專利名稱：硅膠膜活化液及其在核酸提取中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸提取領(lǐng)域的技術(shù)，尤其涉及一種硅膠膜活化液及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)的研究與應(yīng)用離不開核酸的提取與純化，核酸提取的效果直接 影響著后續(xù)的工作和研究，但核酸的提取與純化一直是耗時(shí)繁瑣的過(guò)程。國(guó)內(nèi) 外許多學(xué)者一直在探索各種核酸提取純化的方法。
傳統(tǒng)的核酸制備方法常用酚/氯仿等有毒的有機(jī)溶劑抽提，這些技術(shù)適用范 圍廣，適用于大部分分子生物學(xué)研究，但是這些技術(shù)操作繁瑣且耗時(shí)，而且酚 和氯仿等有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染，有損健康。這種方法目前在國(guó)內(nèi)還比較普 遍，大部分學(xué)校教學(xué)經(jīng)費(fèi)不是很足的實(shí)驗(yàn)室還在使用。
1992年X. delamballerie等開始用Chelex100螯合柱提取細(xì)菌及病毒DNA 獲得較好效果。該方法簡(jiǎn)單快速，避免使用酚等有害物質(zhì)，但是提取的DNA純 度較低，不適用于對(duì)純度要求較高的下游的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
1992年P(guān)icardC等利用玻璃粉在高鹽下吸附DNA的特性純化DNA。此后玻 璃粉吸附法提純DNA時(shí)有報(bào)道，但是該方法操作步驟較多，提取的DNA純度較 低。
1999年R Caldarelli-Stefano等運(yùn)用磁珠分別從福爾馬林固定、石蠟包埋 和冰凍組織中提取DNA，整個(gè)過(guò)程不到兩個(gè)小時(shí)。與傳統(tǒng)方法比較，磁珠法是一 種可行、簡(jiǎn)單、敏感和快速的方法。
1997年Adriab R Geksthorpe等利用抗DNA單克隆抗體與磁珠結(jié)合的方法 從小樣本、陳舊樣本及含PCR抑制的樣本中提取核酸獲得很好的效果。但是目 前應(yīng)用此方法生產(chǎn)的商品化DNA試劑盒還沒(méi)有。
硅膠膜吸附柱法是采用特制的硅膠膜吸附柱來(lái)選擇性吸附裂解細(xì)胞釋放的 DNA，再經(jīng)過(guò)洗滌和洗脫等簡(jiǎn)單程序，就可獲得高純度的DNA。但是直接使用硅 膠膜方法用于核酸分離存在硅膠膜不穩(wěn)定、不均一以及與核酸結(jié)合能力下降等 缺點(diǎn)，用我們特制的活化工藝可以克服以上缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
我們采用活化硅膠膜表面基團(tuán)的工藝使硅膠膜與核酸結(jié)合能力得到明顯 改善，從而達(dá)到從生物體的裂解液中分離提取核酸的目的。
直接使用硅膠膜方法用于核酸分離存在硅膠膜不穩(wěn)定、不均一以及與核酸 結(jié)合能力下降等缺點(diǎn)，用我們特制的活化工藝可以克服以上缺陷?；罨に嚥捎没瘜W(xué)方法特殊處理，活化液組成為50 — 200mM NaHCO" 1-10% (w/v) SDS， l-50mM EDTA。
本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)硅膠膜進(jìn)行處理的方法，采用活化工藝可以使 其與核酸的結(jié)合力得到增加，且使它們的結(jié)合力具有良好的均一性與穩(wěn)定性， 提高其生物利用度，更有效地發(fā)揮其核酸提取的功能；而且通過(guò)該方法使硅膠 膜被包裹在活化劑內(nèi)部，隔絕了與外界環(huán)境的接觸，因而性質(zhì)更加穩(wěn)定，擴(kuò)大 了其應(yīng)用范圍，以滿足不同的生產(chǎn)需要。
本發(fā)明的硅膠膜活化液，其特征在于，硅膠膜活化液中含有50 — 200mM NaHC03、 1-10%SDS和l-50mM EDTA。
根據(jù)本發(fā)明的硅膠膜活化液，其特征在于，使用該活化液處理后的硅膠膜 與核酸的結(jié)合能力增強(qiáng)，且活化液使硅膠膜與核酸的結(jié)合力具有良好的均一性 與穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明的的活化液，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有100 mM
NaHCO:,。
根據(jù)本發(fā)明的的活化液，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有5。/。SDS。 根據(jù)本發(fā)明的的活化液，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有25mMEDTA。 本發(fā)明包括利用硅膠膜活化液提取核酸的方法，該方法包括使用活化液活
