種小分子前體，且由于其基因組的GC。/u含量與鏈霉菌差異較大，表達(dá)鏈霉菌來源的生物合成基因蔟的效率難以預(yù)測(cè)。鏈霉菌是次級(jí)代謝產(chǎn)物來源的微生物藥物的最主要來源，約70%來源于此。模式菌株Streptomyceslividans(變鉛青鏈霉菌)的操作較為簡(jiǎn)易，但菌體倍增時(shí)間長(zhǎng)(約4小時(shí)，而大腸桿菌為17分鐘)，產(chǎn)物分離純化較大腸桿菌困難。假單胞菌異源表達(dá)系統(tǒng)在近年發(fā)展日趨成熟，假單胞菌已成為首選的宿主菌之一。其優(yōu)點(diǎn)包含假單胞菌與鏈霉菌GC。/。含量以及密碼子的使用頻率相近、有翻譯后修飾(即?；D(zhuǎn)移蛋白的磷酸泛酰乙胺化)、安全無毒(如模式菌株惡臭假單胞菌Pseudomonasputida)、生長(zhǎng)快速(倍增時(shí)間與大腸桿菌相仿)、DNA轉(zhuǎn)化效率高、次級(jí)代謝產(chǎn)物背景清晰。缺點(diǎn)是在提供復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物所需的多種小分子前體方面不全面。生物合成基因蔟在這三個(gè)宿主間共同表達(dá)可以相互補(bǔ)充，而在尋找未知的，大量的基因蔟的表達(dá)的最優(yōu)化條件方面尤為有效。異源表達(dá)生物合成基因蔟已有許多成功的例子。如與紫杉醇作用模式相同、而藥效更強(qiáng)的抗癌藥物epothilone在其生物合成基因簇的被闡明后，已在鏈霉菌和粘球菌等異源宿主菌中得以大量表達(dá)。這就克服了原始產(chǎn)生菌纖維堆囊菌繁殖時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)量低、菌種選育難以進(jìn)行等缺點(diǎn)。epothiloneD即將在美國(guó)和歐洲完成m期臨床實(shí)驗(yàn)，前景非?？春?，有望成為紫杉醇的換代產(chǎn)品。微生物Prochloronsp.產(chǎn)生環(huán)肽類化合物Patellamide和ascidiacylamide，但由于其遺傳操作難以進(jìn)行，克隆化合物的生物合成基因蔟一直不能成功。Long等首先Prochloronsp.容量為50kb的基因組片段克隆至大腸桿菌一鏈霉菌穿梭表達(dá)BAC載體pPAC-S1，構(gòu)建了BAC文庫(kù)。此文庫(kù)在大腸桿菌DH10B中表達(dá)后，分離得到了Patellamide和ascidiacylamide,產(chǎn)量分別可達(dá)77mg/1和94mg/l。相應(yīng)的表達(dá)克隆即包含化合物的生物合成基因蔟，這就克服了原始產(chǎn)生菌遺傳操作難以進(jìn)行的困難。Pe皿等在鏈霉菌StreptomycelividansTK64中表達(dá)了128kb的克隆在BAC載體pStreptoBACV上的daptomycin生物合成基因蔟，d叩tomycin是抗耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，抗萬古霉素的金黃色葡萄球菌等病源菌的環(huán)酯肽類抗生素。這是迄今異源表達(dá)的最大片段。通過發(fā)酵工程等手段，表達(dá)產(chǎn)量達(dá)20-55mg/l。Wenzel等在假單胞菌PseudomonasputidaKT2440中表達(dá)了粘細(xì)菌Stigmatellaaurantiaca來源的Myxochromide生物合成基因蔟，兩天后發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了40mg/ml，相應(yīng)的原株七天發(fā)酵產(chǎn)量?jī)H為8mg/ml。這就解決了的Myxochromide化合物來源不足而藥效學(xué)研究難以進(jìn)行的問題。由于次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因蔟常常較大(數(shù)十至上百千堿基對(duì))，常規(guī)的克隆載體以及粘粒載體(cosmid),fosmid等由于容量有限(最大可達(dá)45千堿基對(duì))而不能在一個(gè)載體中涵蓋完整的生物合成基因蔟，而生物合成基因蔟分布在兩個(gè)甚至逐個(gè)載體上則牽涉載體的抗性篩選標(biāo)記，載體的不相容性以及DNA之間、蛋白質(zhì)之間相互作用效率可能受影響等問題。BAC(BacterialArtificialChromosome)載體，即細(xì)菌人工染色體載體，由于其具有可克隆大片段(多至350kb)、所克隆的外源片段可在宿主內(nèi)穩(wěn)定存在(不發(fā)生缺失，擴(kuò)增，重組)等特點(diǎn)而成為克隆和異源表達(dá)的首選載體之一。但通常使用的BAC載體為單拷貝(1-2個(gè)分子/細(xì)胞)，這樣在進(jìn)行DNA操作以及獲取足夠量的DNA方面有著許多困難。而且，迄今的BAC載體多為在大腸桿菌中進(jìn)行操作，缺乏可在大腸桿菌，鏈霉菌和假單胞菌三個(gè)宿主之間穿梭表達(dá)BAC載體。BAC載體己逐漸成為異源表達(dá)的常規(guī)載體，因此，發(fā)展有效的BAC載體可以大大提高異源表達(dá)的效率，增加高通量篩選的成功率。Sosio等將attP-int-tsr基因盒克隆至pCYPAC2，構(gòu)建了首個(gè)克隆鏈霉菌基因的BAC載體pPAC-Sl和pPAC-S2(基因盒的方向不同)。attP位點(diǎn)可與鏈霉菌基因組上的attB位點(diǎn)進(jìn)行特異性整合，int為催化整合反應(yīng)的整合酶，tsr為硫鏈絲菌素抗性基因，作為在鏈霉菌中的篩選標(biāo)記。不足的是，以蔗糖作為負(fù)篩選標(biāo)記有一定的假陽性(約5%);硫鏈絲菌素難以獲得；且只能在鏈霉菌中進(jìn)行基因表達(dá)。表達(dá)daptomycin的pStreptoBACV的詳細(xì)信息未公布。Martinez等構(gòu)建了大腸桿菌一鏈霉菌一假單胞菌的穿梭表達(dá)載體pMDB13和pMDB14。它們共同的特征是含有int-attP-Am-oriT基因盒，及保留了起始BAC載體pBleoBACl1的氯霉素抗性基因。在假單胞菌中的表達(dá)是通過attP和工程菌P.putidaMBD1基因組上的attB位點(diǎn)整合而實(shí)現(xiàn)。P.putidaMBD1是將含有attB位點(diǎn)，卡那霉素抗性基因和較大載體部分的DNA片段整合至P.putidaKT2440的基因組而獲得。pMDB13含一個(gè)pUC的填充片段，pMDB14含有LacZ部分以利于克隆外源基因。利用此載體，他們成功地建立了高通量的克隆，種間基因轉(zhuǎn)移，表達(dá)和篩選的體系。三個(gè)已知化合物(藍(lán)色色素MGl.l，紫色色素Granaticin及具有抗菌活性的2，4-diacetylphloroglucinol)的基因蔟得以表達(dá)。缺點(diǎn)是載體或仍為單拷貝；或沒有明顯的篩選重組克隆的標(biāo)記；且改造后的假單胞菌基因組中帶有較多外源基因，可能影響克隆在載體上的基因的表達(dá)效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一個(gè)在大腸桿菌，鏈霉菌和假單胞菌三個(gè)最常見的異源表達(dá)宿主之間進(jìn)行穿梭表達(dá)的BAC載體。所說的BAC載體，其含有pUC18的復(fù)制子、氨芐青霉素抗性基因、接合轉(zhuǎn)移片段oriT、整合位點(diǎn)attP、整合酶基因int、阿普霉素抗性基因、假單胞菌的PP一0423'基因的5'端、假單胞菌的crp基因、BAC載體的redF基因、BAC載體的復(fù)制區(qū)OriS、BAC載體的repA基因、BAC載體的sopA基因、BAC載體的sopB基因、BAC載體的sopC基因、BAC載體的cos位點(diǎn)和BAC載體的loxP位點(diǎn)。pUC18的復(fù)制子(ori)，序列如SEQNO.l;氨芐青霉素抗性基因(Ap)，序列如SEQNO,2;接合轉(zhuǎn)移片段(oriT)，序列如SEQN0.3;整合位點(diǎn)(attP)，可整合至鏈霉菌基因組的attB位點(diǎn)；序列如SEQN0.4;整合酶基因(int)，序列如SEQN0.5;阿普霉素(Am)抗性基因，序列如SEQN0.6;假單胞菌的PP—0423'基因的5'端，序列如SEQN0.7;假單胞菌的crp基因，序列如SEQN0.8;BAC載體的redF基因，序列如SEQN0.9;BAC載體的復(fù)制區(qū)OriS,序列如SEQNO.10;BAC載體的repA基因，序列如SEQNO.l1;BAC載體的sopA基因，序列如SEQN0.12;BAC載體的sopB基因，序列油SEQN0.13;BAC載體的sopC基因，序列如SEQN0.14;BAC載體的cos位點(diǎn)，序列如SEQNO.15;BAC載體的IoxP位點(diǎn)，序列如SEQN0.16。更具體的是，所說的BAC載體是pESPBAC，其具有SEQNO.17所示的序本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明所說的BAC載體的構(gòu)建方法。詳細(xì)構(gòu)建途如下。首先將pUC18以BamHI酶切后克隆至pECBACl的BamHI位點(diǎn)，得到pEPUBAC。將pEPUBAC上BglII2.1kb片段克隆至pIJ2925的BgUI位點(diǎn)，得到克隆pBG2。將pBG上的Xbal位點(diǎn)以T4DNA聚合酶和dNTP進(jìn)行補(bǔ)平，這樣即去除了XbaI位點(diǎn)，得到克隆pBG2-2。將pBG-2上BglII2.1kb片段克隆至pEPUBACBglII酶切的8.0kb大片段，選取基因方向與pEPUBAC—致的克隆，命名為pEXPUBAC。