專利名稱：核酸探針固定化基體和用其檢測(cè)靶核酸存在的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉^檢測(cè)M酸存在的核酸探針固定Z^^體，以及^^I該基體的 核^^^測(cè)方法。絲背景近年來(lái)伴l^"基因X^呈學(xué)的j^L在醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)已能利用基因進(jìn)行疾病診 B^預(yù)防。這些#^為基因診斷。例M過(guò)檢測(cè)形成疾病原因的人類基因缺陷 和變化，可在疾病^前或者極早期階lfc^械疾病的診W^觀'J。開(kāi)展了對(duì) 人類染色體組破譯，4因類型與疾病相關(guān)連的研究，與^Mt人的基因類型相 吻合的治療(^一，一X卜'醫(yī)療)HkJB^成為現(xiàn)實(shí)。因此，簡(jiǎn)《t^ii行基因 的檢測(cè)、和基因類型的確定是^7重要的。^jfcil種基因)l^斤中尤為引人注意的是^:稱作DM切片或DNA^J^列的裝 置(jH^h將兩者,為DNA切片)。DNA切片是^"將由多種4^JJ^列構(gòu)成的 多個(gè)核酸探針固定^feUi的裝置。通過(guò)^^J這樣的DM切片，在一次微中， 可檢測(cè)出多種的姊酸。然而，具有這樣的狄，另一方面，存在于糾中不 同姊酸的雜^L率不同，有Bt^情況，只食將到非常低的雜^t率。^^于上述狀況，本發(fā)明的目的是提供可以高效率進(jìn)行雜交的探針固定^4體。JJi目的，通過(guò)如下本發(fā)明的形態(tài)即可達(dá)到。即， (1)核酸探針固定^^體，具有基體，和通過(guò)間隔基固定在上ii^體上 ^"有與乾序列互^卜的^i^列的核^^^^，《持征是，上述間隔^&是如下 的間隔基，即，將其^1取為X，對(duì)于上述核酸探針在其-"^分含有上ii^列的姊酸進(jìn)行雜交時(shí)，從該雜交艦的基體側(cè)絲到上述姊酸的基體側(cè)末端的長(zhǎng)^^^為Y時(shí)，X^Y的關(guān)系成立。(2 M^] 了上述(1)記，酸探針固定^M^^M^測(cè)M酸存在的方法， 包脅下工序，即，4M選鄉(xiāng)引物，使其X和Y滿足X^Y的關(guān)系，對(duì)^#核 酸進(jìn)W增的工序、 1得適當(dāng)雜交的*下，使利用JJiT增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與固定^Ji 述(l)中記載的核酸^^針固定^fc^體上的核酸探4f"ii行^的工序、和通過(guò)檢測(cè)利用JJ^JI工序生成的雜交，判斷在^f"核酸中存^fe^酸的 工序；和(3)核酸檢測(cè)方法，在^fM具有基體、和固定在上il&體上，并舍有與 乾序列互補(bǔ)的序列的核酸探針的核酸探針固定^^體，抬-測(cè)^i亥乾序列的M 酸的方法中，包括以下步驟(a) 在用辦列將該姊酸與上述核酸探她行雜交時(shí)，準(zhǔn)備用于擴(kuò)增該 M酸的引物，^JJtM酸的;M^i于從該M列^Mi的基體侗J^部到40(b) 4^IJiit(a)中準(zhǔn)備的引物，#^#核酸擴(kuò)增，(c) 將上述(b)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物形成單鏈，(d) 將JJi(c)中得到的單鏈與上述核酸探4f^行^，(e) 通過(guò)檢測(cè)Jiil(d)中生成的雜交，檢測(cè)出該^f"核酸中姊酸的存在。


圖1A是表示本發(fā)明核酸探針固定^^體一例的平面圖，圖1B是沿圖1A 中B-B線剖切的剖面圖。 i圖2 A^示4^發(fā)明核^^^固定^J^體""^的圖。圖3 ;^^示核酸^^N^^^^狀態(tài)的圖。圖4是實(shí)施例中表示所用核酸探4Hp姊酸的模式圖。圖5是表示X和Y的關(guān)系曲線圖。圖6A是實(shí)施例中表示所用的含糾間隔基的核酸探針與姊麟合狀態(tài) 的圖，圖6B是實(shí)施例中表示才娥進(jìn)^^所得結(jié)果的圖。圖7A是實(shí)施例中表示所用的含糾間隔基的核酸探針與姊麟合狀態(tài)才娥進(jìn)^^所得結(jié)果的圖。圖8A是實(shí)施例中表示所用的含糾間隔基的核酸探針與姊麟合狀態(tài)的圖，圖8B是實(shí)施例中表示才娘進(jìn)^^所得結(jié)果的圖。 圖9是實(shí)施例中表示所用擴(kuò)增片段與核酸探針的關(guān)系圖。 圖10是實(shí)施例中表示才緣進(jìn)"fm^所得結(jié)果的曲線圖。 圖ll是實(shí)施例中表示所用擴(kuò)增片段與核酸探針的關(guān)系圖。 圖12是實(shí)施例中表示才緣進(jìn)^^所得結(jié)果的曲線圖。 圖13是實(shí)施例中表示##進(jìn)#^^所得結(jié)果的曲線圖。實(shí)施義明的最佳形態(tài) 1.發(fā)明to本發(fā)明M上^:具有J^體和通過(guò)間隔基固定在上述基體上核酸探針的核 酸探針固定^&體。本發(fā)明:lfc^于本發(fā)明者們的如下發(fā)現(xiàn)，即，利用特定間 隔基的^JL，可有^^4W的雜交。即，擬娥本發(fā)明形態(tài)的核酸探針固定4t^體中，通過(guò)如下間隔基，使核 酸探41^J^^行固定。即，將間隔基的")^1取為X，對(duì)于上述核酸探針，其 "-^分上含有上i^fe^列的姊酸雜交時(shí)，從該雜交^Mi的基體側(cè)絲到上述 M酸的基體,'J^的^1取為Y時(shí)，X^Y的關(guān)系^iL。才^本發(fā)明形態(tài)的核酸探針固定^J^體的測(cè)定原理如下。該核酸探4H殳計(jì) 具有與把序列互補(bǔ)的序列。試料核酸中存^Mfe序列時(shí)，在該核酸探針固定^^ 體上產(chǎn)生雜交。因此，錄明的裝置，J^Jiitit^測(cè)該雜交的結(jié)^4在產(chǎn)生 二^^核酸，或者通過(guò)檢測(cè)存在與該核酸探4Hi行雜交的核酸，即可檢測(cè)出存 在于試料核酸中的乾序列。此處使用的"檢測(cè)雜交"術(shù)語(yǔ)，是悉4^^4示檢 測(cè)產(chǎn)生的二^S^核酸、或賴先利用某種標(biāo)識(shí)物質(zhì)對(duì)^#核酸進(jìn)^#識(shí)中，檢 測(cè)雜交后來(lái)自該標(biāo)識(shí)物質(zhì)的信號(hào)，或者利用其自身^^的M方法， 檢測(cè)二^N^核酸的存M雜交的產(chǎn)生的術(shù)語(yǔ)。