專利名稱：一種基因免疫方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種基因免疫方》去。
技術(shù)背景隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，很多新的功能基因被確定并克隆，為了 進(jìn)一步研究新基因在組織或細(xì)胞內(nèi)的定位，及蛋白質(zhì)間聯(lián)系等生物學(xué)特 性，則必須應(yīng)用特異性抗體。常規(guī)的抗體的制備主要涉及到蛋白質(zhì)的純 化及免疫，但是有些蛋白卻很難通過蛋白免疫法獲得抗體，主要是有以 下幾種原因造成如 一些膜結(jié)合蛋白很難純化；有的蛋白質(zhì)純化后的產(chǎn) 量很低，不足以制備抗體； 一些原核表達(dá)蛋白缺少翻譯后修飾，引起錯(cuò) 誤折疊，以此抗原制備的抗體， 一般均不能識別出天然的抗原；整個(gè)蛋 白質(zhì)的純化過程耗時(shí)，耗力且費(fèi)用較大。隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，一 種新的利用cDNA作為免疫抗原來制備相應(yīng)抗體的技術(shù)一-基因免疫應(yīng)時(shí) 而生?；蛎庖呤侵赴淹庠椿蚩寺〉秸婧速|(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組 質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合 成抗原蛋白，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)的過程?；蛎庖叩陌l(fā) 現(xiàn)和研究始于1990年，由美國威斯康星大學(xué)的Wolff等發(fā)現(xiàn)，對小鼠直接 肌肉注射純化的DNA重組表達(dá)載體，其外源基因能在小鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi) 表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白子在60天后仍具有生物學(xué)活性，而且沒 有檢測出外源基因與宿主染色體整合。Ulmer等證實(shí)，給小鼠肌肉注射編碼甲型流感病毒核蛋白的載體質(zhì)粒后，可有效地保護(hù)小鼠抵抗另一亞型 流感病毒的攻擊。隨后的大量動物實(shí)驗(yàn)研究表明，編碼目的抗原基因的合 適質(zhì)粒通過肌肉注射的方法接種后，既能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng) 答，又能引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)機(jī)體免受同源病原體的侵害。于是，基因 免疫技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，概念深入人心，但此后的一系列肌肉直接注射法，所制備的抗體效價(jià)均不理想。雖然Sundaram等用粒子介導(dǎo)的基因槍注射法進(jìn)行基因免疫獲得的抗體效價(jià)較高，但是此種方法花費(fèi)較大，而且需要對動物進(jìn)行麻醉和脫毛等復(fù)雜過程。"睡美人(Sle印ing Beauty , SB)"轉(zhuǎn)座系統(tǒng)屬于Tcl/mariner轉(zhuǎn)座子家族，由轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶會且成，其轉(zhuǎn)座酶已失活了一千多萬年。1997年Ivies等根據(jù)積累的系統(tǒng)發(fā)生數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)的方法，對其進(jìn)行分子重建，終于喚醒 了其轉(zhuǎn)座活性。睡美人轉(zhuǎn)座酶是II型轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中的重要成分，其作用主要是促進(jìn)轉(zhuǎn) 座元件的轉(zhuǎn)移。Masuda等研究發(fā)現(xiàn)，將一組不含轉(zhuǎn)座子序列的表達(dá)熒光 素酶的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒協(xié)同注射，另一組只注射表達(dá)熒光素酶的質(zhì)粒。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者比后者熒光素酶的表達(dá)水平提高了 5倍，表明轉(zhuǎn)座酶本身 就可以增強(qiáng)外源基因的表達(dá)，與轉(zhuǎn)座子的存在與否無關(guān)，但熒光素酶基 因均沒有整合到染色體中。因此轉(zhuǎn)座酶不僅可以促進(jìn)轉(zhuǎn)座的發(fā)生，其本 身還可以促進(jìn)基因的表達(dá)，因此可以作為基因免疫的佐劑，提高抗體效 價(jià)，目前轉(zhuǎn)座酶在基因免疫應(yīng)用上的研究尚未見報(bào)道?；谝陨嫌^點(diǎn)，本發(fā)明人以家兔為實(shí)驗(yàn)動物，經(jīng)過大量基礎(chǔ)研究工 作，終于完成了本發(fā)明。發(fā)明內(nèi)本發(fā)明的目的在于建立一種簡單、高效、實(shí)用的基因免疫方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種基因免疫方法，是以常規(guī)方法克隆目標(biāo)基因cDNA，然后構(gòu)建含目標(biāo)抗原cDNA的真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒，以 轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒作為免疫佐劑；將真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按4: l混勻，然后用基因包裹劑PEI按PEI:質(zhì)粒=2: l包裹，按每克體重注射1微克質(zhì)粒的劑量為進(jìn)行動物免疫。上述方法中，PEI的使用濃度優(yōu)選為10毫克/毫升。