將來源于pSET152的阿普霉素抗性基因(Am)片段克隆至pKS(-)，得到克隆pAM。將來源于P.PuditaKT2440的PP一0423'基因的5'端和crp基因片段至pKS(-)，得到克隆pCrp。將Am片段和PP一0423'-crp克隆至pKS(-)，得到Am-PP—0423'-crp基因盒的克隆pAC。以PCR的方法擴(kuò)增pAC上的Am-crp-PP一0423'基因基因盒和pSET152上的oriT-attP-int基因盒，將DNA片段以Dpnl酶處理以消除模板DNA后，回收目的片段。將pEXPUBAC轉(zhuǎn)化至含重組酶質(zhì)粒pSC101-gbaA-Tc的大腸桿菌HS996。將兩個(gè)DNA片段共轉(zhuǎn)化至以L-阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的HS996/pSC101-gbaA-Tc+pEXPUBAC,以阿普霉素和氨芐青霉素做為篩選標(biāo)記，在37°C下進(jìn)行篩選，將獲得的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化E.coliDH10B的感受態(tài)細(xì)胞以純化質(zhì)粒，最終得到目的載體pESPBAC。以一系列的酶切證明后，再設(shè)計(jì)測(cè)序引物對(duì)pESPBAC進(jìn)行克隆片段的測(cè)序，所得結(jié)果與預(yù)期完全一致。本發(fā)明所說的穿梭表達(dá)BAC載體。具有以下特點(diǎn)l.其載體上的oriT片段同時(shí)供轉(zhuǎn)移至假單胞菌和鏈霉菌。attp位點(diǎn)用來整合至鏈霉菌基因組的attB位點(diǎn)，而非必須基因crp部分可以通過同源重組而整合至假單胞菌的基因組。這樣，克隆在pESPBAC載體上的DNA片段在大腸桿菌中以游離質(zhì)粒形式存在而進(jìn)行表達(dá)，在鏈霉菌和假單胞菌中則為整合至基因組上進(jìn)行表達(dá)。2.保留了BAC載體克隆大片段(可多至350kb)的特點(diǎn)。保留了LacZ，這樣可以使用藍(lán)白斑篩選重組克隆。3.pUC18作為填充片段克隆至BamHI位點(diǎn)，使得BAC載體由單拷貝(1-2個(gè)分子/細(xì)胞)變?yōu)楦呖截?500-700個(gè)分子/細(xì)胞)，這樣基因操作如常規(guī)克隆載體一樣簡(jiǎn)便易行。填充片段可以通過BamHI切除，所得片段即為克隆大片段BAC載體。4.去除了原載體pECBACl—個(gè)多余的XbaI位點(diǎn)，這樣通過位于載體的多克隆位點(diǎn)上克隆片段兩側(cè)的、鏈霉菌基因組上酶切位點(diǎn)較少的限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI將克隆片段切出，通過電泳來鑒定克隆片段大小。5.阿普霉素作為pESPBAC轉(zhuǎn)化至大腸桿菌一鏈霉菌一假單胞菌三個(gè)宿主的共同篩選標(biāo)記。因此，pESPBAC能在大腸桿菌一鏈霉菌一假單胞菌三個(gè)宿主之間穿梭表達(dá)。本發(fā)明從構(gòu)建基因文庫(kù)最常用的BAC載體之一pECBACl出發(fā)，將異源表達(dá)的必需原件加以有效地綜合和優(yōu)化，充分運(yùn)用了常規(guī)的分子生物學(xué)手段以及在基因克隆方面有突出優(yōu)勢(shì)的重組工程等策略，并綜合運(yùn)用常規(guī)的基因克隆和重組工程等手段，成功地構(gòu)建了在大腸桿菌，鏈霉菌和假單胞菌三個(gè)最常見的異源表達(dá)宿主之間進(jìn)行穿梭表達(dá)的BAC載體pESPBAC，為異源表達(dá)生物合成基因蔟以及高通量篩選方面提供了方便。圖1是pESPBAC構(gòu)建的示意2是pESPBAC的結(jié)構(gòu)示意3是pESPBAC酶切的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)yHindIII:23.1kb,9.4kb，6.6kb,4.4kb,2.2kb，2.0kb2.pESPBAC/BamHI:11.0kb,2.7kb3.pESPBAC/BglII:11.6kb,2.1kb4.pESPBAC/Hindlll:11.2kb,1.5kb,1.0kb5.pESPBAC/Sphl:9.5kb,3.5kb,0.7kb6.pESPBAC/XhoI:11.2kb，1.5kb,0.7kb7.pESPBAC/Xbal:13.8kb具體實(shí)施方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例中所用到的質(zhì)粒，均為已公開載體-pUC18(Norrander,J.，Kempe,T.andMessing，丄(1983)"ConstructionofimprovedMl3vectorsusingoligodeoxynucleotide-directedmutagenesis."Gene26(1):101-106)，本實(shí)施例中所用pUC18購(gòu)自NEB公司。pECBACl(Frijters,Aetal.(1997)."ConstructionofabacterialartificialchromosomelibrarycontaininglargeEcoRIandHindIIIgenomicfragmentsoflettuce".TheorApplGenet94(3):390-399.)，本實(shí)施例中所用pECBACl來自美國(guó)RichardMichelmore教授。pBluescriptKS(-)(Alting-Mees,M.A.andShort,J.M.(1989)."pBluescriptII:genemappingvectors".NucleicAcidsRes.17(22):9494.)，本實(shí)施例中所用pBluescriptKS(-)購(gòu)自Novagen公司。pIJ2925(Janssen，G.R.andBibb，M.J(1993)."DerivativesofpUC18thathaveBglIIsitesflankingamodifiedmultiplecloningsiteandthatretaintheabilitytoidentifyrecombinantclonesbyvisualscreeningofEscherichiacolicolonies".Gene124(1):133-134)，本實(shí)施例中所用pIJ2925來自英國(guó)JohnInnesInstitute,MervinBibb教授。pSET152(Bierman，M.，R.Logan，etal.(1992)."PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolitoStreptomycesspp."Gene116(1):43-49.)，本實(shí)施例中所用SET152來自英國(guó)JohnInnesInstitute,DavidHopwood教授。pSC101-gbaA-Tc(Zhang，Y.，F(xiàn).Buchholz，etal.(1998)."AnewlogicforDNAengineeringusingrecombinationinEscherichiacoli".NatGenet20(2):123-8.);本實(shí)施例中所用pSC101-gbaA-Tc來自德國(guó)DresdenUniversity的YoumingZhang博士。crp基因和PPJ)423'基因的5'端來自假單胞菌PseudomonaspuditaKT2440,為模式菌株，基因組測(cè)序文獻(xiàn)Nelson,Ketal.(2002)."CompletegenomesequenceandcomparativeanalysisofthemetabolicallyversatilePseudomonasputidaKT2440".Environ,Microbio.4(12):799-808;本實(shí)施例中所用PseudomonaspuditaKT2440來自美國(guó)KellerNelson教授。實(shí)施例l:參見圖l,將pUC18，Am,Crp,PP一0423'，int，attP,OriT等基因或片段以常規(guī)的分子生物學(xué)手段和重組工程手段克隆至pECBACl,并去除pECBACl上氯霉素抗性基因部分。dECBAC1和dUC18相連獲得髙拷貝的BAC載體pEPUBAC將pECBACl禾QpUC18均以BamHI酶切，乙醇沉淀后，溶于適量雙蒸水，以T4DNA連接酶在16°C下連接過夜，連接液轉(zhuǎn)化E.coliDH10B的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布至含氯霉素12.5pg/ml,50^g/ml氨芐青霉素，20pg/mlIPTG和40pg/mlXgal的LB固體平板上，370C培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，正確的克隆命名為pEPUBAC。dEPUBAC多克隆位點(diǎn)外的Xbal位點(diǎn)的去除采用的策略是先將pEPUBAC上含Xbal位點(diǎn)的2.1kb的BglII片段克隆至pIJ2925(pUC18的衍生載體，其多克隆位點(diǎn)兩側(cè)均為BglII位點(diǎn))，得到pBG2。以Xbal酶切pBG2，乙醇沉淀后，溶于適量雙蒸水，加入T4DNA聚合酶和dNTP，使得Xbal位點(diǎn)的序列TCTAGA變?yōu)門CTAGCTAGA，這樣即去除了Xbal位點(diǎn)。測(cè)序證明序列正確后，將所得克隆命名為pBG2-2。將pBG-2上BglII2.1kb片段克隆至pEPUBACBglII酶切的8.0kb大片段，，酶切驗(yàn)證克隆方向正確后，得到pEXPUBAC。