這種雜交的檢測(cè)，例如可利用下述的電化學(xué)檢測(cè)或熒it^測(cè)進(jìn)行。這種電化學(xué)的檢測(cè)時(shí)，核酸探針固定^^體，J^^是對(duì)于配^t^體上可 檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)的電極，可通過(guò)間隔基與所要求的核酸探4f^成固定化而得到。在^^1^^質(zhì)等標(biāo)識(shí)物質(zhì)進(jìn)^"測(cè)時(shí)，核酸探針固定^J-體，^i^是可通過(guò)間隔基4W斤要求的核酸探針形成固定化而得到。2. 用語(yǔ)的i兌明jtbAH^I的"核酸"的^^^"是悉"^^^^^^核酸(即，RNA)、 ^LIt^糖核 酸(即，DM)、肚核酸(即，PNA)、甲基磷酸酯核酸、S^氐聚、cDNA和cRNA 等、及^^f^^核苷酸和多核苷酸等、核酸及核酸類似體的術(shù)語(yǔ)。這樣的核酸 可以A^J^"在的，也可以^AX^^成的。艦所說(shuō)的"核酸探4f5是指在含有與狄列互補(bǔ)的>5^^列核酸中， 用于向基體上固定的核酸片段。核酸探針具有與所要求的乾序列互補(bǔ)的序列。 由此，可^it宜的條降下與乾序列ii行雜交。M所說(shuō)的"辦列"是指^^測(cè)^4在的^5ttJ^列，或者利用核酸探 針的>^^序列要捕捉的序列。還有，#^有這種耙凈列的核酸稱為*^亂jH^h使用的"互補(bǔ)"、"互補(bǔ)的"和"互補(bǔ)性"的術(shù)語(yǔ)是指可以在50%~100% 范圍內(nèi)互補(bǔ)的，；^^是100%互補(bǔ)的。jlM:使用的"間隔基"的術(shù)語(yǔ)是指配置^J^與核酸探針之間的，具有某 U的鏈狀物質(zhì)。構(gòu)成間隔基的物質(zhì)是核酸時(shí)，與乾序列互補(bǔ)的或進(jìn)行雜交部 分為探針，除jH^卜的部分分類成間隔基。it(^t使用的"間隔基^1"的術(shù)語(yǔ)是指在基體與核酸探針之間配置的鏈狀 襯狄。在基體上^J^如圖3所示的封閉劑時(shí)，將肚述間隔基的^JL減去 封閉劑的"ML，取為"間隔基^1"。3. 發(fā)明的形態(tài)首先，以下i兌明本發(fā)明的J^構(gòu)成實(shí)例。 (1)第l種形態(tài)使用圖1，說(shuō)明本發(fā)明的第1種形態(tài)。本發(fā)明的第1種形態(tài)核酸探針固定 ^J^體1， ^Ej-體2上具有的電極3上，具有借助間隔基4固定的核酸探針5 (圖1A和圖1B)。電極3與為讀出電信號(hào)的小塊6連接。圖1B中，為方Y(jié)統(tǒng) 見(jiàn)，用^示出間隔基4，用鏈M示出核酸探針5。這種核酸探針固定^^體1，例如利用其自身^i^的方法，將電 己勝 ^feJi，對(duì)于該電M面，通過(guò)間隔基使核酸探針固相化而使制i^為可能。本形態(tài)中，雖餘陣電極數(shù)取為6， ^Sg&見(jiàn)在1個(gè)基體上的電極數(shù)并不限于 這些。電極的配置圖案也不限定于圖1A所示，^^A員可才M^需要適當(dāng)變更設(shè)計(jì)。也可才緣需Jl^i參照電4MP對(duì)電極。這樣的核酸探針固定^^體^ 本發(fā)明范圍之內(nèi)。(2)第2種形態(tài)圖2模^ 示出了本發(fā)明第2種形態(tài)。本發(fā)明第2種形態(tài)的核酸探針固定 4^^體11，是在基體12上，具有借助間隔基13固定的核酸探針14 (圖2 )。 為方^^L，圖2中也用滅示出了間隔基13，用鏈城示出了核酸探針14。這樣的核酸探針固定^^體11 ，例如利用其自身/^p的方法，對(duì)于> ^1， 借助間隔基使核酸探針固相化，可以jtbii行制ito本形態(tài)中，配置在1個(gè)基體上的核酸探針數(shù)，并不限于 ，可4Nt要求 適當(dāng)變更，也可在1個(gè)基體上配置具有多種4^J^序列的核酸探針。多#/ 或多種的核酸探4)^基體的固相圖案，4^^J^A員可才緣需辦適當(dāng)變更 設(shè)計(jì)。這樣的核酸探針固定4^i^MML^發(fā)明范圍之內(nèi)。4.構(gòu)成##本發(fā)明的形態(tài)，雖然具有上述的J^J成，但借助于間隔基固定核酸 探針時(shí)，存在如下特征'詳^i井，本發(fā)明中^f錢的間隔基是如下的間隔基，即， 將間隔基的^1取為X并在其-^^"有上^fe^列的^^tJJt核酸探針 進(jìn)行雜交時(shí)，從該雜交部位的基體側(cè)絲到上ii^酸的基體側(cè)絲的"^^取 為Y時(shí)，X^Y的關(guān)系成立。圖3中示出一^核酸探針與姊酸的結(jié)合狀態(tài)。在圖3的左側(cè)，模^示 出了核酸^針固定4t^體30和-^:^酸的實(shí)例。對(duì)配X^基體31上的電極 32表面,進(jìn)行^^二氬鉀劑33aJMt閉劑33b的處理。通過(guò)該^^二氫鉀劑33a， 借助于間隔基34使核酸探針35固定在電極32上。對(duì)于這樣的核酸^^針35的 序列，其一^分上具有^JL補(bǔ)的辦列的JN^酸36朝咧示出在其附近。認(rèn)為從^#^^只以及細(xì)胞等對(duì)#^得的^，或M^^要^^其處^ 得的試料，由這些^#獲得的試(^核酸中，即佳^1含有J^檢測(cè)的乾序列的^ 酸，存^MMt酸的位置"it^各i^^的。圖3中左圖的^H"核酸36作為這種多 樣的乾核酸中平均的一個(gè)實(shí)例4ii^示。tbM^37以上的部分。從圖可明確知道，間隔基34的")^7 "X"，對(duì)于核 酸探針35，借助^列與姊酸36進(jìn)行雜交時(shí)，>^^列部分的基體#鵬到該M酸的基體側(cè);M^的^1^ " Y"。
X<Y時(shí)，具有與乾序列互補(bǔ)的序列的核酸探針35和乾核酸36的雜交效率 很低，即，這種情況下，考慮城酸的"j^l^^亥姊酸中^i己出的序列位置時(shí)， 被固定的核酸探針iH存在于基體表示附近。由此成為核酸探針 互為立體 障礙的原因，固相的基體成為立體障礙的原因。結(jié)果，可以推知核酸探4f^乾 核酸的雜^l率不可能充分。
與其相反，X^Y時(shí)，具有與乾序列互補(bǔ)的序列的核酸探針35與靼核酸36 的雜^t率很高。X^Y時(shí)，從圖3的右側(cè)可知，M列與核酸探針雜交時(shí)，存 在于基體31側(cè)的乾核酸36》b^序列形成部^it剩，即使如此，該過(guò)剩部分也 ;f峰，或者這種過(guò)剩部分就;f^"在。>^^酸的"^1和把序列的位置看，間隔 圖34具有充分的長(zhǎng)度，核酸探針在^溶劑中自由活動(dòng)的范圍4艮寬(即，自由 M分大)。iA^可提高在雜U應(yīng)中與乾序列相遇的概率。
