專利名稱：：一種Solexa技術(shù)鑒定肺癌病人血清中微小核糖核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種測定肺癌病人血清中微小核糖核酸表達的Solexa技術(shù)，以及Solexa技術(shù)在肺癌的早期診斷、療效評價和藥效評價等臨床診斷和治療方面的應(yīng)用。二
背景技術(shù)：
：肺癌是人類最常見、發(fā)病率最高、死亡率最高、治療效果較差的惡性腫瘤。由于肺癌發(fā)病早期無特異性的臨床癥狀和表現(xiàn),待就診時，患者大多已屬于晚期，臨床治療效果和中位生存期都令人不滿意。肺癌總生存率在過去的20年中無明顯提高，目前手術(shù)后5年生存率僅為14%。早期發(fā)現(xiàn)和診斷肺癌，對肺癌的治療和預(yù)后有著非常重要的意義。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的進展，越來越多的肺癌標(biāo)記物及篩查手段應(yīng)用于臨床。目前常用于肺癌早期診斷的標(biāo)記物分子有癌胚抗原(CEA)，神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)，糖鏈抗原2125(CA125)，端粒酶，細胞角蛋白，P53基因等。其中CEA是一種人類胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白，為非特異性腫瘤標(biāo)記物，約有30%70%的肺癌病人CEA水平升高。NSE是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，在肺癌特別是在小細胞肺癌(SCLC)中具有高水平及高陽性率，可反映疾病病程、病期、腫瘤負荷，幫助判定療效，對監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移也有重要意義。CA125是一種存在于胎兒體腔上皮中的一種糖原蛋白抗原，由于其濃度高低與肺癌T陋分期呈正相關(guān)，近年來CA125作為一獨立的預(yù)后因子，是肺癌分期與預(yù)后判斷的重要參考指標(biāo)。端粒酶是目前公認的腫瘤標(biāo)志物，在肺癌中端粒酶活性達80%以上。因此檢測到端粒酶活性對肺癌的早期診斷有重要的臨床價值。細胞角蛋白是腫瘤細胞發(fā)生溶解或壞死時釋放入體液中的一種蛋白質(zhì)，目前被認為是檢測鱗癌最好的腫瘤標(biāo)記物。細胞角蛋白測定對判斷肺癌的分期及預(yù)后有重要價值，尤其對非小細胞肺癌中肺鱗癌的診斷、療效及預(yù)后等有重要臨床價值。P53基因是與人類惡性腫瘤相關(guān)性最高的腫瘤抑制基因，其編碼產(chǎn)生P53蛋白，P53蛋白又參與了細胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細胞分化和凋亡。P53基因突變率在小細胞肺癌(SCLC)中高達80°/。90%，在非小細胞肺癌NSCLC中也達到50%以上。因此P53基因突變可作為一種理想的早期檢測肺癌的指標(biāo)。盡管現(xiàn)在許多的腫瘤標(biāo)志物被不斷發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，但是尚未在大批量人群進行隨機對照試驗研究，其單一檢測應(yīng)用的敏感度及特異度也未盡如人意，故目前臨床上已經(jīng)很少應(yīng)用單一的腫瘤標(biāo)志物進行肺癌的診斷與鑒別診斷，多指標(biāo)聯(lián)合檢測已成為一種趨勢。進一步研究已有的肺腫瘤標(biāo)志物并進行優(yōu)化組合、多元分析、綜合評價、建立有效的聯(lián)合檢測以提高靈敏性和特異性，繼續(xù)探索新的更靈敏、更特異的肺腫瘤標(biāo)志物是今后腫瘤診斷學(xué)的研究方向。微小核糖核酸，是一類長約19到23個核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子。它們在進化上高度保守，并與動物的許多正常生理活動有關(guān)，如生長發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等。近來研究表明，人類中所發(fā)現(xiàn)的微小核糖核酸在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，能作為腫瘤早期診斷的新型標(biāo)志物。本發(fā)明人已經(jīng)開展了以微小核糖核酸作為疾病標(biāo)志物的研究，例如選取惡性腫瘤發(fā)病率第4位的結(jié)腸癌作為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸良性息肉發(fā)展成惡性腫瘤期間，一些微小核糖核酸分子都存在著特異性變化，并據(jù)此通過測定微小核糖核酸的特異性變化已經(jīng)建立起一種更敏感、更精確的早期確診結(jié)腸癌的方法。目前微小核糖核酸的檢測方法主要有以下幾種Northernblotting是現(xiàn)在檢測微小核糖核酸表達最主要的手段，所有克隆和生物信息學(xué)分析得來的微小核糖核酸都需要經(jīng)過Northernblotting來驗證和確認。這種方法的缺點在于靈敏度較低且不能進行高通量的檢測。②RT-PCR也被用來檢測微小核糖核酸前體的表達水平，但微小核糖核酸前體的表達水平并不一定和成熟微小核糖核酸的表達水平一致。實時熒光定量PCR(real-timePCR)可以很精確的定量分析微小核糖核酸的表達，也經(jīng)常用于驗證預(yù)測的微小核糖核酸。③芯片技術(shù)(microarray)是一種更快、更廣泛、更有前途的研究微小核糖核酸表達的方法。芯片技術(shù)固然以其高通量和并行處理的特點在基因信息分析中占據(jù)重要地位，但信息量大并不等于質(zhì)量高。實際上，基因芯片的一個突出弱點就是其信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性比較差，且無法實現(xiàn)定量檢測。