pEXPUBAC只有在多克隆位點(diǎn)上由單一Xbal位點(diǎn)。Am-crp-PP0423'基因盒的構(gòu)建以pSET152為模板，設(shè)計(jì)引物A1:5'-AAAGGATCCGGTTCATGTGCAGCTCCATCAG-3'，A2:5'-GGGCTCCAGTCACCATCGACTGGCGAGC-3',分別在5'端和3'端引入BamHI和Pstl位點(diǎn)(以下劃線表示)，PCR擴(kuò)增0.9kb的阿普霉素抗性基因(Am)片段，以BamHI和PstI酶切后，克隆至pKS(-)相同位點(diǎn)，測(cè)序正確后，得到克隆pAM。提取P.PuditaKT2440的基因組DNA，并以之為模板，設(shè)計(jì)引物Cl:5'-GGGCTGCAGTGTGATGTGCTGCGCGAGTGG-3',C2:5'-GGGGAATTCATGGTTGCCTCCGCCCTACCC-3'，分別在5'端和3'端引入Pstl和EcoRI位點(diǎn)(以下劃線表示)，PCR擴(kuò)增1.0kb的PP—0423'基因的5'端和crp基因片段，以Pstl和EcoRI酶切后，克隆至pKS(-)相同位點(diǎn)，測(cè)序正確后，得到克隆pCrp。將BamHI和Pstl酶切pAM所得的0.9kb阿普霉素抗性基因片段、Pstl和EcoRI酶切pCrp所得的l.Okb的PP—0423'基因的5'端和crp基因片段與BamHI和EcoRI酶切的pKS(-)進(jìn)行三片段連接，轉(zhuǎn)化，篩選質(zhì)粒，酶切正確的克隆命名pAC，pAC即包含Am-crp-PP0423'基因盒。以上50plPCR反應(yīng)體系33pidH205pl10xPCR反應(yīng)緩沖液1.25nllOmMdNTP1.5pl上游引物(終濃度0.75^M)1.5nl下游引物(終濃度0.75pM)2^1模板(質(zhì)粒100ng，基因組DNA200ng)0.5^1pfu聚合酶(5U/|al)PCR反應(yīng)條件95°C變性5分鐘，(95。C45秒，60°C1分鐘，72°C2分鐘)，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘。使用儀器為Bio-rad公司的PTC-200型號(hào)的PCR儀。反應(yīng)結(jié)束后，以加入20mg/ml的溴乙錠(EB)染料的0.7%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。含重組酶質(zhì)粒pSC101-gbaA-Tc的大腸桿菌HS996的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備將在-7(TC凍存的HS996/pSC101-gba-tet劃線于含10pg/ml四環(huán)素的LB固體平板上，30。C培養(yǎng)20小時(shí)以上。挑取單菌落至10mllOpg/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基，于30°C過夜振蕩培養(yǎng),12，000rpm，4°C離心3分鐘，棄上清，以10%的甘油洗滌沉淀兩次，最后懸浮于100^的10%的甘油中。dEXPUBAC的轉(zhuǎn)化將約lOOngpEPUBAC加至50pl冰上融化的HS996/pSC101-gbaA-Tc的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻。將混合液轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的lmm電轉(zhuǎn)池中，電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件lmm電轉(zhuǎn)池，200Q,1300V，Bio-Rad公司GenePulserIIR電轉(zhuǎn)化儀。加lmlLB液體培養(yǎng)基至電轉(zhuǎn)池，吹打混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè)無菌的1.5mleppendorf管中，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘后，轉(zhuǎn)化液涂布與含100pg/ml氨芐青霉素和10pg/ml四環(huán)素的LB抗性平板上，30°C培養(yǎng)20小時(shí)以上。所獲菌株為HS996/pSC101隱gbaA-Tc+pEXPUBAC。HS996/pSC101-gbaA-Tc+pEXPUBAC電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備將在-7(TC凍存的菌株劃線于含100pg/ml氨芐青霉素和10pg/ml四環(huán)素的LB抗性平板，30°C培養(yǎng)20小時(shí)以上。挑單菌落至2ml含100pg/ml氨芐青霉素和10pg/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基，于30°C振蕩過夜培養(yǎng),按1/50的體積轉(zhuǎn)接至20ml同樣的培養(yǎng)基，30"C振蕩培養(yǎng)，至OD260為0.2時(shí)，加入終濃度為0.15%的L-阿拉伯糖，37°C振蕩培養(yǎng)至OD260為0.4時(shí)，12，000rpm,4°C離心3分鐘，棄上清，以10%的甘油洗滌沉淀兩次，最終懸浮于200^110%的甘油中。重組工程法構(gòu)建目的BAC載體本發(fā)明釆用重組工程法中的"三片段克隆法"來對(duì)靶載體進(jìn)行改造。兩個(gè)片段同時(shí)克隆至靶載體并去除載體相應(yīng)部位的"三片段克隆"的策略是上下游兩個(gè)片段分別在其5'和3'引入與靶載體的同源臂("同源臂"即序列相同的一段寡核苷酸)，上游片段的3'端和下游片段的5'端之間也引入同源臂，同源臂是通過PCR引入的。在大腸桿菌體內(nèi)，L-阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)，重組酶催化三個(gè)同源臂之間的的DNA重組。經(jīng)過篩選，即可得到目的克隆。本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的PCR引物如下。SP1:5'隱77^770GC7CG7^GC4爿CCJCGa;r7T^4GCCC4CC^47^C7UCC7T^4CCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGG-3'，前50個(gè)堿基(斜體)為與pEXPUBAC氯霉素抗性基因3'端，3397nt-3346nt序列相同的同源臂，后面為擴(kuò)增pSET152oriT部位的序列。SP2:5'-CL4CGCCGC7^CGrC7TCCGrGCCGrCCTGGGCGrCG7UrrCG7UGrCGrC-3'，此51個(gè)堿基(斜體)為pSET152整合酶(int)3'端的序列。SP3:5'-a4Ca4Ca4Ca^a4Ca4CGCCC4G04CGGC4CGa4^a4CGL4GCGGCG7^GGGTTCATGTGCAGCTCCATCAG-3'，前51個(gè)堿基(斜體)為SP2的反向互補(bǔ)序列，后面為擴(kuò)增Am-crp-PP0423'基因盒5'的序列。SP4:5'-CCGGGC777T7T04Grarca4G^mTC4GGv4GC7X4GGX4GCL14ATGGTTGCCTCCGCCCTACCC-3'，前50個(gè)堿基(斜體)為與pEXPUBACredF和氯霉素抗性基因5'端之間，4107nt-4156nt序列相同的同源臂，后面為擴(kuò)增Am-crp-PP0423'基因盒3'端的序列。以pSET152為模板，引物SP1和SP2擴(kuò)增2.4kb的oriT-attp-int基因盒，以pAC為模板，引物SP3和SP4擴(kuò)增2.6kb的Am-crp-PP0423'基因盒。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在溶液中加入1/10倍體積的pH5.2的醋酸鈉溶液和2.5倍體積的4。C預(yù)冷的無水乙醇，混勻沉淀，離心去上清，室溫干燥后，溶于雙蒸水。分別加入20U的Dpnl酶，37。C，處理4小時(shí)，以消除模板DNA后，膠回收目的片段。最后將溶于DNA10mMpH8.0的Tris.Cl(三羥甲基氨基甲烷,以濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0),OD260測(cè)定DNA濃度，調(diào)節(jié)濃度為300ng/pl。將0.3ug的oriT-attp-int基因盒DNA片段和0.3ug/的Am-crp-PP0423'基因盒DNA片段共轉(zhuǎn)化至L-阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶表達(dá)HS996/pSC101-gbaA-Tc+pEXPUBAC。在共同培養(yǎng)基中加入50pg/ml阿普霉素和100pg/ml氨芐青霉素加以篩選，所得的質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化E.coliDH10B的感受態(tài)細(xì)胞加以純化，最終得到目的載體pESPBAC，其質(zhì)粒圖譜見圖2，酶切驗(yàn)證的結(jié)果見圖3。