圖5中示出X和Y的關(guān)系。圖5的曲線圖，^^軸為X的M，縱軸為Y的 長(zhǎng)復(fù)。中央的直^1Y-X的曲線圖。,本發(fā)明的形態(tài)，Y與X的^關(guān)系是X ^Y。圖中，為了姊錄固相的立體障礙變小，區(qū)域A是滿足X^Y的區(qū)域。 區(qū)域B包含在區(qū)域A內(nèi)，為了提高了核酸探針的自由度，是滿足X-50A^Y的 區(qū)域。區(qū)域C包含在區(qū)域B內(nèi)，是考;fl^錄酸探針時(shí)的費(fèi)用和數(shù)量時(shí)皿區(qū) 域。區(qū)域D是即使Y短于數(shù)10A時(shí)，為確保自由度，考慮J(] X需t定長(zhǎng)度以 上時(shí)可回避的M區(qū)域。再有區(qū)域E是Y為O、或者由于;fe^，有無(wú)間隔絲 其長(zhǎng)度對(duì)雜交效率不產(chǎn)生影響的區(qū)域。
實(shí)際Jiii，測(cè)時(shí)，多數(shù)情況是區(qū)域A， B， C和D，但l^發(fā)明的形態(tài)中， 怖&區(qū)域是區(qū)域C和區(qū)域D。
才M^^發(fā)明的旨意，例如X的長(zhǎng)^L界限可在20000A以下，hL可在10000A 以下。從合錄酸探針的側(cè)面考慮時(shí)，X狄的上限可為2000A (i^f目當(dāng)于核 酸中約400個(gè)堿基)，艦為1000A,更她為500A。即，X的長(zhǎng)^^i^^很長(zhǎng)時(shí)， 在合，酸探針時(shí)，有可能J^f^i^M。
為了滿足才^tJiii^發(fā)明形態(tài)的條降，可^i^^^乾序列時(shí)下工夫，也可在
對(duì)含M列的姊酸進(jìn)獄增時(shí)，^^^H^擇所用引物序列時(shí)下工夫。不僅 調(diào)節(jié)間隔基的狄，而Jitiiit種調(diào)整，可&U狄的雜^:率。
用作該間隔基的物質(zhì)實(shí)例，可以是有>1 1^狀分子，例如可以;i核酸、 和聚乙4、艦等。
例如間隔基是由核酸構(gòu)成的核酸間隔基時(shí)，^i^列^A不與^ 酸和可含在試料中的核酸相結(jié)合的序列。在利用下述電化學(xué)檢測(cè)進(jìn)，測(cè)產(chǎn)生
雜交的情況時(shí)，其中選取序列，最^"慮到與所用二^:的識(shí)別^[酸^的
結(jié)^5向，例如 埼久卜33258與J&^t和烏噪4^^結(jié)合，與胸腺^t和腺 嘌呤4膝易結(jié)合。另一方面，烏噤呤的連接序列難以合成。因此，更^X含 有胞^t或含有很多胞教的^J^列，艦由胸腺^t形成的或含有很多 胸^^^t的^&序列，只含有烏噪呤 嘌呤的或含有很多這些的>！^^
通itS&置這樣的間隔基，可使核酸探4t^^fe^酸ii^更高效率的雜交。
本發(fā)明中^^I的核酸探針，可以是-^I作探針的長(zhǎng)度。例如核酸探針的 "j^L可^^3個(gè)4^"^J!]約1000個(gè)4^長(zhǎng)，>fi^l0~200個(gè)>^^長(zhǎng)。
本發(fā)明中^^I的基體，可以A^與M列進(jìn)行雜交可固定核酸探針的基 體。這種基體的實(shí)例，例如可以是非多孑L性、石Jtt或半贈(zèng)的材質(zhì)，可以是具 有坑、溝或平表面的板狀，也可以是由球#立方體等立體形狀構(gòu)成的形態(tài)。 J-體并不P艮于it些，也可以用硅、玻璃等含氧^^:的M材料，^丙烯^、 絲乙烯和聚碳酸酯等塑橋聚^b等進(jìn)行制造。然而，也可以不^JU基體， 如下述將電極自身用作基體。
為進(jìn)行熒ife^^r測(cè)的核酸探針固定^f^^體時(shí)，對(duì)于上述^^T基體，可借助間 隔基固定核酸探針。為進(jìn)行電^^測(cè)的核酸探針固定^^體時(shí)，可以在Jii^任 何基體上配置可進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的電極，"^^核酸探針固狄該電^Lh,
本發(fā)明中可《M的電極，沒(méi)有特^P艮定，但可舉出，例如石墨、精碳、熱 解石墨、碳糊、碳纖維一類的碳電極、鉑、賴黑、金、鈀、銠一類的貴金屬電 極、IU欲、氧^b^、氧^#、氧^f^4&一類的氧"f膽電極、Si、 Ge、 ZnO、 CdS、 Ti02、 GaAs —類的^H^電極、鈥等。這些電極可用導(dǎo)電性高^(guò)^L^，也可 用單襯膜城，條要^3E可用^4面處理劑進(jìn)行處理。
借助間隔^iJit核酸探針的固定，可利用其自身^^的^T方法進(jìn)行。例如 也可以將間隔基對(duì)電極進(jìn)行固定，再對(duì)間隔基固定核酸探針?；蛘咭部?以預(yù)先使間隔基與核酸探4m合，再通過(guò)該間隔基固定在電板上。或者也可以 利用其自身^^的方法，在電^LL使核酸探針與間隔^gJi行合成。借助間隔基對(duì)核酸探針的固定，對(duì)于處^沒(méi)有處理的基體或電^面也可以通過(guò)共有結(jié) 合、離子結(jié)合或物理吸附等直接固定該間隔基?；蛘咭部梢越柚g隔基， 磷酸二氳鉀劑邦助核酸探針固定，也可以利用這樣的^^二氫鉀劑，借助于間 隔基，對(duì)J^l電極固定核酸探針。為防止^#核斷電極的非特異結(jié)合，也
可使封閉劑M酸二氫鉀劑"^t電^ut行處理。此處^M的^^二氫^r劑和 封閉劑，例如可以是有利于進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的物質(zhì)。
具有不同g的序列的核酸探針，也可分別借助間隔基對(duì)不同的電^ui行 固定，在"^^具有不同4tt^列的多種核酸探針的狀態(tài)下，也可借助間隔基 對(duì)電極進(jìn)行固定。
5.檢測(cè)
才緣本發(fā)明的核酸探針固定^J^體，作為用于檢測(cè)固定在上il^體上核酸 探4i^械酸之間存在雜^A^結(jié)果生成的二樣的方法，可利用電化學(xué)方法 和熒iU^測(cè)法。
(1)電化學(xué)^"測(cè)
利用電化學(xué)對(duì)二^^核酸的檢測(cè)，例如可用其自身>5^的二>^:識(shí)別物質(zhì) 進(jìn)行。
jH^H^U的二^^識(shí)別休，沒(méi)有特晰艮定，例如可^^、^》卜33258、 吖咬橙、嗇吖因、道諸霉素、金屬^^劑、二吖咬等雙^/V劑、三^A劑和多 ^A劑等。也可用電化學(xué)活性的金屬^^，例如二茂鐵、生物原等對(duì)這些嵌