所說的動物包括但不限于兔。所說的注射，優(yōu)選后肢內(nèi)側(cè)肌肉多點(diǎn)注射方法。更具體的方案，包括以下步驟(1) 克隆目標(biāo)基因cDNA:以常規(guī)方法制備含目標(biāo)基因RNA的總RNA， 反轉(zhuǎn)錄成為第一鏈cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增出的目的 片段，然后克隆入TA載體，并進(jìn)行測序鑒定；(2) 真核表達(dá)載體構(gòu)建將目標(biāo)cDNA亞克隆入改造過的 pcDNA3. 0 (pA)載體中(用尸raII切除其中的neo基因及其表達(dá)調(diào)控序列)， 或其它含CMV啟動子的真核表達(dá)載體。(3) 免疫程序用按常規(guī)堿裂解法大規(guī)模提取睡美人轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒和 所構(gòu)建的重組質(zhì)粒，純化后HBS溶解，得到2ug/ uL的溶液，將己經(jīng) 制備的重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按4: l混勻，用基因包裹劑PEI按(PEI: plasmids=2: 1)包裹后，37'C溫育10分鐘備用；取家兔，以上混合物多點(diǎn)注射后肢內(nèi)側(cè)肌肉，每兩周注射一次，注射 劑量為每克體重注射重組質(zhì)粒1 P g， PEI與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按比例混合，共 注射三次，在第18周加強(qiáng)免疫一次。上述所說的如TA載體，包括但不限于pMD19-T， pGEM-T。 上述所說的其它含CMV啟動子的真核表達(dá)載體，包括但不限于 pTARGET Mammalian Expression Vector。血清效價(jià)的測定用間接ELISA法測定血清效價(jià)。以目標(biāo)蛋白標(biāo)準(zhǔn) 品為抗原，以所采的血清為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為 二抗，TMB顯色，采用方陣實(shí)驗(yàn)測出血清中目標(biāo)蛋白多克隆抗體的效價(jià)。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)免疫法相比，基因免疫是一種新型的抗體制備方法， 不需要在體外表達(dá)系統(tǒng)事先得到外源基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，然而其獲得抗 體的效價(jià)普遍偏低，影響的因素有很多，如動物細(xì)胞攝取質(zhì)粒的量，抗 原基因本身的特性，接種的間隔，途徑，部位及接種的對象等。本發(fā)明 利用轉(zhuǎn)座酶作為基因免疫佐劑，通過免疫程序的優(yōu)化，顯著促進(jìn)抗體效 價(jià)的提高，建立了一種簡單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、高效的抗體制備方法，可以 進(jìn)行多種商業(yè)化抗體的生產(chǎn)。本發(fā)明所使用的pcDNA3.0質(zhì)粒來自Invitrogen公司。睡美人轉(zhuǎn)座酶 基因質(zhì)粒(見Perry B Hackett， Integrating DNA vectors for gene therapy, Mol Ther. 2007 January; 15(1): 10-12。)由Hackett教 授(University of Minnesota, USA)惠贈。


圖1為不同基因免疫方法血清中抗體效價(jià)的變化與比較具體實(shí)施方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí) 施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。(1) 人乳鐵蛋白基因(hLF) cDNA的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建-以正常人乳腺組織混合cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，擴(kuò) 增出的2.3kb目的片段，然后克隆入pMD19-T載體，并進(jìn)行測序鑒定。(2) 將hLF cDNA亞克隆入改造過的pcDNA3. O(pA)載體中(用/V〃 II切除其中的neo基因及其表達(dá)調(diào)控序列)，命名為pA-hLF。(3) 基因免疫優(yōu)化用按常規(guī)堿裂解法大規(guī)模提取睡美人轉(zhuǎn)座酶質(zhì) 粒和pA-hLF質(zhì)粒，純化后用HBS溶解，得到2ug/uL的溶液，-20 。C 保存?zhèn)溆?。取家?2只，共分成四組，三只一組第一組，直接用裸露 的pA-hLF肌肉注射；第二組，用PEI按(PEI: plasmids=2: 1)包裹質(zhì) 粒pA-hLF注射；第三組，將已經(jīng)制備的pA-hLF和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按4: l混 勻，用PEI按(PEI: plasmids=2: 1)包裹后共同注射；第四組為對照 組，注射對照質(zhì)粒pA。以上各組均對8周齡家兔的后肢內(nèi)側(cè)肌肉多點(diǎn)注 射，每兩周注射一次，注射劑量為每克體重注射1微克質(zhì)粒，PEI與轉(zhuǎn) 座酶質(zhì)粒按比例混合，共注射三次，在第三次免疫后每周采血一次，共 采8次，在第18周加強(qiáng)免疫一次， 一周后采血，放于培養(yǎng)皿后置于4。C， 4-5h后收集析出的血清用間接ELISA測量血清中hLF多克隆抗體效價(jià)。間接ELISA法血清效價(jià)的測定以采集的血清為一抗，hLF標(biāo)準(zhǔn)品為抗原，辣根過氧化物酶標(biāo)記的 羊抗兔IgG為二抗，TMB顯色，用間接ELISA方法檢測家兔血清中hLF抗 體的產(chǎn)生情況。