Solexa測序技術(shù)最早由劍橋大學(xué)的兩位化學(xué)家創(chuàng)立，利用"DNA簇"和"可逆性末端終結(jié)"核心技術(shù)，能夠達成自動化樣本制備及基因組數(shù)百萬個堿基大規(guī)模平行測序。具有高通量，高精度和大規(guī)模平行測序的特點的Solexa測序技術(shù)在RNA水平可以進行全基因組廣譜基因表達研究和小分子RNA掃描，定量和鑒定。由于微小核糖核酸分子是一類新型疾病標(biāo)志物，本發(fā)明擬開展Solexa測序技術(shù)對肺癌病人血清中微小核糖核酸是否存在，能否被檢測及其與疾病的相關(guān)性的研究，建立一種利用肺癌血清中穩(wěn)定存在的微小核糖核酸及其特異性變化來進行肺癌早期診斷，鑒定和病程監(jiān)控，惡性復(fù)發(fā)及預(yù)后、并發(fā)癥發(fā)生的預(yù)測，藥效判定，用藥指南，個體化治療，中藥中有效成份篩選，病程分類等研究的新技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問題是證明肺癌病人血清中微小核糖核酸的存在并分析鑒定其穩(wěn)定性。本發(fā)明涉及肺癌病人血清中微小核糖核酸的提取方法。本發(fā)明涉及Solexa技術(shù)分析并鑒定人肺癌血清中微小核糖核酸分子表達譜。本發(fā)明涉及一種評價肺癌病人生理/病理狀態(tài)的方法，該方法包括測定肺癌病人血清微小核糖核酸，以及獲得肺癌病人血清微小核糖核酸的表達譜。其中所述方法優(yōu)選用于與正常血清微小核糖核酸進行比較，用于疾病的診斷、藥物的篩選、治療方案的評價。用于實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為取得肺癌病人的血清樣本，通過Solexa方法分析并鑒定人肺癌血清中微小核糖核酸分子的存在。通過與肺癌血清微小核糖核酸的PCR產(chǎn)物進行序列比對，進一步驗證血清微小核糖核酸分子的存在和序列的正確性。通過Solexa方法進一步得到肺癌血清中微小核糖核酸的分布和含量，篩選出在疾病及正常生理狀態(tài)下差異表達程度大的一類血清微小核糖核酸分子，來制備應(yīng)用于檢測肺癌發(fā)生等疾病診斷領(lǐng)域的試劑盒。具體的血清微小核糖核酸的制備及分析如下(1)收集肺癌/正常受試者的血清樣本；(2)通過Trizol試劑提取血清/血細胞總RNA;(3)進行PAGE電泳回收17-27ntRNA分子；(4)進行Solexa技術(shù)的準(zhǔn)備實驗，首先在17_27ntRNA分子兩個末端加上接頭(adapter);(5)利用Solexa芯片固定單鏈RNA分子芯片表面連接有一層單鏈引物(Primer),RNA片斷成單鏈后通過芯片表面引物的堿基互補被一端"固定"在芯片上；(6)引物擴增使得單鏈RNA成為雙鏈；(7)將雙鏈RNA變性后成為單鏈，其一端"固定"在芯片上，另外一端(5'或3，)隨機和附近的另外一個引物互補，被"固定"住，形成"橋"(bridge);(8)上千萬RNA單分子發(fā)生同樣反應(yīng)形成單鏈橋；(9)單鏈橋以周圍的引物為擴增引物，在芯片表面進行擴增形成雙鏈；(10)雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，成為下一輪擴增的模板，反復(fù)30輪擴增后每個單分子得到了1000倍擴增，成為單克隆簇；(11)利用"可逆性末端終結(jié)反應(yīng)"，通過堿基合成來進行序列分析。四種堿基分別標(biāo)記四種不同熒光，每個堿基末端被保護基團封閉，單次反應(yīng)只能加入一個堿基，經(jīng)過掃描，讀取該次反應(yīng)顏色后，該保護基團被除去，下一個反應(yīng)可繼續(xù)進行，如此反復(fù)，得出堿基的精確序列；(12)數(shù)據(jù)分析與處理。通過上述的Solexa方法分析在肺癌血清中微小核糖核酸的變化趨勢和變化量及它們與肺癌發(fā)生的相關(guān)性。本發(fā)明針對肺癌血清中微小核糖核酸的檢測技術(shù)，可以快速地高通量地分析肺癌病人血清中微小核糖核酸的組成，并通過對其獨特的一系列分子標(biāo)記物變化范圍及趨勢的分析，可以應(yīng)用于早期肺癌的診斷，并且對肺癌的分期具有指導(dǎo)意義。利用Solexa測序技術(shù)對肺癌血清中微小核糖核酸進行檢測的優(yōu)越性(1)利用Solexa測序技術(shù)對肺癌血清微小核糖核酸的檢測，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放(血液-20'C存放即可)等優(yōu)點，該方法可廣泛用于疾病普查等相關(guān)工作，成為早期診斷疾病的有效手段。(2)利用Solexa測序技術(shù)檢測出的一類特異性的血清微小核糖核酸作為新的疾病標(biāo)記物將改進單一的標(biāo)記物所難以克服的個體差異所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高疾病的臨床檢出率和實現(xiàn)疾病的早期診療。(3)利用Solexa測序技術(shù)對血清微小核糖核酸檢測優(yōu)勢在于其檢測的是一系列疾病相關(guān)標(biāo)記物，它們或升高或降低經(jīng)過反復(fù)實驗具有統(tǒng)計學(xué)意義，因而能夠克服病人個體之間的差異(即年齡、性別、種族、飲食和環(huán)境等)，而這正是單一疾病標(biāo)記物所無法逾越的一個主要問題?？傊琒olexa技術(shù)測定的血清中一系列微小核糖核酸能應(yīng)用于早期肺癌的診斷，這種新的血液中的疾病標(biāo)記物不僅為人們在分子水平上全面了解疾病發(fā)生的機理提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也加速了臨床疾病診斷學(xué)和治療學(xué)的進步。基于血清微小核糖核酸Solexa測序技術(shù)的優(yōu)越性，相信不久的將來，對重癥疾病的血清微小核糖核酸診斷技術(shù)將會成為常規(guī)體檢的一部分，而且微小核糖核酸相關(guān)的基因治療也會廣泛地應(yīng)用，征服重癥疾病將不再是夢想。