專利名稱：一株組成型酸性內(nèi)切纖維素酶高產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株組成型酸性內(nèi)切纖維素酶高產(chǎn)菌株。
背景技術(shù)：
纖維素酶是將纖維素及其衍生物水解成葡萄糖的一組酶的總稱。 一組完整的纖維
素酶系通常有相互協(xié)同催化水解纖維素的三類酶組成內(nèi)切纖維素酶(CMCase)、外 切纖維素酶和|5-葡萄糖苷酶。內(nèi)切纖維素酶主要作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)， 隨機(jī)水解p-l，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，并產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分 子纖維素；外切纖維素酶再將小分子纖維素降解生成纖維二糖和葡萄糖；最后由卩-
葡萄糖苷酶將纖維二糖徹底降解為葡萄糖。因此，內(nèi)切纖維素酶在生物質(zhì)的降解過程
中發(fā)揮了最關(guān)鍵的作用。按催化反應(yīng)的最適pH，可將內(nèi)切纖維素酶分為酸性內(nèi)切 纖維素酶(最適pH3 5)、中性內(nèi)切纖維素酶(最適pH6 8)、堿性內(nèi)切纖維素酶(最 適pH8 10)。酸性纖維素酶已廣泛應(yīng)用于紡織、造紙以及食品加工等行業(yè)中在棉 織物整理上，經(jīng)過酸性纖維素酶整理后，棉織物的手感和外觀獲得很大的改善；在舊 紙脫墨中過程中酸性纖維素酶可以在較低pH值的紙漿中進(jìn)行脫墨；酸性纖維素酶還 廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜汁以及橄欖油的提取，果汁的澄清等食品加工過程中。
能產(chǎn)生內(nèi)切纖維素酶的微生物主要是真菌和部分細(xì)菌。真菌所產(chǎn)纖維素酶多為酸 性胞外酶且產(chǎn)酶效率高，且酶系結(jié)構(gòu)完整，但真菌所產(chǎn)纖維素酶都是復(fù)合酶，且酶系 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大，不易分離提取，通常其產(chǎn)酶過程需要加入纖維素類物質(zhì)進(jìn)行誘 導(dǎo)，且發(fā)酵周期長，因此在工業(yè)用酶開發(fā)方面顯示出了諸多不足。細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶 雖然成分單一 (即通常只含有一類纖維素酶)，可以簡化提取步驟，但是細(xì)菌纖維素 酶多為中性或者堿性胞內(nèi)酶，多吸附于菌壁，且其酶活普遍較低，另外，大部分菌株 產(chǎn)誘導(dǎo)型內(nèi)切纖維素酶，需要添加誘導(dǎo)物，不適應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，目前 的研究工作一直圍繞著篩選可產(chǎn)組成型纖維素酶甚至酸性纖維素酶，且其產(chǎn)酶為胞外 產(chǎn)物，酶活高，酶純化工藝方便的優(yōu)良菌種而進(jìn)行。
目前對于組成型高效纖維素酶生產(chǎn)細(xì)菌的研究較少，90年代日本花王公司曾報道 了一株組成型纖維素高產(chǎn)野生菌株J/to/opWfc KSM-635，該菌株在無誘導(dǎo)劑存在時發(fā)酵液上清中堿性纖維素酶活力為2.202 IU/mL，而在木聚糖的誘導(dǎo)下酶活可 提高到原來的三倍(堿性纖維素酶的生產(chǎn)方法，昭63:112981)。而國內(nèi)近幾年所報道 的高產(chǎn)纖維素酶野生菌株都需要添加纖維素類誘導(dǎo)物，如沈雪亮等用剛果紅染色法從 腐爛的廢紙漿中篩選得到嗜堿菌株ZU-04,在CMC誘導(dǎo)后酶活可達(dá)5.37 IU/mL (產(chǎn) 纖維素酶細(xì)菌的篩選及酶學(xué)特性研究.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2002， 22(1): 47 51 )。對于開 發(fā)高活力的纖維素酶降解菌株以及高催化能力的特殊纖維素酶仍是纖維素酶研究領(lǐng) 域的瓶頸問題，因此對于有效的纖維素酶產(chǎn)生菌以及多功能纖維素酶、組成型纖維素 酶產(chǎn)生菌株的開發(fā)工作具有較高的理論和實際應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一株高產(chǎn)組 成型纖維素酶的菌株，使得該菌株產(chǎn)生的纖維素酶具有pH穩(wěn)定性好、催化能力強(qiáng)， 適合較高的酶反應(yīng)溫度、耐金屬離子等，并適合于紡織、造紙以及食品加工等行業(yè)的 優(yōu)良酶學(xué)特性。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)-