入劑進(jìn)^ff^。 ^k/^p的^^r^^的識(shí)^物質(zhì)也可用于本發(fā)明。
在按照本發(fā)明的核酸探針固定4t^體中，借助于間隔基將核酸探針固定在 電紅。^^J這種電極的^^核酸的檢測(cè)，和^r^L的電化學(xué)檢測(cè)法相同，
進(jìn)而^^5pfMSe^^^照極。配置^^照極時(shí)，例如可^^1銀/氯^4艮電#汞/ 氯^^電極等"^:的參照電極。
例如^^測(cè)"^H"核酸中是否含有M酸時(shí)，可進(jìn)行如下淵^。例如從包括 人在內(nèi)的動(dòng)物等個(gè)體、組織或細(xì)胞等對(duì)象中^的試料，提Mr^^ft為試 料核酸。得到的^1"核酸，才娘需要進(jìn)^i^^制、延伸、擴(kuò)增和/或缺理等處
可適宜雜交的條降下i^行ijL這^適宜*， ^^^領(lǐng)^員可# 下諸
^Ht適當(dāng)選擇，即，M列中所含M的種類、核酸探針固定^4體上具有的間隔J^核酸探針的種類、^fr核酸的種類以及它們的狀態(tài)等。并不限定于
這些，例:^也^T在如下^f下ii^t^。
即，雜^JiM，在離子強(qiáng)^ 0.01~5的范圍、pH5 10的范圍的緩 沖液中進(jìn)行。^jfeit幹絲中，也可添加雜交^ii劑的石爐葡絲、^!t子DNA、 牛胸腺DM、 EDTA和表面活性劑等。向其中添加得到的^f"核酸，901C以Jiii
行熱變性。向熱變性的^H"核酸插入核酸探針固定^^體，可在剛變'1^或急 冷到OIC后進(jìn)行。絲，可向基體上滴加艦行雜^A^。
^中用，、或振蕩等M，可提高^(guò)I逸變。U溫度，例如在10 t: 90TC的范圍，A^時(shí)間可進(jìn)行1^4中以Ji^l夜。雜^^I后，'絲電極。 、^爭(zhēng)，例如可使用離子強(qiáng)度O. 01~5的范圍，pH5~10的范圍的緩沖液。* 核酸中存在含辦列的姊酸時(shí)，與核酸探4t"^行雜交，由此生^J^h^核酸。
接著，利用電化學(xué)方法，按以下順序檢測(cè)生成的^^^核酸。-*1在雜 U應(yīng)后，洗凈基體，使二^^識(shí)別體作用于電極表面形成的二^^部分，以 電化學(xué)測(cè)定由此產(chǎn)生的信號(hào)。
二^h^i只別體的濃度，隨其種類不同， 一般使用范圍為lng/m卜lmg/ml。 此時(shí)可^^l的緩沖液，離子強(qiáng)度0.01~5的范圍，pH5 10的范圍。
例如電化學(xué)的測(cè)定可以是;^使二^^識(shí)別體進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)電位以上 的電壓，測(cè)定來(lái)自二4^:識(shí)別體的反應(yīng)電流值。這時(shí)，電壓以定il掃描，或以 樂(lè)辦施加，或施加定電壓。測(cè)定時(shí)，例Vf^l恒電位計(jì)、數(shù)字萬(wàn)用^M函lJUt 生器等裝置，可控制電流、電壓。例如可^^得到的電;維，A^l:線算出靶 核酸的就
其自身公知的電化學(xué)檢測(cè)方法，例如以下文獻(xiàn)中公開(kāi)的(Hashimoto et al. 1994， Wang et al. 1998 )方法等，也可適用于本發(fā)明的方法中。該文獻(xiàn)中橋
基因。來(lái)自色素的陽(yáng)極電流與^i己的DM的^l相關(guān):王等人報(bào)導(dǎo)了無(wú)指示劑 的電化學(xué)DNA的雜交。這種生物傳感器的構(gòu)成包^J碳糊電極固^L^置， 針(不含烏嘌呤)，和利用該^i只的烏噪呤氧^^存^^測(cè)二重鏈形成的定時(shí) 電位。這些文獻(xiàn)中記載的檢測(cè)方法也可^^發(fā)明中使用。 (2)熒她測(cè)法
在C^焚; ^示識(shí)物質(zhì)的方法中，試<#核酸可用以下物質(zhì)標(biāo)識(shí)，即，F(xiàn)ITC、Cy3、 Cy5或羅丹明等焚光色素、或生物素、半抗原、氧^S^^^脂,酶、或 者二茂《械 類等電化學(xué)活性物質(zhì)?；蛘摺組用上述物質(zhì)標(biāo)識(shí)的第^^^艦 4t^測(cè)。也可同時(shí)4M多種標(biāo)識(shí)物質(zhì)。
在贈(zèng)形態(tài)中，從^^質(zhì)提取的核賦#固定在探針固定化切片上的 探針的雜^t^，例如可^下進(jìn)行。即，雜^t^M,在離子強(qiáng)度0.01~ 5的范圍、pH5 ~ 10的范圍的緩沖^ii行。在該絲中還可添加雜交^ilii劑的硫 酸葡彩瞎、及M^ft子DNA、牛胸腺DNA、 EDTA和表面活性劑等。向其中添加 提取的核賦分，在90iC以Jiii行熱變性。插入探針固定化切片，可在剛變性
后或急冷到ox:后進(jìn)行。也可將液體滴加在基體上進(jìn)行雜^^。 A^中可進(jìn) ^^Ml振蕩等作業(yè)，以提高X^歧。A^溫度，例如io 9ox:的范圍，反
應(yīng)時(shí)間，可進(jìn)行l(wèi)辦以Ji^一l雜^t^后，進(jìn)^*#"。'絲時(shí)，例:H吏 用離子強(qiáng)度0.01~5的范圍、pH5 10的范圍的緩沖液。
熒光檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)雜^應(yīng)，可才娘標(biāo)識(shí)的種類，使用適宜的抬r測(cè)裝置， 通it^測(cè)詢陣中標(biāo)識(shí)的4tt^列或2次探針中的標(biāo)^ii行。標(biāo)識(shí)為焚皿質(zhì) 時(shí)，例VfM焚;fe^測(cè)器，^"測(cè)標(biāo)識(shí)。
^^上述的本發(fā)明核酸探4h^測(cè)^^r姊絲狄列存在的方法， 發(fā)明范圍之內(nèi)。
特別是使用為獲得JiiiX和Y的關(guān)系的引物對(duì)^h核酸進(jìn)^增，將得到 的擴(kuò)增產(chǎn)物，與才娥本發(fā)明形態(tài)M酸探針固定4^^體上固定的核酸探4fii行 反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)生成的雜交，通ii^測(cè)M酸的存在，可更有^k^得雜^t 率。這樣的方法也包含^M^發(fā)明中。^it樣的方法中可使用的擴(kuò)增，例如M ^SI連鎖反應(yīng)(一殽稱為PCR，以下"^ftPCR)等的擴(kuò)增，也可是l銅i^^制酶 的逆復(fù)制擴(kuò)增等的iO^制PCR， W卜，還包^f昏河自身公知的擴(kuò)增。