四圖1為Solexa測序所得肺癌/正常血清的小分子RNA長度。圖2為肺癌血清與正常血清相比，微小核糖核酸的變化情況圖3為肺癌血清與正常血清相比微小核糖核酸變化的Pearson相關(guān)系數(shù)曲線肺癌血清與正常血清相比，R=0.50705五具體實施方式實施例1采用Solexa測序技術(shù)對肺癌病人血清樣本進行測序并分析各個微小核糖核酸的表達量。具體步驟為(1)收集肺癌病人的血清樣本。(2)Trizol法(Invitrogen公司)提取上述病人100ml混合血清總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，用分光光度計進行定量(100ml血清通常能富集約10-20ug左右的總RNA)。(3)應(yīng)用10-20yg左右的肺癌病人血清總RNA，采用Solexa測序技術(shù)檢測和分析RNA樣品。具體方案為a.應(yīng)用PAGE電泳，純化得到長度小于30nt的RNA分子。在RNA分子的兩個末端加上接頭分子(adapter)。b.采用Solexa芯片在固定一端RNA接頭分子的同時，由于其芯片表面有能與另一端RNA接頭分子互補的單鏈引物(Primer)，從而將RNA分子"固定"在芯片上，形成單鏈"橋"(bridge)。c.然后進行"橋"式PCR反應(yīng)使得單鏈RNA擴增成為雙鏈。d.將雙鏈RNA分子變性成為單鏈。兩單鏈RNA分子的一端分別"固定"在芯片上，另外一端(5'或3')分別隨機和附近芯片表面的引物互補而被"固定"住，形成兩個單鏈"橋"(bridge)。e.上千萬個"種在"芯片表面的RNA分子發(fā)生上述相同反應(yīng)。f.形成的單鏈橋在芯片表面進行"橋"式PCR擴增反應(yīng)，形成雙鏈；雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，成為下一輪擴增的模板繼續(xù)擴增反應(yīng)。每個RNA分子經(jīng)過反復(fù)30輪擴增后(約1000倍擴增)，成為單克隆簇群。g.采用"可逆性末端終結(jié)反應(yīng)"進行單克隆RNA簇的序列分析。四種堿基分別標(biāo)記四種不同熒光，每個堿基末端被保護基團封閉，單次反應(yīng)只能加入一個堿基，經(jīng)過掃描并讀取該次反應(yīng)顏色后，該保護基團被除去，下一個反應(yīng)可繼續(xù)進行，如此反復(fù)，得出每個堿基精確序列。(4)利用生物信息學(xué)方法，對上述測得的肺癌病人血清小RNA分子表達譜進行分析，結(jié)果如表l所示表1:solexa測序所得的小分子RNA的歸類<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>7重復(fù)1.41%mRNAs碎片組0.51%未標(biāo)注0.62%我們從表1可以看到血清中存在不同種類的小分子RNA，利用生物信息學(xué)方法，我們通過序列比對將所有小分子RNA進行了歸類分析。從目前的數(shù)據(jù)來看，血清中至少存在上百種微小核糖核酸，占肺癌血清所有RNA分子的68.09%。由于血清中大分子RNA降解(包括rRNA、mRNA等的降解)，無形中增加了rRNA碎片和mRNA碎片在血清RNA分子中的比率。Solexa測序結(jié)果所得的小分子RNA的長度分布如圖1所示。大多數(shù)血清小分子RNA的長度是22nt，表明微小核糖核酸在小分子RNA中占大比重的趨勢。此外，血清中小分子RNA的情況比較復(fù)雜，存在很多rRNA和mRNA的碎片，大小也正好是18-30bp。具體的肺癌血清Solexa測序結(jié)果見表2(拷貝數(shù)值反映微小核糖核酸的表達量，其中拷貝數(shù)=0表示血清中沒有微小核糖核酸；拷貝數(shù)值越大，其對應(yīng)的微小核糖核酸表達量越多)。表2:肺癌血清中微小核糖核酸的Solexa測序結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>10hsa-miR-1370195hsa-miR-548c-3p0380hsa-miR-605211hsa-miR-1380196hsa-miR-548c-5P0381hsa-miR-625212hsa-miR-140-5p0197hsa-miR-548d-3P0382hsa-miR-628-5P213hsa_miR_1410198hsa-miR-548d-5P0383hsa-miR-654-5P214hsa-miR-142-3p0199hsa-miR-5490384hsa-miR-7215hsei-miR-1440200hsa-miR-5500385hsa-miR-769-3p216hsa-miR-146b-3p0201hsa-miR-551b0386hsa-miR-886-3p217hsa-miR-1470202hsa-miR-5520387hsa-miR-100418hsa-miR-147b0203hsa-miR-5530388hsa-miR-124419hsa-raiR-1490204hsa-miR-5540389hsa-miR-132420hsa-miR-1530205hsa-miR-5550390hsa-miR-154421hsa-miR-1830206hsa-miR-556-3p0391hsa-miR-210422hsa-miR-1840207hsa-miR-556-5p0392hsa-miR-324-3p423hsa-miR-1870208hsa-raiR-5570393hsa-miR_331-3p424hsa-miR-188-3p0209hsa-miR-5580394hsa-miR-361-3p425hsa-miR-188-5p0210hsa-miR-5590395hsa-miR-374a426hsa-miR-18a0211hsa-miR—5600396hsa-miR-410427hsa-miR-18b0212hsa-miR-5610397hsa-miR-485-5