一、本發(fā)明從富含植物纖維素的土樣中篩選到一株組成型酸性內(nèi)切纖維素酶高產(chǎn) 菌株，分類命名為枯草芽孢桿菌5acz7/m w^'to LC,保藏登記號為CCTCC No: M 208073。
取南京森林地區(qū)土樣加入液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)5d 7d后在相同的培養(yǎng)基中共 轉(zhuǎn)接三次。將經(jīng)過富集培養(yǎng)后的菌液作適當(dāng)稀釋，取稀釋液，涂平板培養(yǎng)。培養(yǎng)約 24h后，用接種環(huán)挑出同一平板上不同形態(tài)的細(xì)菌菌落，再轉(zhuǎn)接到平板上進(jìn)行單菌落 分離，最終得到42株細(xì)菌。將每株菌分別接種于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培 養(yǎng)36h，取發(fā)酵液進(jìn)行剛果紅平板的快速篩選。經(jīng)反復(fù)實驗篩選得到一株在兩種培養(yǎng) 中均能產(chǎn)生明顯透明圈的菌株，將其命名為LC。
本發(fā)明將LC經(jīng)BIOLOG全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定，表明該菌株與芽孢桿菌A^7/m w^/fc相似度(SIM)為0.95，分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫匹配度(PROB)都到達(dá)100。通 過對菌株LC的16SrDNA序列測定(具有SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列，序列 長度為1542 bp)，采用BLAST分析表明該菌的16SrDNA與GenBank中 w^/fc的序列同源性高達(dá)99.7%，與Biolog的生理生化性能鑒定結(jié)果一致，因此將 該菌株命名為5"c/腸勵"fc LC。
4本發(fā)明對5fld//2^ sw^/fc LC的生物特征進(jìn)行了鑒定。該菌種的形態(tài)特征為菌落呈白色，半透明；菌落表明平坦、濕潤，邊緣皺褶、粘稠；革蘭氏染色鑒定陽性；顯微鏡下觀察個體形態(tài)為長桿狀，菌體中間有芽孢，邊緣有莢膜。該菌株好氧，最佳生長和產(chǎn)酶溫度為35t:，最適pH為5.0 5.5。
二、 本發(fā)明從枯草芽孢桿菌fiadW"s w6rito LC中提取出其胞外產(chǎn)物組成型內(nèi)切纖維素酶
1、 細(xì)胞培養(yǎng)
將枯草芽孢桿菌B"c7'//^ ;y"^/fc LC接種于固體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)10 12 h后轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)基，37r條件下培養(yǎng)10 12h;以2%接種量再轉(zhuǎn)接液體發(fā)酵培養(yǎng)基37°C條件下培養(yǎng)36 h; 2、 胞外產(chǎn)物粗酶液的處理
將發(fā)酵液冷凍離心，取上清，即得粗酶液；取粗酶液于pH7.0的Na2HP04-citrate緩沖溶液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經(jīng)0.45tim微孔濾膜過濾除雜，保存濾液。
3、 離子交換層析
預(yù)先用pH7.0的Na2HP04-citrate緩沖液充分平衡DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換柱，上樣后用pH7.0的Na2HPCVcitrate緩沖液洗脫，收集穿透峰，用含有1 mol/LNaCl的pH 7.0的Na2HP04-citrate緩沖液洗脫雜蛋白，柱子用pH 9.0的Tris-HCl緩沖液重新平衡。將穿透峰濃縮調(diào)節(jié)pH至9.0，再次上樣，采用0—lmol/LNaCl梯度洗脫，并收集有酶活的洗脫峰。
三、 利用本發(fā)明的酶提取方法得到了一種組成型內(nèi)切纖維素酶，并對該酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)鑒定。
本發(fā)明從枯草芽孢桿菌^c///^ LC產(chǎn)生的酸性組成型內(nèi)切纖維素酶LC的比活力高達(dá)1650.67 IU/mg,對CMC-Na催化時米氏常數(shù)Km為0.0423 g/L， Vmax為135.85 mg/min，與報道菌株相比，具有更高的催化能力。
本發(fā)明從枯草芽孢桿菌B""7/m w^/to LC產(chǎn)生的組成型內(nèi)切纖維素酶LC的最適反應(yīng)pH為5.0;該酶在pH4.0 11.0的緩沖液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90%以上，體現(xiàn)了較好的pH穩(wěn)定性；最適反應(yīng)溫度為60 65'C;具有耐Na+、 K+、Li+、 Ca2+、 Ni2+、 Zn2+、 Mg2+、 Cu2+、 Fe2+、 Co2+、 Mn2+、 Ba2+、 Pb2+、 Fe3+等金屬離子的良好特性，EDTA對酶活性影響甚微，該酶為非金屬離子纖維素酶。因此，從本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Bac77/"s認(rèn)Z^'fe LC中提取的組成型內(nèi)切纖維素酶LC可確定為優(yōu)良的組成型酸性內(nèi)切纖維素酶。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和有益效果
(1) 本發(fā)明所篩選到的枯草芽孢桿菌S"c///^ s"Z^'似LC屬于罕見的組成型纖維素酶高產(chǎn)菌株。與當(dāng)前工業(yè)用酶的細(xì)菌菌株相比，發(fā)酵產(chǎn)酶周期短，酶活力高，且產(chǎn)酶過程無需誘導(dǎo)因此其產(chǎn)生的纖維素酶即為組成型纖維素酶，因此該菌適用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)的特點。
(2) 從本發(fā)明枯草芽孢桿菌5ac!7/w strife LC提取的組成型內(nèi)切纖維素酶比活達(dá)1650.67 IU/mg，對CMC-Na催化時米氏常數(shù)Km為0.0423 g/L， Vmax為135.85mg/min，與報道菌株相比，具有更高的催化能力；該酶最適反應(yīng)pH為5.0，為罕見的酸性組成型纖維素酶；該酶在pH4.0 11.0的緩沖液中保存2 h酶活力可保持最高酶活的90%以上，體現(xiàn)了較好的pH穩(wěn)定性；最適反應(yīng)溫度為60 65'C;具有耐Na+、K+、 Li+ 、 Ca2+、 Ni2+、 Zn2+、 Mg2+、 Cu2+、 Fe2+、 Co2+、 Mn2+、 Ba2+、 Pb2+ 、 Fe3+等金屬離子的良好特性，EDTA對酶活性影響甚微，該酶為非金屬離子纖維素酶，顯示了良好的特性，在紡織、造紙以及食品加工等工業(yè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
綜上，本發(fā)明所述的組成型酸性內(nèi)切纖維素酶的高產(chǎn)細(xì)菌菌株可以填補(bǔ)目前在研究酸性內(nèi)切纖維素酶領(lǐng)域存在的諸如酶比活力低，底物催化能力差、不耐金屬離子及EDTA或者依賴金屬離子以及pH穩(wěn)定性差等不足。


圖1剛果紅杯碟快速鑒定LC酶活的結(jié)果
圖2提取組成型內(nèi)切纖維素酶LC的SDS-PAGE電泳圖譜
其中標(biāo)記為1，發(fā)酵液粗酶液；2，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；3， DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換pH7.0穿透液；4， pH 9.0時DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換后纖維素酶液。
圖3 CMC-Na為底物的米氏方程雙倒數(shù)曲線
圖4內(nèi)切纖維素酶LC的最適pH
圖5內(nèi)切纖維素酶LC的pH穩(wěn)定性
圖6內(nèi)切纖維素酶LC的最適溫度
圖7內(nèi)切纖維素酶LC的熱穩(wěn)定性
圖8不同濃度金屬離子對纖維素酶LC活力的影響本發(fā)明的微生物分類命名為枯草芽孢桿菌^ c///^ LC，保藏日期為2008
年5月19日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏登記號為CCTCC No: M 208073。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例l
本實施例說明枯草芽孢桿菌W^'fc LC的篩選過程其中篩選所用培養(yǎng)基為-
液體培養(yǎng)基配方(g/L): 3.0KH2PO4， 0.3 MgS04-7H20， 5.0蔗糖，15.0蛋白胨，30mL/L玉米漿。
發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L): 3.0KH2PO4， 0.3 MgS04'7H20， 5.0酵母膏，15.0蛋白胨。誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L):在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5g/LCMC-Na。剛果紅平板培養(yǎng)基(g/L): 3.0KH2PO4， 0.3 MgS04-7H20, 5 CMC-Na。取南京森林地區(qū)土樣約0.5 g，加入液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)(30°C， 180r/min)，培養(yǎng)5d 7d后轉(zhuǎn)接，在相同的培養(yǎng)基中共轉(zhuǎn)接三次。