才艮據(jù)本發(fā)明的形態(tài)可使用的擴(kuò)增，例如是Nucleic acid strand amplification (NASBA) 、 Transcription mediated amplification (TMA)、 Ligase chain reaction (LCR)、 Strand displacement amplification (SDA)、 Isothermal and Chimeric primer initiated Amplification of Nucleic acids (ICANN) 、 Rolling circle amplication (RCA)^"擴(kuò)增法。
才娘本發(fā)明形態(tài)的核酸)^斤方法，可利用在實(shí);^品中所^WMt酸的解 析，例M過(guò)^列存在的檢測(cè)和定量、基因發(fā)現(xiàn)的出現(xiàn)消失等的發(fā) ^斤、染色體組中單絲多型(Single Nucleotide Polymorphism^即，SNP)械附 屬序列等的多型餘f斤、與病患相關(guān)基因的陣f斤而對(duì)病患診J^并發(fā)癥危險(xiǎn)率的 預(yù)測(cè)、感染^^在的抬鄰j、病毒型觶奸、以;^毒性^l^場(chǎng)合。因此，可應(yīng)用于 臨床診,并發(fā)癥預(yù)測(cè)等^t臨床的目的。例如可廣泛應(yīng)用于食品的檢測(cè)、檢 疫、藥品檢查、法醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、漁ik^業(yè)等^t基礎(chǔ)的研究和應(yīng)用 研究等中。 實(shí)施例
以下對(duì)^L發(fā)明核酸;^r測(cè)方法的實(shí);^例ii;fti兌明。
本實(shí)施例是研究核酸探針的間隔基長(zhǎng)度(X)與M酸中M酸探針結(jié)合 "tWJ該基體側(cè)^的M(Y)之間的關(guān)系，和雜^t率的關(guān)系。 (1)核酸探4Hf^線酸的關(guān)系
本實(shí)施例中^^的核酸探4f^lfe^酸的關(guān)系示于圖4。以下^fefe酸與 核酸探針的詳細(xì)序列，但開(kāi)始對(duì)它們的大,成輛目關(guān)'^ii^i兌明。
圖4是同時(shí)以20絲的辦列及與辦列互補(bǔ)序列作為絲， 一同^"J 核酸探針C-0、核酸^;針C-10、核酸深針C-20及核酸探針C-30、和乾核酸70-0、 乾核酸70-20及耙核酸70-40的圖。
jJ:h^使用的核酸探針為4種。與核酸探針的耙序列互補(bǔ)的序列是20堿基， 在圖4中相當(dāng)于斜線所示部分。
核酸^:4十c-o，在其y ;W上不付與間隔基。
核酸^:針C-10，在其5'絲上付與由10>5^^成的間隔基乂1。 核酸探針C-20，在其5'絲上付與由20>5^^成的間隔基又2。 核酸^^針C-30,在其5'末端上不4寸與由30>5^構(gòu)成的間隔基乂3。這些
4種核酸探針，關(guān)于除間隔勤卜都是相等的。這些核酸探針，任何一個(gè)都是以
5'端固定在基體上。
jH^h使用的Jfefe酸為3種。這3種具有^t酸的乾序列，是^1相等為20
。圖4中，^列相當(dāng)于網(wǎng)狀部分。3種M酸中所含^列的4^isi^
列相等。
耙核酸70-0, 4^為70g的核酸，在其3'端存在20g的乾序列。 乾核酸70-20, 4H^為70錄的核醆狄序列的5' #1#在30堿基，乾 序列3' ,J^在20#的序列Yl。姊酸70-40， 4^為70錄的核^^W列5' #]#在10絲，辦 列3' ,']^在40g的序列Y2。
(2) 核酸探針
與核酸探針?biāo)琈列互補(bǔ)的序列為20>$^核酸探針C-O、 C-IO、 C-20、 C-30，是在上述20絲的核酸探針序列5'絲上，分別以O(shè)錄、10絲、 204tt和30磁基作為間隔^成上C (即，胞麼定)的探針。序列如下。 C-O: -SH-TGGACGAAGACTGACGCTC-3'(序列號(hào)l) C-10: 5' -SH-(C1()) TGGACGAAGACTGACGCTC-3'(序列號(hào)2) C-20: 5' -SH-(C2。) TGGACGAAGACTGACGCTC-3'(序列號(hào)3) C-30: 5' -SH-(C3。) TGGACGAAGACTGACGCTC-3'(序列號(hào)4) 上述4種探針，即，在C-O、 C-IO、 C-20和C-30的5'末端上由減醇基修 飾的。核酸探針C-O、 C-IO、 C-20、 C-30的X，分別是O錄、IO堿基、20堿
(3) 姊酸
另一方面，作為M酸的^^型，對(duì)Jiil 20 g的序列含有互補(bǔ)的序列， 準(zhǔn)備70錄的4緣香酸。這種4誠(chéng)苷酸，從探4m^Mi的絲到3'絲的 長(zhǎng)復(fù)，為O堿基、20堿基、40磁J^的3種。各個(gè)序列如下所示。
耙核酸70-0 (序列號(hào)SIS' CTATAAACATGCTTTCCGTGGCAGTGAGAACAAATGGGACCGTGCATTGC
(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)
把核酸70-20 (序列號(hào)6):
CTATMACATGCTTTCCGTGGCAGTGAGAA (GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)
CA腐GGACCGTGCATTGC
M酸70"40 (序列號(hào)7):
5' CTATAAACAT(GAGCGTCAGTCTTCGTCCAG)
GCTTTCCGTGGCAGTGAGAACAAATGGGACCGTGCATTGC
用襯"()"<^著的序列^^:#^^^， 5'絲上才射只熒光色素。這
些練酸序列號(hào)5、序列號(hào)6和序列號(hào)7的Y分別為0堿基、20堿基、和40堿基。
(4) 核酸探針的固定化本實(shí)施例中，作為J^體^^j金a。 #^| ^^別在含有核酸探針c-o、
C-IO、 C-20和C-30的緩沖液中浸漬，在室溫靜置l小時(shí)。之后，用蒸餾7jc洗， 干燥，制作錄酸探針固定^R^r絲。
(5) M酸的雜交
齡別含3種姊酸的緩沖液，在951C鄉(xiāng)5^^進(jìn)行熱變性。^，在 水水中急冷，形^fe^^^液。將固定了^fe酸探針的核酸探針固定^f^rj^ 浸漬在該姊^^液中。將其在351C靜置1小時(shí)。^，將Jiii核酸探針固定 ^f^rM，在不^f^T核酸的緩沖液中浸漬，在35匸靜置l小時(shí)進(jìn)^f。