pESPBAC全長(zhǎng)13791bp，其序列如SEQN0.17所示，其中792-1380'.pUC18的復(fù)制子(ori);1551-2411:氨芐青霉素抗性基因(Ap);3447-3558:接合轉(zhuǎn)移片段(0riT);3906-3944:整合位點(diǎn)(attP),可整合至鏈霉菌基因組的attB位點(diǎn);3961-5802:整合酶基因(int);5923-6699:阿普霉素(Am)抗性基因；6705-7065:假單胞菌的PP—0423'基因的5'端；7062-7706:假單胞菌的crp基因；7795-8271:BAC載體的redF基因；8650-8716:BAC載體的復(fù)制區(qū)OriS;9049-9804:BAC載體的repA基因；10392-11558:BAC載體的sopA基因;11558-12592:BAC載體的sopB基因；12602-13075:BAC載體的sopC基因；13334-13733:BAC載體的cos位點(diǎn)；13751-13784:BAC載體的loxP位點(diǎn)。重組工程法所克隆片段的測(cè)序驗(yàn)證設(shè)計(jì)測(cè)序引物S1-S5，對(duì)克隆片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證明與預(yù)期完全一致。S1-S5的序列如下。SI:5'AATTTCTGCCATTCATCCGCT-3'S2:5'-CGGGCATTTCAGCGAAGCGCC-3'S3:5'-GATTGCGGACCGATCATCGAG-3'S4:5'-GCGTAGGGTTCATGTGCAGCT-3'S5:5'-TGTGATGTGCTGCGCGAGTGG-3'。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>cagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccag780cgtttctgggtgagc幼saacagg幼ggcs3犯tgccgcasaa犯ggg8at33gggcg3c840acggaaatgttg犯tactcat861<210>3<211>112<212>DNA<213>人工序列<400〉3ccggccagcctcgcagagcaggsttcccgttgagcaccgcc鄉(xiāng)tgcg犯t卿ggscag60acacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccgg112<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<400〉4gcccc犯ctggggtaacctttgagttctctC3gttgggg39<210>5<211>1842<212>DNA<213>人工序列<400〉5gggttgtgaccggggtggaceicgtacgcgggtgcttacgaccgtcagtcg60cgcgagcgcgag肌tttgagcgceigcaagcccagcgacacagcgtagcgcc犯cgaagac120卿gcggccgaccttcagcgCg卿tCg3gcgcgacgggggccggttcaggttcgtcggg180catttcagcg卿cgccgggC3CgtCggCgttcgggacggcgg鄉(xiāng)gcccggagttcg幼240cgcatcctga3Cg犯tgCCgcgccgggcggctcaacatgatcattgtctatgacgtgtcg300cgcttctcgcgcctg卿gtcatggacgcgattccgattgtctcgg肌ttgctcgccctg360ggcgtgscg3ttgtttccactcaggaaggcgtcttccggc鄉(xiāng)ga肌cgtC3tgg8CCtg420attcacctgattatgcggctcgacgcgtcgcttcgctg犯gtcggcgaag4808ttctcgeicsicgaagaaccttcagcgcgaattgggcgggtElCgtCggCgggaaggcgcct540tetcggcttcgagcttgtttcgagatcacgcgcaacggccgaatggtcaat600gtcgtcatc&ac犯gcttgcgcactcgaccactccccttaccggacccttcgagttcgag660cccgacgtaatccggtggtggtggcgtgagatc犯gacgctcccttcaag720ccgggcagtcaagccgccattcacccgggc3gC3tC3Cggggctttgt犯gcgC￡Ltggac780gctggicgccgtgccgacccggggcg卿cg3ttggg3卿agaccgcttcaagcgcctgg840gacccggcaaccgttatgcgaatccttcggg3CCCgCgt3ttgcgggcttcgccgctgag900gtgatct8C3ag肌g犯gccggscggcscgccgaccacga卿ttggigggttaccgcatt960cagcgcgacccgatcacgctccggccggtcgagcttgattgcggaccgatcatcgagccc1020gctgagtggt3tgagcttcaggcgtggttggacggcagggggcgcggc肌ggggctttcc睡cgggggc卿ccattctgtcCgCC3tgg3C幼gctgtactgCg3gtgtggcgccgtcatg11403CttCg犯gCgcgggga卿3tCg3tC肌ggactcttaccgctgccgtcgccgg卿gtg1200glxgacccgtccgcacctgggcagcacg犯ggcacgtgcaacgtcagcatggcggcactc1260gac犯gttcgttgcggaacgcatcttcaacaagatcaggc3CgCCg卿gcg犯ga柳g1320acgttggcgcttctgtggga3gCCgCCCg3cgcttcggcaagctcactgaggcgcctgag1380卿agcggcg犯cgggcg犯ccttgttgcgg8gcgcgccgacgccctgaacgcccttgaa1440g3gCtgt3Cgaagaccgcgcggcaggcgcgtacgacggacccgttggcagga兆cacttc1500cgg卿c犯c鄉(xiāng)cagcgctgacgctccggceigc3aiggggcgga卿gcggcttgccgaa1560cttgaagccgccgaagccccgaagcttccccttgaccaatggttccccgaagacgccgac1620gCtg3CCCg3ccggccct犯gtcgtggtgggggcgcgcgtcagtagacgacaagcgcgtg1680ttcgtcgggctcttcgtagac犯gatcgttgtcacgaagtcgactacgggcagggggcag1740gg犯cgcccatcg卿agcgcgcttcgatcacgtgggcgaagccgccgaccgacgacga^c麵ga卿cgacgccc鄉(xiāng)acggcacggaagacgtagcggcgt兆1842<210>6<211>777<212>DNA<213>人工序列〈400〉6gtgcaatacgaatggcga犯agccgagctcatcggtcagcttctcaaccttggggttscc60cccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggcccctCg卿3tggg120ccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccggg鄉(xiāng)gacgctcgtcatg180ccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccg240gaccttggagttgtctctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccat300ccatttgcctttgcggcagcggggccacaggc卿gc柳tcatctctgatccattgccc360ctgccacctcactcgcctgc犯gcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggta420cttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgatggca480aaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggc肌gttggtacgc540gtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtggctc600gccttc兆幼gg鄉(xiāng)gtCC3gtcggtcatgcctttgctcggttgatccgc660tcccgcgacattgtggcgacagccctgggtc犯ctgggccgagatccgttgatcttcctg720catccgccag鄉(xiāng)cgggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggCtg3777<210>7<211>361<212>DNA<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonaspudita)〈400>7gtgtggitgtgctgcgcgsgtggggcggcgt3gCgtC3gtCgggga犯tcgacggggcctt60ctgcgatggcCgCt3C犯Cgtcaacctc犯tggccgca肌ttggtgggtsccgcccagcg120ctggcgtcagggcctgggtggc犯gcgtccggtggtgctggtgcacggtgcgctgctgct180ggac咖gagcgtgagtcgatggtggcggcggtcaaccgcttc犯cgagtgctgtgsgct240gg鄉(xiāng)幼cgctgtcgcgccgatgcgcacatcgccttgcacg卿tggcgccggtagcacc300ttggttcgsgcgcctttcgcaggcctacgcC犯ggt3Ctggccgagttgcccaaggacta360g361<210>8<211>645<212>DNA<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonaspudita)<400〉8Ct3gCgggt3ccgtggaccaccatggtcttgcctttgacctgcaccaggctgcgttcctc60gagatccttg柳acgcggccgaccatttcccgagagc幼ccgacgattcggccgatttc120ctgacgggtaatcttgatttgcatgccatcggggtgggtc8tggCgtCgggctgcttgca180C3gttCC3gC3ggC咖gggcaactcgcccggtcacgtcgaatcgccaac240cttgcgcgtagtgttgcgcaggcgctgggccatctggctacccagggcatagagg3tttc300cgggtcctggcgcgccagctcgcgaaacttctcgtagctgatttcggccacttcgcattc360tgtcttggcgcactgcgctgctgctcgccatcaacgggctcg朋caggcc420tagctcgccaaaga犯tcgccatggttgaggtaggcgatgatcatttcatggccgtcgtc■gtcctcgatg3gg3tggtgElccgaacccttgatgatgaacgacagtgtctcggcccggtc540gccggcgcagatg3t3ttgcttttggcggtgt柳ggcggcgctggc柳gtaccagc8g600cttgtcgatgttctttatcttggcgggt兆ggCgg3ggC61645<210>9<211>477<212>DNA<213>人工序列<400>9ttacgtgccgatcaacgtctcattttcgcca犯eigttggcccagggcttcccggtatcaa60cagggacaccaggattteitttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcgc120tgg3gcggcgtaaccgtcgcacagg卿gaceLgaga犯gcgcggstctgg180gaagtgscggacagaacggtcaggacctgg3ttgggg鄉(xiāng)cggttgccgccgctgctgct240gscggtgtgacgttctctgttCCggtC3C3ccacatacgttccgccattcctatgcgatg300C3C8tgCtgt8tgCCggt3taccgctg犯agttctgcaaagcctgatgggacataagtcc360atcagttcaacggaagtctscacgaaggtttttgcgctggatgtggctgcccggcaccgg420gtgcagUtgcgatgccggagtctgstgcggttgcgatgctga犯c犯ttatcctga477<210>10<211>67<212>DNA<213>人工序列<400>10agggcg卿cCCtCg3gtg8gcgagg卿cagcacttatatattctgctt60acficacg67<210>11<211>756<212>DNA<213>人工序列<400〉11C柳ggtt3tcaatcac犯gatsgcccgcgaatcgtccag60tc犯acgacctcactgaggcggC3城3gtctctcccgggatcaaaaacgtatgctgtat120ctgttcgttgaccagatcagaaaatctgatggcaccctaceigg犯catg3cggtatctgc180g3g3tCC3tgttgCt犯3t3tgctgaaatattcggattgacctctgcgga3gCC3gt犯g240gatatacggcaggcattgaagagtttcgcgggg卿g卿tggttttttatcgccctgaa3003ggCt3tg犯tcttttccttggttt3tC朋acgtgcgcac360agtccatccagagggctttacagtgtacat3tcaacccatatctcattcccttctttatc420gggtt3C卿accggtttacgC3gtttCggCtt3gtg3犯caccaatccg480tatgccstgcgtttatecgaatccctgtgtcagtatcgtaagccggatggctcaggcatc540gtctctctgaaaatcgactgg3tc3tagagcgttaccagctgcctcaaagttaccagcgt600atgcctgacttccgccgccgcttcctgcaggtctgtgttacagcag犯ct660ccaatgcgcctctcatacataaaggccgccagacgactcatatcgtattt720tccttccgcgatatcacttccatgacgacaggst3g756<210〉12<211>1167<212>DNA<213>人工序列〈400〉12taaccagtgc3t犯acgctggtcstga朋tgacgaaggct60atcgccattgcax^gttt犯tgatgacagcccgg卿cgagg肌肌taacccggcgctgg1203g肌t郷tgaagcagcggatttagttggggtttcttctc解gctatcagageitgccgag180犯agc鄉(xiāng)gcgactaccgcacccggatatgg3犯ttCg3gg3Cgggttg8gc犯cgtgtt240t犯tcatatgcgtgatgtgtttggtacgcgattgcgacgt300gctgs卿cgtatttccaccggtgstcggggttgctgccccgtttacaaa360acctcagtttctgttcatcttgCtC3gg3tctggctctgaaggggctscgtgttttgctc420gtggaaggta￡LCg￡LCCCCCagggaacagcctcaatgtatcacggatgggtaccagatctt480catattcatgcagaagacactctcctgcctttctatcttggggaa犯ggscgatgtcact540agcccacttgctggccggggcttgac3ttattccttcctgtctggctctg600caccgtattgaatgggca幼tttgatgaaggta幼ctgcccaccgatcca660cacctgeitgctccgsctggcceittgaaactgttgctcatgactatgatgtcat3gttatt720gacagcgcgcctaacctgggtatcggcacg3tt肌tgtCgtatgtgctgctgatgtgctg780attgttcccacgcctgctgagttgtttgactacacctccgcactgcagtttttcgatatg840cttcgtgatctgctcaeig肌cgttgatctt幼兆ggttcg3gCCtg3tgtacgtattttg900cttacca犯tacagc肌tagt犯tggctctcagtccccgtgg3tggaggagc犯attcgg960gatgcctggggaagcatggttctaaaaaatgttgtacgtg犯acggatgsagttggtaaa1020ggtcagatccggatg卿actgtttttgaacaggccattgatcaacgctcttcaactggt翻gcctgg卿aatgctctttctatttgggaacctgtctgcaatga犯ttttcgatcgtctg1140gctggg卿t1167<210>13<211>972<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉13Atg卿cgtgcgcctgttattccaaaacat3cgctcaatactcaaccggt60tcgtteitcg3caccagctgcCCCg3tggtggattcgttaattgcgcgcgtaggagt肌tg120gctcgcggtaatgccattactttgcctgtatgtggtcgggatgtgaagtttactcttg幼180gtgctccggggtgatagtgttgag幼gacctctcgggt8tggtcaggt肌tg肌CgtgfLC240csggagctgcttactgaggacgcactggatgatctcatcccttcttttctactgactggt300cggcgttcggtcg犯gagtatctggtgtcatag朋attgccgatgggagt360cgccgtcgta肌gctgctgcagtgattatcgtgttctggttggcg3gctg420gatgatg3gc,tggctgcttgggtaacgattatcgccc犯c犯gtgct480t3tg犯CgtggtcagcgttatgC肌gCCg3ttgcagaatgaatttgctggaaatatttct540gcgctggctgtatttcacgtcccgctgtatcaacaccgcc600aaattgccta犯tC3gttgttgctcttttttctcaccccggtg33Ct3tCtgcccggtca660ggtg3tgC3Cttcaaaaagcctttacagat幼agagg犯ttacttaagcagcaggcatct720aaccttcatg3gCtggggtgtatcactctt780ttaacttctgtgcttaaaacgtcatctgcatcaagaactagtttaagctcacg3catcag840tttgctcctgg鄉(xiāng)gglC3gtggcgataaaatggtgcttaacctggacagg900tctcgtgttcC犯Ctg3gtgtatagag肌aattgaggccfittcttaaggaacttgaaafLg960ccagcaccct972<210>14<211〉474<212>DNA<213>人工序列〈400〉14ggcctgaatattctctctgggcccactgttccacttgtatcgtcggtctgataatcag犯60tgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtcccac120tcgtatcgtcggtctgattsttagtctgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctga180taeitc3gactgggsccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggacca240tggtcccactcgtatcgtcggtctgattatt3gtCtgggflccacggtcccactcgtatcg300tcggtctgattattagtctgg犯ccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagt360ctgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctg3ttattagtctgggaccacgatccca420<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>ttt犯gggC3ccaataactgccttaaccggccagcctcgc卿gC3gg3ttcccgttgag3480caccgccaggtgcgaatsagg33gg幼C3Cccgctcgcgggtgggcctac3540ttcacctatcctgcccggctgacgccgttggga肌gtctacetcgaaccct3600ttggcaaaatcctgtatatcggatggatattcgctataat3660gaccccgaagC鄉(xiāng)gtt3tggatccgtcgacctgcaggcatgcaagctct3720agcgattccag3CgtCCCg3鄉(xiāng)cgtggcgcggcttccccgtgccggagcaatcgccctg3780ggtgggtt8CacgacgcccctctatggcccgUctgacgggccccggcgg3840caaccctcagcggatgccccggggcttcacgttttcccaggtc卿agcggUttcggga3900gtagtgcccc犯Ctggggt33CCtttg3gttctctcagttgggggcgtagggtcgccgsc3960atgacacaaggggttgtgaccggggtggsc3Cgt3CgCgggtgcttacgaccgtcagtcg4020cgcgagcgcg3g幼tttgagcgcagcaagcccagcgacac3gcgt鄉(xiāng)gcc犯cgaagac4080犯ggcggccgaccttcagcgCg犯gtCg3gCgCg3Cgggggccggttraggttcgtcggg4140catttcagcgaagcgccgggcacgtcggcgttcgggacggcggagcgcccggagttcgaa4200CgC3tCCtg38Cg犯tgCCgcgccgggcggctcaacatgatcattgtctatgacgtgtcg4260cgcttctcgcgcctgaaggtC3tgg3CgCgattccgattgtctcggaattgctcgccctg4320ggcgtgacgattgtttccactcagg朋ggcgtcttccggc鄉(xiāng)g肌3Cgtcatggacctg4380attcacctgsttatgcggctcgacgcgtcgcacaaagaatcttcgctg肌gtcggcgaag4440attctcgacacgaagaaccttcagcgcgaattgggcgggtacgtcggcgggaaggcgcct4500tacggcttcgagcttgtttcgg卿cg犯ggagatcacgcgcaacggccg肌tggtcaat4560gtcgtcatca3C幼gCttgCgcactcgaccactccccttaccggacccttcgagttcgag4620cccgacgt犯tccggtggtggtggcgtgagatcaagacgctcccttcaag4680ccgggcagtcaagccgccattcacccgggc3gC3tC3Cggggctttgtaagcgcatggac4740gCtg￡LCgCCgtgccgacccggggcg卿cgattggga卿agaccgcttcaagcgcctgg4800gacccggc肌ccgttatgcgaatccttcggg3CCCgCgt3ttgcgggcttcgccgctgag4860gtgatctac8ggacggcacgccgaccacga卿ttgagggttaccgcatt4920cagcgcgacccgatcacgctccggccggtcgagcttgattgCgg3CCg3tcatcgagccc4980gctgsgtggt3tg3gCttC3ggcgtggttgg3CggC鄉(xiāng)gggcgcggc肌ggggctttcc5040cgggggc卿ccattctgtccgccatggacgcgagtgtggcgccgtcatg5100acttcgaagcgcgggga卿atcgatcaaggactcttaccgctgccgtcgccgga鄉(xiāng)tg5160gtcgacccgtccgcacctgggCRgC3Cg朋ggcacgtgcaacgtcagcatggcggcactc5220gsc犯gttcgttgcgg犯cgcatcttcaac犯g3tC8lggC3CgCCg犯ggcgacga卿g5280acgttggcgcttctgtggga3gCCgCCCg3cgcttcggcaagctcactgaggcgcctgag5340a卿gcggcgaacgggcg犯ccttgUgcggagcgcgccgacgccctg幼cgcccttgaa5400gagctgtacgaagaccgcgcggc鄉(xiāng)cgcgt3Cg3Cgg3Cccgttggcaggaagcacttc5460cgg肌gc犯caggcagcgctgacgctccggcagc肪ggggcggaagagcggcttgccg肌5520cttg犯gccgccgaagccccg犯gcttccccttgaccaatggttccccgaageicgccgac5580gctgaicccggiccggccct犯gtcgtggtgggggcgcgcgtcagtagacgsc卿cgcgtg5640ttcgtcgggctcttcgtagacaagatcgttgtcacg幼gtcgactacgggcagggggcag5700ggaacgccceitcgsg卿cgcgcttcgatc3CgtgggCg3agccgccgacCg3Cg3Cg3C5760g卿3Cg3Cgcccaggacggcacgg犯gacgt3gcggcgtagggttC3tgtgcagctcca5820gggatgat犯gtttatcaccaccgactatttgC犯C3gtgccgttgatcg5880tgctatgatcg3Ctg3tgtCatC鄉(xiāng)ggtggsgtgc冊(cè)tgtcgtgc犯t8cg犯tggcga5940aaagccgagctcatcggtcagcttctcaacCttggggtt3cccccggcggtgtgctgctg6000gtccacagctccttccgtagcgtccggcccctcg犯gatgggccacttggactgatcgag6060gccctgcgtgctgcgctgggtCCggg3gggacgctcgtcatgccctcgtggtc鄉(xiāng)tctg6120gacgacg兆ccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtctct6180gacacattctggcgcctgcccgcagcgcccatccatttgcCtttgCggC36240gcggggccscaggc卿gceLgatcatctctgatccattgcccctgccacctcactcgcct6300gcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggc郷tacttctcctcggcgtggga6360cacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtg6420CCg3g8C3Ctgcaccattcttcaggatggc犯gttggtocgcgtcgattatctcgag朋t6480geiccactgctgtgagcgctttgccttggcgg織ggtggctcaaggag犯gagccttcag6540卿ga鄉(xiāng)tccagtcggtcatgcctttgctcggttgatccgctcccgcgacattgtggcg6600acagccctgggtc犯ctgggCCg3g8tCCgttgatcttcctgcatccgcc鄉(xiāng)ggcggga6660tgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggctgactgceigtgtgatgtgctgcgc6720gagtggggcggcgt柳gtc兆tcggggaaatcgscggggccttctgcgatggccgctac6780aacgtcaacctc犯tggccgcaaattggtgggtsccgcccagcgctggcgtcagggcctg6840ggtggcaagcgtccggtggtgctggtgcacggtgcgctgccgagcgtgag6900tcgatggtggcggcggtc犯ccgcttcaacgagtgctgtgacgctgtcgc6960gccgstgcgcacatcgccttgC3Cg犯gtggcgccggtagcaccttggttcgagcgcctt7020tcgc鄉(xiāng)cctacgcc犯ggtactggccgagttgcccaaggactagcgggt3CCgtgg3CC70803CC3tggtCttgcctttgacCtgC3CC3ggctgcgttcctcgagatccttg卿3CgCgg7140ccgaccatttCCCg3g3gC33CCg3Cg3ttcggccgatttcctgacgggtaatcttgatt7200tgC3tgCC3tcggggtgggtC3tggCgtCgggctgcUgcacagttccagcaggc幼cgg7260gc冊(cè)ctcgcccggtcacgtcgaa犯atgcca犯tcgccaaccttgcgcgt3gtgttgCgC7320鄉(xiāng)cgctgggccatctggctacccagggcaccgggtcctggcgcgccagc7380tcgcgaaacttctcgtagctgatttcggccacttcgcattctgtcttggcgcgtacccag7440gcactgcgctgctgctcgccatc犯cgggctcgaacaggcctagctcgccaBaga犯tcg7500ccatggttgaggtaggcgatgatcatttcatggccgtcgtcgtcctcgatgaggatggtg7560accgaacccttgatgatg犯cgacagtgtctcggcccggtcgccggcgcagatgatattg7620cttttggcggtgtsgcggcggcgctggcagtgtaccagcagcttgtcgatgttctttatc7680ttggcgggtagggcggaggcaaccatttagcttccttagctcctg肌aat7740caaaaaatacgcccggt兆tgatcttatttC3ttatggtg朋agttggaacctcttacgt7800gccgatc犯cgtctcattttcgcca犯agttggccc郷gcttcccggtatcaaceiggga7860caccaggatttatttattctgcg犯gtgatcttccgtcactcgcgataag7920CtC3tgg兆Cggcgt咖cgtCgC8C3gg3卿CgCgg8tctggg犯gtg7980CggtC3gg8CCtgg3ttggggsggcggttgccgccgctgctgctgacggt8040gtgacgttctctgttccggtacgttccgccattcctatgcgatgcacatg8100ctgtatgccggtataccgctg犯兆ttctgc犯agcctgatgggacfit犯gtccatcagt8160tc犯cgg^gtctacacg犯ggtttttgcgctggatgtggctgcccggceiccgggtgcag8220tttgcgatgccggagtctgatgcggttgcgatgctgaaacaattatcctg8280ccttggcctttatatgga犯tgtggaactgagtgg3tatgctgtttttgtctgttaaaca8340g卿3gCtggctgttatccactgag鄉(xiāng)cgaacgaaacagtcgggaaaeitctcccattat8400cgtagagatccgcattattaatctcaggagcctgtgtagcgtt"Ut8ggaagtsgtgttc8460tgtC3tg3tgcctgcaagcggtaacg肌肌cgatttg朋tatgccttcaggaac肌taga8520aatcttcgtgcggtgttacgUg卿tggagcggaUatgtcagc犯tggacagaac犯c8580Ct冊(cè)tg幼C3cagaacc3tgatgtggtctgtccttttacagccagtagtgctcgccgcag8640tcgagcgacagggcg卿ccctcgsgtgeigcgagg卿caCC8ggg犯C3gcEicttateit8700attctgcttagatatttttaggcctttatctgacaaatcaaattgccctcatttagtgtggCggtt3tC8actg鄉(xiāng)cgggc他atatggC3ttg犯g3gggctttacacggtttacgctt3t3Cg犯tatcg3ctggacgccgccgcttcatacsttgatcacttccagtcacstttgtgcatggattgtttgtcacagttcgtcatcgtgtgtacctgagctatctgtacacggctgccttttgtagttgttgttgcggatgttcagcccggcgctgg卿tgccgsagcaacgtgtgattgcgacggcgtttacaagtgttUgcttaccagatct3Cg8tgtC3CgtctggctctccaccgatcctcatagttetctgatgtgctttttcgatattacgtattttcacacgatgctaattattttC3tgCtggttccctcaaatgag朋g犯gctatcac犯g犯catatagtctaattctgatgggtttcgcggggctetg犯tcgtgtacatatagtttcggctccctgtgtcatcatagagcgtcctgcaggtttctgacctattctcatactgttgatttccattgatgaggCt3CCtgg3gacagaacagtcggc卿cgctgttgctctttttgcagtaaaatg肌actcta/tcgccattg肌agc鄉(xiāng)gtggttatacatgctg犯gac犯cctcagttcgtgg犯ggttcatattcattta/tgc犯tagcaccgtattacacctgatgtgsc鄉(xiāng)gcggattgttcccgcttcgtgstgcttacca犯ctgaaaaaacttttatagttCt3gCt卿gacsgtcctgtgttttttcacaacttgtcacctcccgggatcaccctacagcggattgaccg卿g卿tgttttccttggcaacccatattagtgaaacagtatcgt卿ttaccagctgctgtgtteataggccgccagatagtctgagctg鄉(xiāng)gtaattttgaactgttctctttccgttgattatctttttcccactcttctttgctagtgat朋t3ttgC犯g3tatggaaacacgcacagtttag卿cagcggcgactsccgcattgaaca肌gtatttccactctgttcatc犯Cg3CCCCCaagcccacttg犯3Ctg3gtctccgsctggcctaacctggacgcctgctgCtgCtC33g3tacagcaaLt3ttcccttgggtttagatctt卿gtgttgtctgtgaic肪3a犯gttatccacttcacatgagcccgcg肪caa幼acgtag犯C3tg3Cgtctgcggaaggttttttatctttatc犯acctcattccctccggatggctcctcaaagttgagatcaacaacgactcatteiggttatctgttttgtcacagtaatttttaacttcgtcatgacagtttattggtggatattttcctcgccaactttgcggttt犯ta犯aatt犯ccagtg^tgatgacagatttagttgg3CCCgg3t3tcggtgatcggttgctcaggaaggg犯cagcctctcctgccgctggccgggtMtgggc犯ccattg犯acgtstcggcax:agttgtttgaacgttgatctgtaatggctcgttatccactcttttttagagacaaattgcttgcccttaactgcttattggatctgtcattcgtccagtctgctgtatctgt3tctgcgsccagt幼ggagccctgaagagtgcgcacagtctttatcggcc犯tccgteiC3ggC3tCgtaccagcgtatgcagaactcctcgtattttccacagatttgttttgctgttgg^gcc幼atgacctg3tsactctg33tttcttcttgcggttcgctcgcggtetgtgcttttttgatgacata肌cgctcccgg犯gcgggtttcttctgg3犯ttCg3gcgtgatgtgggttgctgcctctggctctgctc犯tgtattttctatcttgcttgacattatttgatg幼tgttgctcatgatt犯tgtcctacacctccta卿ggttctcagtccccgtatccacggggcgccttgtacctttcagtgccctgtgacaactcttttttggCg卿fLC3aaacgacctcgttcgttgacg3tCC3tgtttatacggcagggatgccggctccatccagagttacagaactgccatgcgtctctctgaaagcctg￡icttc幼tgcgcctccttccgcgat鄉(xiāng)gtggttctccttcagcctttgagggcatcgggggttaggctatccgcctgsgcgt犯tatgctcggtcttcttatctctttgcgattggtcatga犯caggctatcagg3Cgggttgtttggt肌gccat犯aggtgaaggggctaccacggatgggggggaa卿gattccttcctggteiaactgcgactatgatggtatgtgctggcactgcagtgagcctgatgtggstggagg876088208880894090009060912091809240930093609420948095409600966097209780984099009960廳0100801014010200102601032010380104401050010560翻01068010740108001086010920109801104011100l畫112201128011340agcaaattcgggatgcctgggg卿C3tggttct犯犯aatgttgtacgtga幼cggatg11400幼g"ttggt犯3ggtC3g3tCcggatg卿