將經(jīng)過富集培養(yǎng)后的菌液作適當(dāng)稀釋，稀釋梯度根據(jù)培養(yǎng)液的渾濁度而定(105 107倍)。取IOO pL稀釋液，涂平板培養(yǎng)。培養(yǎng)約24h后，用接種環(huán)挑出同一平板上不同形態(tài)的細(xì)菌菌落，再轉(zhuǎn)接到平板上進(jìn)行單菌落分離，最終得到42株細(xì)菌。將每株菌分別接種于發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h，取發(fā)酵液進(jìn)行剛果紅平板的快速篩選。經(jīng)反復(fù)實驗篩選得到一株在兩種培養(yǎng)中均能產(chǎn)生明顯透明圈的菌株，將其命名為LC。
從附圖2中可以看出，菌株LC在添加誘導(dǎo)劑(圖中B)和未添加誘導(dǎo)劑(圖中A)的培養(yǎng)液中都有較強(qiáng)的纖維素酶活力(A、 B分別為菌株LC在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中發(fā)酵液，下標(biāo)為稀釋倍數(shù))，而誘導(dǎo)型對照菌株只有在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(C+ )中才能產(chǎn)生透明圈(C.、 C+分別為誘導(dǎo)型對照菌株在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中發(fā)酵液，無稀釋)，表明新篩選的菌株LC很可能產(chǎn)生組成型的纖維素酶。從透明圈大小來看，LC發(fā)酵液稀釋10倍(A1()、 B10)和100倍(Au)o、 B咖)后仍顯示明顯透明圈，顯示了較強(qiáng)的內(nèi)切纖維素酶活力(中間D為飼料級纖維素酶(0.067IU/mLCMCase)產(chǎn)生透明圈情況)。
7本發(fā)明將LC經(jīng)BIOLOG全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定，表明該菌株與芽孢桿菌Bac!7Zws相似度(SIM)為0.95，分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫匹配度(PROB)都到達(dá)100。通過對菌株LC的16SrDNA序列測定(具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，序列長度為1542 bp)，采用BLAST分析表明該菌的16SrDNA與GenBank中sw&rifc的序列同源性高達(dá)99.7%，與Biolog的生理生化性能鑒定結(jié)果一致，因此將該菌株命名為5fltc/腸sw6,/fc LC。
本發(fā)明對5ac///^ ^6//to LC的生物特征進(jìn)行了鑒定。該菌種的形態(tài)特征為菌落呈白色，半透明；菌落表明平坦、濕潤，邊緣皺褶、粘稠；革蘭氏染色鑒定陽性；顯微鏡下觀察個體形態(tài)為長桿狀，菌體中間有芽孢，邊緣有莢膜。該菌株好氧，最佳生長和產(chǎn)酶溫度為35",最適pH為5.0 5.5。
實施例2
本實施例說明從枯草芽孢桿菌5fla7/w w^/fc LC中提取酸性組成型內(nèi)切纖維素酶LC的方法。
1、 細(xì)胞培養(yǎng)
固體培養(yǎng)基配方(g/L): 1.0KH2PO4， 0.5 MgS04'7H20, 5.0酵母膏，10.0蛋白胨，固體培養(yǎng)基pH為7.0 7.5;
液體培養(yǎng)基配方(g/L): 3.0KH2PO4, 0.3 MgS04'7H20， 5.0蔗糖，15.0蛋白胨，30 mL/L玉米漿，種子液培養(yǎng)基pH為7.0,發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始pH為5 5.5。
將枯草芽孢桿菌SaC/7/w>s LC接種于固體培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)10 12 h后轉(zhuǎn)
接50 mL/250 mL液體種子培養(yǎng)基，37°C 、 200 r/min條件下培養(yǎng)10 12h，以2%接種量再轉(zhuǎn)接50 mL/250 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基37°C 、 200 r/min條件下培養(yǎng)36 h。
2、 胞外產(chǎn)物粗酶液的處理
將發(fā)酵液以10000 r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于20 mmol/LNa2HP04-citrate pH 7.0緩沖溶液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經(jīng)0.45pm微孔濾膜過濾除雜，保存濾液。
3、 離子交換層析