p428hsa-miR-1900213hsa-miR-5620398hsa-miR-499-5p429hsa-miR-190b0214hsa-miR-5630399hsa_miR-576_5p430hsa-miR-193a-3p0215hsa-miR_5640400hsa~miR-768-54<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>55hsa-miR-2970240hsa-miR-590-5p0425hsa-miR-409-5p1156hsa-miR-2980241hsa-miR-5910426hsa-miR-7661157hsa-miR-299-3p0242hsa-miR-5920427hsa-miR-10a1258hsa-miR-299-5p0243hsa-miR-5930428hsa-miR-127-3p1259hsa-miR-3000244hsa-miR-5950429hsa-miR-181b1260hsa-miR-301a0245hsa-miR-5960430hsa-miR-1941261hsa-miR-301b0246hsa-miR-5970431hsa-raiR-2061262hsa-miR-302a0247hsa-miR-5990432hsa-miR-3401263hsa-miR-302b0248hsa-miR-6000433hsa-miR-409-3p1264hsa-miR-302c0249hsa-miR-6010434hsa-miR-4211265hsa-miR-302d0250hsa-miR-6020435hsa-miR-5891266hsa-miR-310251hsa-miR-6030436hsa-miR-1011467hsa-miR-320252hsa-miR-6040437hsa-miR-19b1468hsa-miR-323-5p0253hsa-miR-6060438hsa-miR-532-5p1469hsa-miR-3250254hsa-miR-6070439hsa-miR-886-5p1470hsa-miR-3260255hsa-raiR-6080440hsa-miR-181d1671hsa-miR-3290256hsa-miR-6090441hsa-raiR-483-5p1672hsa-miR-330-5p0257hsa_miR_6100442hsa-miR-6291673hsa-miR-337-3p0258hsa-miR-6110443hsa-miR-1261874hsa-miR-337-5p0259hsa-miR-6120444hsa-miR-1431875hsa-miR-33a0260hsa-miR-6130445hsa-miR-28-5p1876hsa-miR-33b0261hsa-miR-6140446hsa-miR-3281877hsa-miR-3460262hsa-miR-615-3p0447hsa-miR-3451878hsa-miR-34a0263hsa-miR-615-5p0448hsa-miR-485-3p1879hsa-miR-34b0264hsa-miR-6160449hsa-miR-2241980hsa-miR-34c-3p0265hsa-miR_6170450hsa-miR-324-519P81hsa-miR-34c-5p0266hsa-miR-6180451hsa-miR-501-3p1982hsa-miR-3650267hsa-miR-6190452hsa-miR-342-5p2183hsa_miR_3670268hsa-miR-6200453hsa-miR-1452384hsa-miR-3700269hsa-miR-6210454hsa-miR-2052385hsa-miR-371-3p0270hsa-miR-6220455hsa-miR-323-3p2386hsa-miR-371-5p0271hsa-miR-6230456hsa-miR-361-5p2387hsa-miR-3720272hsa-miR-6240457hsa-miR-982388hsa-miR-3730273hsa-miR-6260458hsa-miR-139-3P2589hsa-miR-376a0274hsa-miR-6270459hsa-miR-28-3p2590hsa-miR-376b0275hsa-miR-628-3p0460hsa-miR-3352591hsa-miR-376c0276hsa-miR-6300461hsa-miR-3752592hsa-miR-3770277hsa-miR-6310462hsa-miR-148b2693hsa-miR-3790278hsa-miR-6320463hsa-miR-30a2694hsa-miR-3800279hsa_miR_6330464hsa-miR-4332695hsa-miR-3810280hsa-miR-6340465hsa-miR-1342896hsa-miR-3830281hsa-miR-6350466hsa-miR-374b2897hsa-tniR-3840282hsa-miR-6360467hsa-miR-199a-5p3298hsa-miR-4110283hsa-miR-6370468hsa-miR-502-3p3399hsa-miR-4120284hsa-miR-6380469hsa-miR-65233100hsa-miR-422a0285hsa-miR-6390470hsa-miR-146b-5p35101hsa-miR-4290286hsa-miR-6400471hsa-miR-125a-5p37102hsa-miR-4480287hsa-miR-6410472hsa-miR-125b37103hsa-miR-449a0288hsa-miR-6420473hsa—miR-139—537104hsa-miR-449b0289hsa-miR-6430474Phsa-miR--43237105hsa-miR-450a0290hsa-miR-6440475hsa-miR--99a37106hsa-miR-450b-3p0291hsa-miR-6450476hsa-miR--29c40107hsa-miR-450b-5p0292hsa-miR-6460477hsa-miR--92b40108hsa-miR-4530293hsa-miR-6470478hsa-miR-p-574-342109hsa-miR-4540294hsa-miR-6480479hsa-miR--30b44110hsa-miR-455-5p0295hsa-miR-6490480hsa-miR--54344111hsa-miR-487a0296hsa-miR-6500481hsa-miR--66044112hsa-miR-4880297hsa-raiR-6510482hsa-miR--133a47113hsa-miR-4890298hsa-miR-6530483hsa-miR--38247114hsa-miR-490-3p0299hsa-miR-654--3p0484hsa-miR--1754115hsa-miR-490-5p0300hsa-miR-6550485hsa-miR畫-130b56116hsa-miR-491-3p0301hsa-miR-6560486hsa-miR畫-15056117hsa-miR-491-5p0302hsa-miR-6570487hsa-miR-5p193a-58118hsa-miR-4920303hsa-miR-6580488hsa-let--7f61119hsa-miR-4940304hsa-miR-6590489hsa—miR--15263120hsa-miR-4970305hsa-miR-6610490hsa-miR--59865121hsa-miR-4980306hsa-miR-6620491hsa-miR--15a67122hsa-miR-499-3p0307hsa-miR-6630492hsa-miR--30e67123hsa-miR-5000308hsa-miR-6650493hsa-miR--36368124hsa-tniR-501-5p0309hsa-miR-6680494hsa-miR--49570125hsa-miR-502-5p0310hsa-miR-671--3p0495hs3-miR--19775126hsa-miR-5040311hsa-n)iR-671--5p0496hsa-let--7c77127hsa-miR-5060312hsa-miR-6720497hsa-miR--99b77128hsa_miR-5070313hsa-miR-6740498hs3-miR--130a82129hs3-miR-508-3p0314hsa-miR_6750499hsa-miR--48486130hsa-miR-508-5p0315hsa-miR-7080500hsa-miR-p-339-396131hsa-miR-509-3-5P0316hsa-miR-7580501hss-miR--37898<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>184hsa-miR-5270369hsa-miR-369-3p2554hsa-miR-45188271241185hsa-miR-5390370hsa-miR-369-5p2555hsa-miR-3208人類微小核糖核酸數(shù)據(jù)庫的最新版本中包含的微小核糖核酸共有555個，如表2所示，在肺癌血清中共檢測出199個，其中tag值在0-10之間的有57個，在10-100之間有78個，100-1000之間有32個，大于1000的有22個，未檢測到的有356個。實施例2肺癌病人血清中微小核糖核酸較正常生理狀態(tài)的變化情況用Solexa技術(shù)對正常人血清微小核糖核酸進行測序，所得結(jié)果如表3所示。表3正常人血清Solexa測序結(jié)果序序序miRNAgeneTag號miRNAgeneTag號miRNAgeneTag號1hsa-miR-1050186hsa-miR-520f0371hsa-miR-548c-5p02hsa-miR-10b0187hsa-miR-520g0372hsa-miR-62503hsa-miR-1240188hsa-miR-520h0373hsa-miR-628-5p04hsa-miR-125a-3p0189hsa-miR-5210374hsa-miR-64105hsa-miR-125a-5p0190hsa-miR-5220375hsa-miR-87406hsa-miR-127-5p0191hsa-miR-5230376hsa-miR-9420hsa-miR-129-3p0192hsa-miR-524-3p0377hsa-miR-181b08hsa-miR-129-5p0193hs3-miR-524-5p0378hsa-miR-296-5p09hsa-miR-1320194hsa-miR-525-3p0379hsa-miR-873010hsa-miR-133b0195hsa-miR-525-5p0380hsa-miR-200c011hsa-miR-1340196hsa-miR-526a0381hsa_miR_361-5p012hsa-miR-135a0197hsa-miR-526b0382hsa-miR-582-3p013hsa-miR-135b0198hsa-miR-5270383hsa-miR-627014hsa-miR-1360199hsa_miR_5390384hsa~miR-145015hsa-miR-1370200hsa-miR-5410385hsa-miR-224016hsa-miR-1380201hsa-miR-542-3p0386hsa-miR-517a017hs3-miR-139-3p0202hsa-miR-542-5p0387hsa-miR-517b018hsa-miR_139_5p0203hsa-miR-5430388hsa-miR-570019hsa-miR-1410204hsa-miR-5440389hsa-let-7e120hsa-miR-146b-3p0205hs3-miR-5450390hsa-miR-199b-5p121hsa_miR_1470206hsa-miR-548a-