(6) 雜交的糨酸檢測(cè)
通過(guò)檢測(cè)來(lái)自^ fefe核酸5' ^修飾的熒光色素的熒光強(qiáng)度，可對(duì)該固定 化的核酸^4f，檢測(cè)出雜交的^酸的存在。
(7) 結(jié)果
(iHMM酸70-0的情況 ^^I耙核酸70-0時(shí)的結(jié)果示于圖6。乾核酸70-0和核酸探針C-0、 C-IO、 C-20和C-30結(jié)^i^^狄示于圖6A。 ^f^核酸探針時(shí)都是X^Y。這時(shí)，如 圖6B所示，M^測(cè)出的^it強(qiáng)度，可知^h核酸探針C-0、核酸探針C-IO、核 酸探針C-20、核酸探針C-30、與雜交耙核酸70-0的量大致相等。
(ii) 使用耙核酸70-20的情況
^^耙核酸70-20時(shí)的結(jié)果示于圖7。乾核酸70-20和核酸探針C-0、C-10、 C-20和C-30結(jié)，i^i^示于圖7A。扭酸探針C-0和C-IO中，X〈Y，在 核酸探針C-20中，X=Y，扭酸探針C-30中，X〉Y。
此時(shí)，檢測(cè)的狄強(qiáng)度，.如圖7B所示，核酸探針糊于間隔基的狄而 增強(qiáng)。同樣，,于間隔基的^L, ^酸70-20的雜交量增加，4M含有與 膽酸探辦^Ni^姊酸3'絲的^5ttlt相同的胞救20鄉(xiāng)即，C20) 間隔基的核酸探針時(shí)，iiSiJ最大，與^^I含其以jL^間隔基時(shí)》嫩^t相等 (圖7B)。
(iii) ^^JM酸70-40的情況
作為姊酸^^I姊酸70-40時(shí)，姊酸70-20和核酸探針C-O、 C-IO、 C-20和C-30結(jié)合的形式模^示于圖8A。任何核酸探針時(shí)都是X〈Y。此時(shí)， 與紹酸探針雜交的乾核酸，任何一種情;X^^it相同，雜狄率降f氐(圖8B )。(iv)總結(jié)
從以上結(jié)果可以確認(rèn)，表將核酸探針與固定載體結(jié)合時(shí)^^I的間隔基狄 (X)，和對(duì)于上述核酸探針與其-"^分上含有狄列械酸進(jìn)行雜交時(shí)，從該 雜交^Mi的基體側(cè)末端到上述姊酸的基體側(cè)末端的狄(Y)之間成立X^Y 的關(guān)系時(shí)，可提高雜^t率。通過(guò)提高雜交效率，可以更高精度檢測(cè)M酸的 存在。
(8 )通過(guò)使用了引物的試料核酸擴(kuò)增的調(diào)節(jié)1
才Mt^^發(fā)明的又一形態(tài)、；l&于上ii^^發(fā)明的形態(tài)，在使核酸探針固定化 基體^Wf"核^J^之前，提供^fM可獲得^f^酸的核酸探針擴(kuò)增試 ^"核酸的工序的方法。這樣的核酸探針在用乾凈列使^酸與核酸探4f"ii行雜 交時(shí)，可以A^于擴(kuò)增^H"核酸的引物，上i^t酸的絲位于從該M列部 位的基體側(cè)絲部到約40絲以內(nèi)，她26錄~12絲以內(nèi)。
圖9是表示本發(fā)明另一形態(tài)的擴(kuò)增片^a核酸探針的關(guān)系圖。此處示出了 檢測(cè)人類染色體組中MxA基因的體系。圖9中示出了序列號(hào)8的核酸探4^r兩 種PCR產(chǎn)物。序列號(hào)8的核酸探針具有20 *的間隔基部分(圖中，"《/ft "Spacer-20"。 PCR產(chǎn)物A (以下^彿"A，，)，用以將5'絲生物素化的序 列號(hào)9的>^^序列示出的引物，和以cy5標(biāo)識(shí)的序列號(hào)10的4ttis序列示出 的引物，進(jìn)行制作。PCR產(chǎn)物B (以下記作"B")，用以將5'末端生物素化的 序列號(hào)11的>5^1^序列示出的引物，和以cy5標(biāo)識(shí)的序列號(hào)12的>5 ^序列 示出的引物，進(jìn)行制作。用卵白素#^^#*立子進(jìn)行單鏈的調(diào)制。圖9中，A 是離核酸探4f"^MH^W的距離為12絲(圖中i彿"12mer")， B是26 堿基("26mer")。使用這種耙子進(jìn)行雜狄應(yīng)，測(cè)定^t強(qiáng)度。結(jié)果示出A是 B約IO倍的熒光強(qiáng)度(圖IO)。
B約在1小時(shí)內(nèi)A^iiJ'K^,與其相反，A約在10^tA^^'K^。 研究SNP檢測(cè)的特異性，結(jié)果是在A、 B之間，S/N約形成2倍差異。 (9)通過(guò)使用了引物的試料核酸擴(kuò)增的調(diào)節(jié)2
圖11;|束示#^本發(fā)明另一形態(tài)的擴(kuò)增片段與探針關(guān)系圖。圖ll中示出
的結(jié)果。圖11中示出以序列號(hào)13的>^^序列表示的核酸探*三種PCR產(chǎn) 物。PCR產(chǎn)物C (以下"K/ft " C")，用以5' ^JS^^化的序列號(hào)14 >5ttJ^列^^的引物、和以cy5標(biāo)識(shí)的序列號(hào)15 4^i^列表示的引物進(jìn)行制作。PCR 產(chǎn)物D (以下i彿"D")，用以5' ;^^^化的序列號(hào)16>5^^列表示的 引物、和以cy5標(biāo)識(shí)的序列號(hào)15 4^&序列表示的引物進(jìn)行制作。PCR產(chǎn)物E (以下記怍"E")，用以5' ^MW^化的序列號(hào)184^J^序列表示的引物、 和以cy5標(biāo)識(shí)的序列號(hào)17 >5^ ^序列表示的引物進(jìn)行制作。進(jìn)而使用離PCR產(chǎn) 物的核酸探針結(jié)^Mi^的距離ii5'J 40g的引物。入核^^進(jìn)行單鏈 的調(diào)制。圖11所示PCR的各產(chǎn)物，C離探4j^^M^端的距離為13錄(圖 中記怍"13mer")， D為33g(圖中記作""mer" )、 E為^堿基(圖中記 作"48mer")。雖然沒(méi)有圖示，但也可以獲得離探躲^Mi^的距離^^ 40g的PCR產(chǎn)物。用這些把子測(cè)定進(jìn)行雜狄應(yīng)的妙漲度。結(jié)果是，C是 D約6倍、E的約40倍熒光強(qiáng)度(圖12)。
圖13示出了使用電化學(xué)方法的MBL檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果。與各個(gè)牝子進(jìn) 行雜^t^后，進(jìn)行、^義卜33258的電流測(cè)定。結(jié)果是，乾子C是D的約3 倍、E的約10倍以上的電流值。