本實施例所用DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換介質(zhì)購自Amersham PharmaciaBiotech., Uppsala， Sweden公司。BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒K3001 ，購自上海申能博采生物技術(shù)有限公司。Acrylamide、 N，N-甲叉雙丙稀酰胺由Serva進(jìn)口分裝。具體步驟將步驟2所得酶液進(jìn)行兩步DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換。預(yù)先 用pH 7.0 Na2HP04-citrate緩沖液充分平衡DEAE-Sephaxose FF弱陰離子交換柱，上樣 后用pH 7.0 Na2HP04-citrate緩沖液洗脫，收集穿透峰，用含有1 mol/LNaCl的pH 7.0 Na2HP04-citrate緩沖液洗脫雜蛋白，柱子用pH 9.0的Tris-HCl緩沖液重新平衡。將 穿透峰濃縮調(diào)節(jié)pH至9.0，再次上樣，采用0—lmol/LNaCl梯度洗脫，并收集有酶 活的洗脫峰，將活性峰濃縮后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。DEAE-Sepharose FF 離子交換柱條件如下
① 去除大部分雜蛋白
平衡緩沖20 mmol/L pH 7.0的Na2HP04-citrate緩沖液一A 洗脫緩沖20 mmol/L pH 7.0的Na2HP04-citrate緩沖液+1 mol/L NaCl _B 上樣流速1.5mL/min 洗脫流速1.5mL/min
洗脫方式0%8和100MB分段洗脫，收集穿透峰。
② 分離得到目標(biāo)蛋白
平衡緩沖20 mmol/L pH 9.0的Tris-HCl緩沖液一A 洗脫緩沖20 mmol/L pH 9.0的Tris-HCl緩沖液+l mol/L NaCl —B 上樣流速1.5mL/min 洗脫流速1.5mL/min
洗脫方式0%B 100%B梯度洗脫，分管收集蛋白峰，檢測酶活力和蛋白濃度， 得到含p-l，4-內(nèi)切纖維素酶活性峰的收集液。
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳按常規(guī)方法進(jìn)行。分離膠、濃縮膠濃度分別為12n/。 和5%,電極緩沖液為pH8.3Tris-Gly緩沖，考馬斯亮藍(lán)染色。
將提取各個步驟內(nèi)切纖維素酶液進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果如附圖2所示。表明粗酶液 依次經(jīng)柱前脫鹽濃縮處理、兩步DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換后，在SDS-PAGE 圖譜上呈單一條帶，達(dá)到電泳純。
內(nèi)切纖維素酶LC酶活測定方法為
取1%的羧甲基纖維素鈉(溶解于0.2 mol/L檸檬酸緩沖液)l.O mL作為底物，加入 0.5 mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶溶液，在特定條件下反應(yīng)30 min ，用DNS法測定還原 糖，并扣除空白試驗測定值。將在上述條件下每分鐘由底物產(chǎn)1 pmol還原糖所需的 酶量定義為一個活力單位，用IU/mL表示。內(nèi)切纖維素酶LC提取結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，該酶提純了 542.98倍，比活 力達(dá)1650.67 IU/mg，酶活回收率為61.91%。
表l內(nèi)i切纖維素酶LC的分離提取
總活力總蛋白比活力酶活回收率純化倍數(shù)
(IU)(mg)(IU/mg)(%)(fold)
粗酶液100.9533.263.041001
樣品前處理76.495.4913.9375.774.58
DEAE-S印hadexA50 (pH7.0)74.490.0551362.3473.79448.14
DEAE-SephadexA50 (pH 9.0)62.490.0381650.6761.91542.98
實施例3
本實施例說明從枯草芽孢桿菌5fld//^ w6說/s LC中提取的酸性組成型內(nèi)切纖維 素酶LC的相關(guān)性質(zhì)
(一) 基本動力學(xué)常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax的測定
以不同濃度的CMC-Na作為底物，在最適催化溫度(65'C)和最適pH (pH5.0) 條件下，測定酶促反應(yīng)速度，再用雙倒數(shù)作圖得到Km值和Vn^，如附圖3所示，其 中1/V = 0.05607+ 1.32496 xl/S。
內(nèi)切纖維素酶LC的米氏常數(shù)Km為0.0423 mg/mL， V皿為135.85 mg/min。表明 該內(nèi)切纖維素酶LC對底物羧甲基纖維素鈉的親和性更強(qiáng)，有很強(qiáng)的催化能力。