actgtttttgaacaggccattgatcaacgct11460cttc幼ctggtgcctgg柳aatgctctttctatttgggaacctgtctgc幼tg犯attt11520tcgatcgtctgattaaaccacgctggg卿ttagataatg鄉(xiāng)cgtgcgcctgttattcc11580aaaacatacgctcaatactcaaccggttgattatcgacaccagctgcccc11640gatggtggattcgttaattgcgcgcgtagg3gt幼tggCtcgcggt犯tgccattacttt11700gcctgtatgtggtcgggatgtgaagtttactcttg幼gtgctccggggtg8tagtgttg811760gaagacctctcgggtatggtacgtgacceiggagctgcttactg鄉(xiāng)acgc11820actggatgatctcatcccttcttttctactg3CtggtC犯C3g3C3CCggcgttcggtcg11880犯g3gt3tCtggtgtcataga犯ttgccgatgggsgtcgccgtcgt犯agctgctgcact11940taccgaaagtgattatcgtgttctggttggcgagctggatgatgagc卿tggCtgC3tt12000atccagattgggt犯cgattatcgccc犯caagtgcttatgaacgtggtcagcgttatgc12060肌gccgattgcag犯tgaatttgctgg犯statttctgcgctggctgatgcgg肌肌tat12120ttcacgtaagattattacccgctgtatc肌C3ccgcc幼eittgcctaaatcagttgttgc12180tcttttttctcaccccggtgaactatctgcccggtc鄉(xiāng)tgatgcacttc犯aaagcctt12240tacagataaagaggaattacttaagcagcaggC3tct33Ccttcatgagc12300tggggtgatatttg犯gctgaagaagttatcactcttttaacttctgtgcttaaaacgtc12360atctgcatcat犯gctcacgacatcagtttgctcctggagCg3C3gt3tt12420gtat卿ggcgataaaatggtgctt肌cctggac兆gtctcgtgttccaactgagtgtat12480agagaataattgsggccattcttaagg犯cttg犯犯gCC2Lgcaccctgatgcgaccacgt12540tttagtctacgtttatctgtctttacttaatgtcctttgttacaggccagaaagcataac12600tggcctgaatat"tctctctgggcccactgttccacttgtatcgtcggtctgataatcaga12660ctgggaccacggtcccactcgteitcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtccca12720ctcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctg12780tgggaccacggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggacc12840atggtcccactcgtatcgtcggtctgattattagtctgggaccacggtcccactcgtatc12900gtcggtctgs>ttattagtctgg肌ccaicggtcccactcgtatcgtcggtctgattattag12960tctgggaccacggtcccactcgteitcgtcggtctgattattagtctgggaccacgatccc13020actcgtgttgtcggtctgeittatcggtctggg3CC3Cggtcccacttgtattgtcgatca13080gactatcagcgtgagactacgattccatcaatgcctgtcsagggc犯gtattgacatgtc13140gtcgtaacctgt卿acggagtaacctcggtgtgcggttgteitgcctgctgtggattgct13200gctgtgtcctgcttatccacaacattttgcgcacggttatgtgg3C朋肌tacctggtta13260cccaggccgtgccggcacgtt犯ccgggctgcatccgatgcaagtgtgtcgctgtcgacg133203gCtCgCg3gctcggacatgaggttgccccgtattcagtgtcgctgatttgtattgtctg13380犯gttgtttttacgttaagttgatgcagatcaattaatacgatacctgcgtcataattga13440ttatttgacgtggtttgstggcctccacgcacgttgtgatatgtagatgataatcattat13500cactttacgggtcctttccggtg3tCCg￡LCaggttacggggcggcgacctcgcgggtttt13560cgctatttatgaaaattttccggttt卿gcgtttccgttcttcttcgtc13620gtttttatttaaaataccctctgaaaagaaaggaaacgacaggtgctgaaagcgagcttt13680ttggcctctgtcgtttcctttctctgtttttgtccgtggsatgaac犯tgg犯gtCCgfLg13740ctcatcgct&ataacttcgtatagcatacattatattcgat1379權(quán)利要求1、一種BAC載體，其特征在于，其含有pUC18的復(fù)制子、氨芐青霉素抗性基因、接合轉(zhuǎn)移片段oriT、整合位點(diǎn)attP、整合酶基因int、阿普霉素抗性基因、假單胞菌的PP_0423′基因的5′端、假單胞菌的crp基因、BAC載體的redF基因、BAC載體的復(fù)制區(qū)OriS、BAC載體的repA基因、BAC載體的sopA基因、BAC載體的sopB基因、BAC載體的sopC基因、BAC載體的cos位點(diǎn)和BAC載體的loxP位點(diǎn)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所說的BAC載體，其特征在于，是pESPBAC，具有SEQNO.17所示的序列。3、一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述BAC載體的方法，其特征在于，包括以下步驟首先將pUC18以BamHI酶切后克隆至pECBACl的BamHI位點(diǎn)，得到pEPUBAC;將pEPUBAC上BglII2.1kb片段克隆至pIJ2925的BglII位點(diǎn)，得到克隆pBG2;將pBG上的Xbal位點(diǎn)以T4DNA聚合酶和dNTP進(jìn)行補(bǔ)平，得到克隆pBG2-2;將pBG-2上BglII2.1kb片段克隆至pEPUBACBglII酶切的8.0kb大片段，選取基因方向與pEPUBAC—致的克隆，命名為pEXPUBAC;將來源于pSET152的阿普霉素抗性基因Am片段克隆至pKS(-)，得到克隆pAM;將來源于P.PuditaKT2440的PP—0423'基因的5'端和crp基因片段至pKS(-)，得到克隆pCrp;將Am片段和PP_0423'-crp克隆至pKS(-)，得到Am-PP—0423'-crp基因盒的克隆pAC;以PCR的方法擴(kuò)增pAC上的Am-crp-PP—0423'基因基因盒和pSET152上的oriT-attP-int基因盒，將DNA片段以DpnI酶處理以消除模板DNA后，回收目的片段；將pEXPUBAC轉(zhuǎn)化至含重組酶質(zhì)粒pSC101-gbaA-Tc的大腸桿菌HS996;將兩個(gè)DNA片段共轉(zhuǎn)化至以L-阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的HS996/pSC101-gbaA-Tc+pEXPUBAC，以阿普霉素和氨芐青霉素做為篩選標(biāo)記，在37°C下進(jìn)行篩選，將獲得的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化E.coliDH10B的感受態(tài)細(xì)胞以純化質(zhì)粒，最終得到目的載體pESPBAC。全文摘要本發(fā)明涉及在大腸桿菌-鏈霉菌-假單胞菌之間穿梭表達(dá)的BAC載體及其構(gòu)建方法。所說的BAC載體，其含有pUC18的復(fù)制子，氨芐青霉素抗性基因，接合轉(zhuǎn)移片段oriT，attP位點(diǎn)，整合酶基因int，Am抗性基因，假單胞菌的PP_0423′基因的5′端，假單胞菌的crp基因，BAC載體的redF基因、復(fù)制區(qū)OriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、cos位點(diǎn)和loxP位點(diǎn)。本發(fā)明是從pECBAC1出發(fā)，將異源表達(dá)的必需原件加以有效綜合和優(yōu)化，并運(yùn)用基因克隆和重組工程等手段，成功構(gòu)建了穿梭表達(dá)BAC載體，為異源表達(dá)生物合成基因蔟以及高通量篩選方面提供了方便。文檔編號(hào)C12N15/63GK101302531SQ200810122910公開日2008年11月12日申請(qǐng)日期2008年6月20日優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日發(fā)明者杰宋,尚廣東,黃慧穎申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)