從以上結(jié)果可知，MM酸探4t"^^Hi的中心40^以上引物的3' ^ 位于離開(kāi)的*時(shí)，雜^t率大幅度斷氐。也J^，J了特異性制氐的現(xiàn)象，為了 以高速、高選棒性、高感度進(jìn)4沐酸^"測(cè)，最重要的是^^l位于離核酸探4m ^g^Mi中心40 4以內(nèi)的引物進(jìn)#^增。
才MtJiii的本發(fā)明，提供了-^t檢測(cè)感度和特異性高的檢測(cè)核^列的方 法以及該方法中使用的引物。
^^L^領(lǐng)域中的人員還可能更容易地發(fā)m^Mfc點(diǎn)和變更。因此，從更廣 范圍看，本發(fā)明并不限于此處所示的詳細(xì)說(shuō)明和典型的形態(tài)。因此，根據(jù)附上 的權(quán)利要求范圍及其等同物，可作的種種變更，很明絲不會(huì)脫離整個(gè)發(fā)明的 思 #或范圍。序列表
<110〉株式會(huì)社東芝 高橋匡慶 岡田純
橋本幸二
<120>核酸探針固定化基體和用其檢測(cè)標(biāo)記的核酸存在的方法
<130〉 02S1022P
〈150> JT 2002-218644
<151〉 2002-7-26
<160〉 18
<210〉 i <211〉 19 <212〉隨 <213〉 E. Coli 《00〉 1
TGGACGAAGA CTGACGCTC 19
<210〉 2 <211〉 29 <212〉腿 <213〉人工合成 <400> 2
CCCCCCCCCC TGGACGMGA CTGACGCTC 29
<210〉 3 <21I〉 39 <212> DNA <213>人工合成 <400〉 3
CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 39〈210〉 4 〈211〉 45 <212> DNA 〈213〉人工合成 〈400〉 4
CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC TGGACGAAGA CTGACGCTC 45
〈210〉 5 <211> 70 〈212〉隱 <213〉人工合成 〈400> 5
CTATAAACAT GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA CAAATGGGAC CGTGCATTGC GAGCGTCAGT 60 CTTCGTCCAG 了G
<210> 6 〈211〉 70 <212> DNA 〈213〉人工合成 〈400〉 6
CTATAAACAT GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA GAGCGTCAGT CTTCGTCCAG CAAATGGGAC 60 CGTGCATTGC 70
〈210〉 7 <211〉 70 〈212〉 DNA <213〉人工合成 <400> 7
CTATAAACAT GAGCGTCAGT CTTCGTCCAG GCTTTCCGTG GCAGTGAGAA CAAATGGGAC 60 CGTGCATTGC 70
<210〉 8 <211> 35 <212>隱 <213〉人工序列 <400〉 8
CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GTTTCTGCTC CCGGA 35<210〉 9 〈211〉 20 <212〉隨 <213>人類 <400〉 9
GAGCTAGGTT TCGTTTCTGC 20
<210〉 10 〈211〉 22 <212>隨 <213>人類 <400〉 10
GGCCTCCGCT CTCGCTTCGC CT 22
<210> 11 <211〉 22 <212〉 DNA 〈213〉人類 <400〉 11
AGGTGCGGGG CCAGGAGCTA GG 22
〈210〉 12 <211〉 20 〈212〉 DNA 〈213〉人類 〈400〉 12
TCCGCTCTCG CTTCGCCTCT 20
〈210〉 13 <211> 35 <212〉, <213〉人工序列 <400〉 13
CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CTTGGTGTCA TCACG 35
<210> 14 〈211〉 20 <212〉 DNA<213〉人類 <400〉 14CCCCCTTTTC TCCCTTGGTG 20<210〉 15 <211〉 20 <212〉隨 <213〉人類 <400〉 15TGTGAGGATG CCCAAAAGAC 20<210〉 16 <211〉 20 <212〉 DNA 〈213〉人類 <400〉 16AGCCCMCAC GTACCTGGTT 9<210〉 17 <211〉 20 <212〉隨 <213〉人類 <柳〉17TTGCCTGTAG CTCTCCAGGC 20<210> 18 <211〉 20 <212〉陽(yáng) <213〉人類 <400〉 18TTGCAGAGAC AGMCAGCCC 20
權(quán)利要求
1.檢測(cè)在核酸試料中存在靶核酸的方法，通過(guò)使用核酸探針固定化基體，上述基體包含能進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的電極、和借助間隔基固定在上述電極上的該核酸探針，靶核酸與核酸探針的雜交，靶核酸部分地含有靶序列，上述靶序列是具有全長(zhǎng)大于等于70堿基的核酸，其中所述間隔基滿足以下關(guān)系X≥Y， id="icf0001" file="A2008101254130002C1.tif" wi="14" he="4" top= "63" left = "44" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>且 id="icf0002" file="A2008101254130002C2.tif" wi="17" he="4" top= "63" left = "67" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>X為所述間隔基的長(zhǎng)度，Y為所述靶核酸從該雜交部位的基體側(cè)末端到靶核酸在上述的基體側(cè)末端的長(zhǎng)度，該方法包括以下步驟使用用于擴(kuò)增靶核酸的引物來(lái)擴(kuò)增具有全長(zhǎng)大于等于70堿基的靶核酸試料的步驟，其中在所述靶核酸與所述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)滿足關(guān)系X≥Y， id="icf0003" file="A2008101254130002C3.tif" wi="14" he="4" top= "110" left = "164" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>且 id="icf0004" file="A2008101254130002C4.tif" wi="18" he="4" top= "118" left = "28" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>在獲得適宜雜交的條件下，使由上述擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與在核酸探針固定化基休上固定的核酸探針進(jìn)行反應(yīng)的步驟、和通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)存在于上述反應(yīng)中的所述雜交，來(lái)判斷核酸試料中存在靶核酸的步驟。
2.通itf銅核酸探針固定4^^體iM^I'i^^t酸的方法，所it^酸含 有辦列，Jiii^列是具有4H^大于等于70絲的核酸，上i^J^^有食瞇 行電化學(xué)儉測(cè)的電極、和借助間隔基固定在上述電^Lh的該核酸探針，與核酸 探針的雜交，姊酸部^k^有M列，上述狄列是具有妹大于等于70堿 基的核酸，其中所迷間隔J^H足以下關(guān)系)^Y， Y210A,且200 UX為所述間隔基的^1，的狄，該方法包括以下步驟(a)準(zhǔn)備用于擴(kuò)增所述乾核酸的引物，佳在所述乾核酸中的所述乾序列與 上ii核酸^4fi^^亍雜交時(shí)，上述M酸的末端與在基體側(cè)的該耙序列^J^i于(bMMJJi步驟(a)中準(zhǔn)備的引物，對(duì)核酸iW^ftT增、(c) 將Jiii步驟(b)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物形^^鏈、(d) ^Ji述步驟(c)中得到的單鏈與上述核酸探4j"ii行^、(e) 通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)存在于上述步驟(d)中生成的雜交，由jtb^r測(cè)該核酸 糾中姊酸的存在。
3. #^^']^求1或2記載的檢觀W!vjfcMt酸的方法，^^征AJi述X 和Y的關(guān)系是&Y， Y^10A,且X-IO hY。
4. 才N^M'J要求1或2記載的檢測(cè)存^M^酸的方法，^ft征AJi述X和 Y的關(guān)系是&Y， Y^10A， X-10 hY， 200 A^X，且XMOO A。
5. 才M^U，J^求1或2記栽的檢測(cè)存^fe^酸的方法，*#征^]1述X和 Y的關(guān)系是&Y， Y^10A,且X-10A^Y,且IOO A^X。
6. 才^t;M'J要求1~5 ^-"項(xiàng)記栽的^"測(cè)存^J!fe^酸的方法，^ft征;Ui 述間隔J-;l有^^狀^"。
7. ;fNt;(5UN要求1 ~ 6 ^fi-項(xiàng)記栽的檢測(cè)存4^酸的方法，^ft征AJi 述間隔基是M酸、乙二醇和，構(gòu)成的群中選出。
8. 核酸探針固定>^^體，其特征AJii^^體包含能進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的電 極、和借助間隔基固定在Ji^電^Ui的該核酸探針，姊酸與核酸探針的雜交， 姊酸部^fe^有M列，上述狄列是具有4H^大于等于70錄的核酸，其 中所述間隔J^葛足以下關(guān)系&Y， Y^10人，且200 A^X X為所述間隔基的^JL， 的狄' ， - f 土 ' 、二、土 ，、
9. 才^^U'J要求8記栽的核酸探針固定^^體，其特征;Ui述X和Y的關(guān) 系是&Y, Y210A，且X-IO hY。
10. 才^tW'j^求8記載的核酸探針固定^^體，^!t征AJi述X和Y的 關(guān)系是&Y, Y^10A， X-IO 且200 A^X。
11. 才Nt^U，澳求8記載的核酸探針固定^^體，其特征AJi述X和Y的 關(guān)系是&Y, Y》10A， X-10 hY， 200 A^X，且KIOO A。
12. 才^t;M'J^求8記載的核酸探針固定jt^體，其特征AJi述X和Y的 關(guān)系是&Y， Y^10A, X-10 hY，且IOO A^X。
13. 才Mt^U'澳求8~12 ^-"項(xiàng)記載的核酸探針固定4^^體，^ft征AJi 述間隔基是有^^狀^1。
14. 才M^5U'J^求8~13 ^-~項(xiàng)記栽的核酸探針固定>^^體，^f^征;Ui 述間隔基是M酸、乙二醇和，構(gòu)成的群中選出。
全文摘要
檢測(cè)在核酸試料中存在靶核酸的方法，通過(guò)使用核酸探針固定化基體，上述基體包含能進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的電極、和借助間隔基固定在上述電極上的該核酸探針，靶核酸與核酸探針的雜交，靶核酸部分地含有靶序列，上述靶序列是具有全長(zhǎng)大于等于70堿基的核酸，其中所述間隔基滿足以下關(guān)系X≥Y，Y≥10，且200≥X。X為所述間隔基的長(zhǎng)度，Y為所述靶核酸從該雜交部位的基體側(cè)末端到靶核酸在上述的基體側(cè)末端的長(zhǎng)度，該方法包括以下步驟使用用于擴(kuò)增靶核酸的引物來(lái)擴(kuò)增具有全長(zhǎng)大于等于70堿基的靶核酸試料的步驟，其中在所述靶核酸與所述核酸探針進(jìn)行雜交時(shí)滿足關(guān)系X≥Y，Y≥10，且200≥X，在獲得適宜雜交的條件下，使由上述擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，與在核酸探針固定化基體上固定的核酸探針進(jìn)行反應(yīng)的步驟、和通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)存在于上述反應(yīng)中的所述雜交，來(lái)判斷核酸試料中存在靶核酸的步驟。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101307363SQ20081012541
公開(kāi)日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者岡田純, 橋本幸二, 高橋匡慶 申請(qǐng)人:株式會(huì)社東芝