(二) 酶學(xué)性質(zhì)
1、 酶蛋白分子量的測定
用SDS-PAGE電泳發(fā)測定，結(jié)果如附圖2。電泳后用GEL-DOC2000 (Bio-Rad) 進(jìn)行凝膠掃描。運(yùn)用掃描系統(tǒng)自帶軟件QuantityOne進(jìn)行分子量測定，測得內(nèi)切纖維 素酶LC酶蛋白分子量為29kD，屬于低分子量內(nèi)切纖維素酶(分子量25 50kD)。
2、 酶的最適pH
用各種緩沖配制不同pH值的CMC-Na底物。將提取后的內(nèi)切纖維素酶LC與不 同pH值CMC-Na底物反應(yīng)，65'C條件下反應(yīng)30min，并檢測CMCase活力，如附圖 4所示。內(nèi)切纖維素酶LC在中性偏酸性的具有較高的活力，在pH5.0 7.0范圍內(nèi)具 有很高的活力，達(dá)到最高酶活的80%以上，其最適反應(yīng)pH為5.0，為酸性纖維素酶。
3、 酶的pH穩(wěn)定性
提取后的內(nèi)切纖維素酶溶解于不同pH緩沖液中，20'C條件下放置2h后，測定
10纖維素酶相對活力，如附圖5所示。結(jié)果表明該內(nèi)切纖維素酶LC在較寬的pH范圍 內(nèi)顯示了高度的穩(wěn)定性，在pH4.0 11.0的緩沖液中能保持其最高酶活85^以上，顯 示了良好的pH穩(wěn)定性，在紡織、造紙以及食品加工行業(yè)有良好的應(yīng)用潛力。
4、 酶的最適反應(yīng)溫度
將內(nèi)切纖維素酶LC純酶分別放置于不同溫度下反應(yīng)30 min，測定其酶活如附圖 6所示。結(jié)果表明內(nèi)切纖維素酶LC在60 65'C反應(yīng)時具有較高的活力，其最適溫度 為65。C。
5、 酶的熱穩(wěn)定性
提取的酶液分別于25。C、 30'C、 40°C、 50°C、 60°C、 70'C放置2小時后65。C條 件下反應(yīng)30min，每隔10min取樣一次，檢測CMCase活力。結(jié)果如附圖7所示，表 明LC對溫度較敏感，在低于4(TC條件下處理2 h酶活可保持80%以上，而在5(TC和 6(TC處理30 min，酶活殘留69%和67%， 7(TC條件下酶活直線下降。可見該纖維素 酶在4(TC以下顯示出良好的穩(wěn)定性，在室溫25'C條件下酶活基本不變。
6、 金屬離子對內(nèi)切纖維素酶LC活力的影響
在三個濃度水平1 mmol/L、 5mmol/L、 10 mmol/L探討Na+、 K+、 Li+—價金屬 離子；Ca2+、 Ni2+、 Zn2+、 Mg2+、 Cu2+、 Fe2+、 Co2+、 Mn2+、 Ba2+、 Pb2+二價金屬離子； Fe"三價金屬離子以及EDTA對CMCase活力的影響。4'C下放置30 min， 65'C條件 下反應(yīng)30min，并檢測CMCase活力。以不加金屬離子的酶活為對照測定酶的相對活 力。結(jié)果如附圖8所示，低濃度(lmmol/L)的金屬離子存在條件下，大部分金屬離 子可明顯促進(jìn)內(nèi)切纖維素酶活力，1 mmol/L的C^+可將酶活提高至原來的 157.72%，；中等濃度(5mmol/L)的金屬離子存在條件下，大部分金屬離子可提高纖 維素酶活力，其中Co2+、 012+的促進(jìn)作用最顯著，分別可將酶活提高至原來的136.6% 和121.3%;高濃度(10 mmol/L)的F^+可提高酶活力。此外實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的 EDTA對酶活力影響不大，推領(lǐng)IJ內(nèi)切纖維素酶LC很可能為非金屬離子纖維素酶，金 屬離子對該酶有一定的促進(jìn)作用。表明該酶符合紡織、造紙以及食品加工行業(yè)應(yīng)用的 基本要求。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、 簡化、均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。序列表
〈110〉南京工業(yè)大學(xué)
<120> —株組成型酸性內(nèi)切纖維素酶高產(chǎn)菌株 <130〉 njut200808 〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3.3
〈210> 1 <211> 1542 〈212〉 DNA
〈213〉 fe"77〃s s"力"仏LC 〈400> 1
agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct ac卿tggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa cgcatggttc aaacataaaa ggtggcttcg gctaccactt ttagctagtt ggtgaggtaet tggctcacca aggcaacgat tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtaccgtt cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta a鄉(xiāng)gctcgc tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa 3g3ggagagt ggwttccax: gtgtsgcggt gsaatgcgts tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga
aatacatgca agtcgagcgg 60
tgagtaacac gtgggtaacc 120
taccggatgg ttgtttgaac 180
acagatggac ccgcggcgca 240
gcgtagccga cctg卿ggg 300
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gtgagtgatg aaggttttcg 420
cgaatagggc ggcaccttga 480
agccgcggta atacgtaggt 540
鄉(xiāng)cggtttc ttaagtctga 600
ctggggaact tgagtgcaga 660
gagatgtgga ggaacaccag 720
gcgaaagcgt ggggagcgaa 780caggatt卿taccctggta gtccacgccg t犯acgatga gtgctaagtg ttagggggtt 840
tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa 900
gactga犯ct caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960
cgaagcaacg cgaagaacct taccgggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga 1020
cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg 1140
ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggagga鄉(xiāng)tggggatgac gtcaaatcat 1200
catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa 1260
accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc 1320
gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagggttt gtaacacccg aagtcggtga 1440
ggtaaccttt taggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaac 1500
aaggtagccg tatcggaagg tgcggctgga tcacctcctt 154權(quán)利要求
1、一株組成型酸性內(nèi)切纖維素酶高產(chǎn)菌株，其分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis LC，菌種保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心應(yīng)用微生物中心，保藏日期為2008年5月19日，保藏登記號CCTCC M 208073。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組成型酸性內(nèi)切纖維素酶高產(chǎn)菌株，其特征在于其編 碼基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明從富含植物纖維素的土樣中篩選到一株組成型酸性內(nèi)切纖維素酶高產(chǎn)菌株，分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis LC，保藏登記號為CCTCC NoM 208073。本發(fā)明所篩選到的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis LC屬于罕見的組成型纖維素酶高產(chǎn)菌株。與當(dāng)前工業(yè)用酶的細(xì)菌菌株相比，發(fā)酵產(chǎn)酶周期短，酶活力高，且產(chǎn)酶過程無需誘導(dǎo)因此其產(chǎn)生的纖維素酶即為組成型纖維素酶，因此該菌適用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)的特點。
文檔編號C12N1/20GK101643708SQ200810124679
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者何冰芳, 斌 吳, 柏中中, 歐陽平凱, 婧 許 申請人:南京工業(yè)大學(xué)