3p0391hsa-miR-508-3p122hsa-miR-147b0207hsa-miR-548a-5p0392hsa-miR-127-3p123hsa-miR-1490208hsa-miR-548b-3p0393hsa-miR-28-3p124hsa_miR-1530209hsa-miR-548c-3p0394hsa-miR-28-5p125hsa-miR-1540210hsa-miR-548d-3p0395hsa-miR-574-3p126hsa-miR-181c0211hsa-miR-5490396hsa-miR-301b127hsa-miR-181d0212hsa-miR-551a0397hsai-miR-499-5p128hsa-miR-1870213hsaiiR-551b0398hsa-miR-200b129hsa-miR-188-3p0214hsa-miR-5520399hsa-miR-503130hsa-miR-188-5p0215hsa-miR-5530400hsa-miR-582-5p131hsa-miR-190b0216hsa-miR-5540401hsa-miR-362-3p132hsa-miR-193a-5p0217hsa-miR-5550402hsa-miR-941133hsa-miR-193b0218hsa-miR-556-3p0403hsa-miR-328134hsa-miR-1950219hsa-miR-556-5p0404hsa-miR-550135hsa-miR-196a0220hsa-miR-5570405hsa-miR-877136hsa-miR-1980221hsa-miR-5580406hsa-miR-99a137hsa-miR-200a0222hsa-raiR-5590407hsa-miR-450a138hsa-miR-2020223hsa-miR-5600408hsa-miR-574-5p139hsa-miR-2030224hsa-miR-5610409hsa-niiR-548b-5p140hsa-miR-2040225hsa-miR-5620410hsa-miR-330-3p141hsa-miR-2050226hsa-miR-5630411hsa-miR-589142hsa-miR-2060227hsa_miR-5640412hsa-miR-197143hsa-miR-2080228hsa-miR-5650413hsa-miR-324-3p244hsa-miR-208b0229hsa-miR-5660414hsa-miR-548d-5p245hsa-miR-2110230hs3_miR_5670415hsa-miR-196b246hsa-miR-2120231hsa-miR-5680416hsa-miR-768-5p247hsa-miR-2140232hsa-miR-5690417hsa-miR-501-5p248hsa-miR-216a0233hsa-miR-5710418hsa-miR-9249hsa-miR-216b0234hsa-miR-5720419hsa-miR-331-5p250hsa-miR-2170235hsa-miR-5730420hsa-raiR-491-5p251hsa-miR-2180236hsa-miR-5750421hsa-miR-92b252hsa-miR-219-1-3p0237hsaiiR-5770422hsa-miR-501-3p253hsa-miR-219-2-3p0238hsa-miR-5780423hsa-miR-2152<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>87hsa-miR-369-5p0272hsa-miR-6160457hsa-miR-301a888hsa-miR-3700273hsa-miR-6170458hsa-miR-150989hsa-miR-37卜3p0274hsa-miR-6180459hsa-miR-199a-3p1190hsa-miR-371-5p0275hsa-miR-6190460hsa-miR-199b-3p1191hsa-miR-3720276hsa-miR-6200461hsa-miR-339-5p1192hsa-miR-3730277hsa-miR-6210462hsa-miR-331-3p1193hsa-miR-3750278hsa-miR-6220463hsa-miR-502-3p1294hsa-miR-376a0279hsa-miR-6230464hsa-miR-886-5p1295hsa-miR-376b0280hsa-miR-6240465hsa-miR-23a1396hs3-miR-376c0281hsa-miR-6260466hsa—let-7c1397hsa-miR-3770282hsa-miR-628-3p0467hsa-miR-590-5p1398hsa-miR-3790283hsa-miR-6300468hsa-miR-1841399hsa-miR-3800284hsa-miR-6310柳hsaiiR-22214100hsa-miR-38i0285hsa-miR-6320470hsa-miR-423-3p16101hsa-miR-3820286hsa-miR-6330471hsaiiR-19016102hsa-miR-3830287hsa-miR-6340472hsa-miR-18b16103hsa-miR-3840288hsa-miR-6350473hsa-miR-3217104hsa-miR-409-3p0289hsa-miR-6360474hsa-miR-19a19105hsa-miR-409-5p0290hsEi-miR-6370475hsa-miR-324-5p21106hsa-raiR-4100291hsa-miR-6380476hs3-miR-45422107hsa-miR-4110292hsa-miR-6390477hsa-miR-42423108hsa-miR-4120293hsa-miR-6400478hsa-miR-576-5p23109hsa-miR-422a0294hsa-miR-6420479hsa-miR-9624110hsa-miR-4290295hsa-miR-6430480hsa-miR-374b24111hsa-miR-4310296hsa-raiR-6440481hsa-miR-29b25112hsa-miR-4320297hsa-miR-6450482hsa-miR-lOO26113hsa-miR-4330298hsa-miR-6460483hsa-miR-362-5p26114hsa-miR-4480299hsa-miR-6470484hsa-miR-66029115hsa-tniR-449a0300hsa-miR-6480485hsa-miR-92329116hsa-miR-449b0301hs3-miR-6490486hsa-miR-21030117hsa-miR-450b-3p0302hsa-miR-6500487hsa-miR-2431118hsa-miR-4520303hsa-miR-6530488hsa-miR-532-5p31119hsa-miR-4530304hsa-miR-654-3p0489hsa-miR-148b33120hsa-miR-455-3p0305hsa-miR-654-5p0490hsa-miR-12634121hsa-miR-455-5p0306hsa-miR-6550491hsa-miR-48436122hsa-miR-483-3p0307hsa-miR-6560492hs3-miR-29a37123hsa-miR-483-5p0308hsa-miR-6570493hsa-miR-18337124hsa-miR-485-3p0309hsa-miR-6580494hsa-miR-181a40125hsa-miR-485-5p0310hsa-miR-6590495hsa-miR-374a40126hsa-miR-486-3p0311hsa-miR-6610496hsa-miR-22341127hsa-miR-487a0312hsa-miR-6620497hsa-miR-146b-5p45128hsa-miR-487b0313hsa-miR-6630498hsa-miR-65245129hsa-miR-柳0314hsa-miR-6650499hsa-miR-3。b46130hsa-miR-4890315hsa-miR-6680500hsa-miR-130b59131hsa-miR-490-3p0316hsa-miR-671-3p0501hsa-miR-9865132hsa-miR-490-5p0317hsa-miR-671-5p0502hsa-miR-151-3p66133hsa-miR-491-3p0318hsa_miR-6720503hsa-miR-18278134hsa-miR-4920319hsa-miR-6740504hsa-miR-30e79135hsa-miR-4930320hsa-miR-6750505hsa-miR-19479136hsa-miR-4940321hsa-miR-7080506hsa-miR-148a84137hsa-miR-4950322hsa-miR-7580507hsa-miR-20b99138hsa-miR-4960323hsa-miR-7600508hsa-miR-29c105139hsa-miR-4970324hsa-miR-7650509hsa-miR-146a109140hsa-miR-4980325hsa~miR-7660510hsa-miR-340109141hsa-miR-499-3p0326hs3-miR-767-3p0511hsa-miR-130a116142hsa-miR-502-5p0327hsa-miR-767-5p0512hsei-miR-18a120143hsa-miR-5040328hsa-miR-768-3p0513hs3-let-7d149144hsa-miR-5060329hsa-miR-769-3p0514hsa-miR-106a158145hsa-miR-5070330hsa-miR-770-5p0515hsa-miR-22168146hsa-miR-508-5p0331hsa-miR-8010516hsa-miR-378170147hsaiiR-509-3-5p0332hsa-miR-8020517hsa-miR-30c174148hsa-miR-509-3p0333hsa-miR-8710518hsa-miR-423-5p198149hsa-miR-509-5p0334hsa-miR-8720519hsa-miR-151-5p200150hsa-miR-5100335hsa-miR-875-3p0520hsa-miR-30d201151hsa-miR-5110336hsaiiR-875-5p0521hsa-miR-425232152hsaiiR-512-3p0337hsa-miR-876-3p0522hsa-miR-26b284<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>肺癌病人血清中檢測到有199個微小核糖核酸(見表2)，正常人血清中有167個微小核糖核酸(見表3)。我們認為當(dāng)微小核糖核酸的變化倍數(shù)大于5，且絕對值之差大于20個拷貝數(shù)，那么這個微小核糖核酸是顯著變化的，否則視為不變化。根據(jù)此規(guī)則，我們比較了肺癌病人血清與正常人血清的微小核糖核酸，發(fā)現(xiàn)63個微小核糖核酸呈上升趨勢，34個呈下降趨勢，149個不變化。我們分析了發(fā)生肺癌時變化或不變化的血清微小核糖核酸所占比例，結(jié)果如圖2所示。發(fā)生肺癌時血清中微小核糖核酸相對正常人血清發(fā)生了很大變化，Pearson相關(guān)系數(shù)的分析(見圖3)證實了肺癌病人血清與正常人血清之間微小核糖核酸表達的巨大差異(R=0.51)。因此，Solexa技術(shù)能篩選出在疾病及正常生理狀態(tài)下差異表達程度大的一系列血清微小核糖核酸分子，并且這些微小核糖核酸分子可作為檢測肺癌發(fā)生的分子標(biāo)記用于早期診斷肺癌。