結(jié)果表明三個(gè)試驗(yàn)組均產(chǎn)生了 hLF特異性多克隆抗體， 第一組在第三次注射后達(dá)到較高值，而第二組和第三組均在第7周達(dá)到 較高值，然后均隨著時(shí)間的推移，抗體水平逐漸降低，在第18周加強(qiáng)免 疫后明顯升高。第一組裸露pA-LF質(zhì)粒直接肌肉注射其抗體效價(jià)為1: 1600，第二組PEI包裹pA-LF注射效價(jià)為1: 2000, 第三組PEI包裹的 SB轉(zhuǎn)座酶與pA-LF的復(fù)合物肌肉注射效價(jià)為1: 6400，抗體的效價(jià)為三 只家兔的平均值，對照組均未產(chǎn)生hLF抗體?？贵w水平變化及比較見圖 1，其中a:裸露pA-LF質(zhì)粒；b: PEI包裹pA-LF; c: PEI包裹的SB轉(zhuǎn) 座酶與pA-LF的復(fù)合物。用自制抗體進(jìn)行的Western-blotting檢測用購買的人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋成10ng/uL，然后取lOuL與 等體積的2X上樣緩沖液混合，煮沸5min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將電 泳條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)， 一抗為制備的兔抗hLF多克隆抗體，二抗 為HRP -標(biāo)記的羊抗兔IgG， 二氨基聯(lián)苯二胺顯色。結(jié)果表明，在正常 陰性對照中沒有目的條帶，而在標(biāo)準(zhǔn)品hLF中檢測出分子量為77kDa正 確條帶。綜上所述，本發(fā)明建立的基因免疫方法能提高抗體效價(jià)3倍以上， 所獲得的抗體能進(jìn)行Western-blotting和ELISA試驗(yàn)。
權(quán)利要求
1. 一種基因免疫方法，其特征在是以常規(guī)方法克隆目標(biāo)基因cDNA，然后構(gòu)建含目標(biāo)抗原cDNA的真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒作為免疫佐劑；將真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按4∶1混勻，然后用基因包裹劑PEI按PEI∶質(zhì)粒＝2∶1包裹，按每克體重注射1微克質(zhì)粒的劑量進(jìn)行動物免疫。
2、 如權(quán)利要求1所說的基因免疫方法，其特征在于，其中PEI的使用濃度為 10毫克/毫升。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述動物為家兔。
4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于采用后肢內(nèi)側(cè)肌肉多點(diǎn)注射方法.
5、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，具體步驟為(1) 克隆目標(biāo)基因cDNA:以常規(guī)方法制備含目標(biāo)基因RNA的總RNA，反轉(zhuǎn)錄 成為第一鏈cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增,擴(kuò)增出的目的片段，然后克隆入TA載 體，并進(jìn)行測序鑒定；(2) 真核表達(dá)載體構(gòu)建將目標(biāo)cDNA亞克隆入改造過的pcDNA3.0載體，或 其它含CMV啟動子的真核表達(dá)載體；(3) 免疫程序用按常規(guī)堿裂解法大規(guī)模提取睡美人轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒和所構(gòu)建的 重組質(zhì)粒，純化后HBS溶解，得到2ug/uL的溶液，將已經(jīng)制備的重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn) 座酶質(zhì)粒按4: l混勻，用基因包裹劑PEI按PEI:質(zhì)粒=2: l包裹后，37'C溫育 IO分鐘備用；取家兔，以上混合物多點(diǎn)注射后肢內(nèi)側(cè)肌肉，每兩周注射一次，注射劑量為每克體重注射重組質(zhì)粒liig， PEI與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按比例混合，共注射三次，在第18 周加強(qiáng)免疫一次。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所說的基因免疫方法，其特征在于，其中所說的TA載體， 是pMD19-T或pGEM-T。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所說的基因免疫方法，其特征在于，改造過的pcDNA3.0 載體，是用/V"II切除了其中的neo基因及其表達(dá)調(diào)控序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因免疫方法。所說的方法是以常規(guī)方法克隆目標(biāo)基因cDNA，然后構(gòu)建含目標(biāo)抗原cDNA的真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒作為免疫佐劑；將真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按4∶1混勻，然后用基因包裹劑PEI按PEI∶質(zhì)粒＝2∶1包裹，按每克體重注射1微克質(zhì)粒的劑量為進(jìn)行動物免疫。該方法能顯著促進(jìn)抗體效價(jià)的提高，建立了一種簡單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、高效的抗體制備方法，可以進(jìn)行多種商業(yè)化抗體的生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/79GK101279097SQ20081012360
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月22日
發(fā)明者晗 吳, 孫麗亞, 宋成義, 王宵燕, 飛 謝, 芹 趙, 陳國宏, 波 高 申請人:揚(yáng)州大學(xué)