實施例3用于診斷肺癌的血清微小核糖核酸試劑盒的制作用于診斷預(yù)測肺癌的微小核糖核酸試劑盒的制作工藝和操作流程是基于Solexa測序技術(shù)，同時結(jié)合定量和半定量PCR技術(shù)。通過Solexa測序的方法，首先測定正常人和肺癌病人血清微小核糖核酸表達譜，然后篩選在肺癌及正常生理狀態(tài)下表達量和差異程度大的一系列血清微小核糖核酸，作為預(yù)測是否發(fā)生肺癌以及診斷病變程度的指標(biāo)。表4顯示與正常人血清相比，肺癌病人血清中顯著變化的微小核糖核酸，可以篩選出一批血清微小核糖核酸作為診斷肺癌發(fā)生的分子標(biāo)志物。表4:肺癌血清與正常血清相比發(fā)生變化的微小核糖核酸<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>hsa-miR-145hsa--miR--23bhsa-miR-342-5phsa--miR-92ahsa-miR-146a-miR--24hsa-miR-361-5phsa--miR-92bhsa-miR-150hsa--miR--25hsa_miR_375hsa--miR-99ahsa-miR-152hsa--miR畫-27ahsa-miR-382hsa--miR-99bhsa-miR-181bhsa--miR--27bhsa-miR-421hsa-let-7fhsar-miR--15ahsa-tniR-20ahS3--miR-451hsa-let-7ghs3--miR--16hsa-miR-20bhsa--miR-454肺癌血清中hsa-miR-訓(xùn)hsa--miR--17hsa-miR-210hsa--miR-590-5p表達量下降hsa-miR-皿hsa--miR--182hsa-miR-29bhsar-miR-7的微小核糖hsa-miR-106ahsa--miR--183hsa-miR-32hsa--miR-923核酸(共34hsa-miR-106bhsa--miR--184hsa-miR-340hsa--miR-96個)hsa-miR-142-3phsa--miR--18ahsa-miR-362-5phsa--miR-98hsa-miR-144hsa--miR--194hsa-miR-374ahsar-miR-424hsa-miR-148ahsar-miR畫-19b診斷肺癌的血清微小核糖核酸試劑盒包括一批血清微小核糖核酸的引物，Taq酶、dNTP等試劑。其中所述血清微小核糖核酸的引物選自肺癌血清與正常血清相比發(fā)生變化的微小核糖核酸中的一種或幾種引物。此試劑盒的使用方式為通過定量和半定量PCR技術(shù)的方法測定作為疾病標(biāo)記物的一類血清微小核糖核酸表達量的變化程度，從而診斷肺癌發(fā)生與否和癌變程度。此試劑盒的價值在于只需要肺癌血液而不需要其它組織樣品。通過Solexa測序技術(shù)篩選在肺癌及正常生理狀態(tài)下表達量和差異程度大的一系列血清微小核糖核酸，用定量和半定量PCR技術(shù)檢測微小核糖核酸的變化趨勢，再通過該變化趨勢預(yù)測肺癌發(fā)生的可能性或診斷肺癌的病理階段。因此將此試劑盒投入實踐，可以增加在早期發(fā)現(xiàn)肺癌的可能，幫助指導(dǎo)診斷和治療。權(quán)利要求1、一種Solexa技術(shù)鑒定肺癌病人血清中微小核糖核酸的方法，其特征由以下步驟構(gòu)成(1)收集正常受試者和肺癌受試者的血清樣本；(2)通過Trizol試劑提取血清總RNA；(3)進行PAGE電泳回收17-27ntRNA分子；(4)進行Solexa技術(shù)的準(zhǔn)備實驗，在17-27ntRNA分子兩個末端加上接頭adapter；(5)小RNA接頭分子一端固定在Solexa芯片表面上，并進行“橋式”PCR擴增反應(yīng)；(6)利用可逆性末端終結(jié)反應(yīng)，通過四種熒光堿基的合成進行測序；(6)數(shù)據(jù)分析與處理。2、根據(jù)權(quán)利要求1方法所制備的用于診斷肺癌的血清微小核糖核酸試劑盒，其特征為(1)該試劑盒包含測定肺癌血清微小核糖核酸的工具，包括酶，dNTP及儀器。(2)此試劑盒只需要肺癌病人血液而不需要其它組織樣品；(3)此試劑盒包含肺癌病人血清與正常人血清相比發(fā)生變化的微小核糖核酸中的一種或幾種的引物；(4)此試劑盒用定量或半定量PCR技術(shù)測定作為疾病標(biāo)記物的一類血清微小核糖核酸表達量的變化程度，從而診斷肺癌發(fā)生與否和癌變程度。3、權(quán)利要求1所述的Solexa技術(shù)或權(quán)利要求2所述的用于診斷肺癌病人血清微小核糖核酸試劑盒在診斷和鑒定肺癌中的應(yīng)用。全文摘要一種Solexa技術(shù)鑒定肺癌病人血清中微小核糖核酸的方法屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種測定肺癌病人血清中微小核糖核酸表達的Solexa技術(shù)，以及Solexa技術(shù)在肺癌的早期診斷、療效評價和藥效評價等臨床診斷和治療方面的應(yīng)用。本發(fā)明包括利用Solexa測序方法測定肺癌受試者的血清微小核糖核酸的含量。所述評價受試者的生理和/或病理狀態(tài)具體是對受試者進行肺癌疾病的診斷；測定受試者給予待測物后的生理和/或病理狀態(tài)。Solexa測序方法具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本低、取材方便、樣本易存放等優(yōu)點，該方法可廣泛用于肺癌普查等相關(guān)工作，改進單一的標(biāo)記物所難以克服的個體差異所帶來的低特異性和低靈敏度，顯著提高肺癌的臨床檢出率，成為肺癌早期診斷疾病的有效手段。文檔編號C12Q1/68GK101307361SQ200810123040公開日2008年11月19日申請日期2008年7月15日優(yōu)先權(quán)日2008年7月15日公開號200810123040.X發(fā)明者張峻峰,張辰宇,柯曾,媛殷,進王,王可慧,星蔡,郭繼剛,熹陳,陳江寧,嵩高申請人:南京大學(xué)被以下專利引用(5),