化硅膠膜、裂解細(xì)胞、硅膠膜吸附核酸、清除硅膠膜上的雜質(zhì)以及膜上的核酸
洗脫的過(guò)程。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有100mMNaHC03。 根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有5。/。SDS。根據(jù)權(quán) 根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有25inM EDTA。
本發(fā)明還包括一種對(duì)于核酸提取的硅膠膜進(jìn)行處理的方法，該方法包括切 割硅膠膜制備吸附柱、加入硅膠膜活化液至吸附柱以及離心去除活化液的過(guò)程。 根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有100mMNaHC03。 根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有5WSDS。 根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有25mM EDTA。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一種核酸提取試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有硅膠 膜活化液、裂解液、洗滌液以及洗脫液。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有100 mM NaHC03。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有5%SDS。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有25rnM EDTA。


圖1.不同體積的活化液對(duì)硅膠膜活化效果的影響
1. 500W
2. 60(M
3. 70(M
4. 不加活化液
圖2.不同活化時(shí)間對(duì)硅膠膜活化效果的影響
1. 0
2. 5分鐘
3. 10分鐘
4. 20分鐘
5. 40分鐘
6. 80分鐘
7. 160分鐘
8. 不加活化液
圖3.活化液對(duì)不同溫度放置的硅膠膜活化效果的影響
1. 4'C，加活化液
2. 4'C，不加活化液
3. 25°C，加活化液
4. 25°C，不加活化液
5. 37°C，加活化液
6. 37°C，不加活化液
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
1. 硅膠膜活化工藝
將厚度大約為0.3mm用于空氣過(guò)濾的硅膠膜切割成適當(dāng)大小后連同過(guò)濾墊 片置于塑料吸附柱CB3中，向吸附柱CB3(吸附柱放入2ml收集管中)加入500W 的硅膠膜活化液，12, 000 rpm離心30 — 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 重新放回收集管中。(用活化液處理過(guò)的柱子最好立即使用)。
活化液組成為lOOraM NaHC03， 5% (w/v) SDS， 25raM EDTA。
2. 用活化后的硅膠膜提取質(zhì)粒pcDNA
取l一3ml過(guò)夜培養(yǎng)的￡ coh'(含質(zhì)粒pcDNA)菌液加入離心管，室溫12， 000 rpm離心1分鐘收集細(xì)菌，盡量吸除上清。向留有菌體沉淀的離心管中加入250Hl 含RNase A的GTE buffer (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl， 10 mM EDTA， pH 8)， 使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。向離心管中加入250W lysis solution (0.2 M Na0H, 1% SDS).，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次。向離心管中 加入350Ml 5 M potassium acetate solution (pH 4.8)，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000 rpm離心10分鐘，將上 清溶液全部轉(zhuǎn)移到活化后的吸附柱CB3中(吸附柱放入2ml收集管中)。室溫 12， 000 rpm離心30 — 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 向吸附柱中加入750W漂洗液70%乙醇，12， 000 rpm離心30 — 60秒，棄掉收 集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。重復(fù)以上操作步驟。倒掉廢液。 將吸附柱CB3重新放回收集管中，12， 000 rpm離心2分鐘，目的是將吸附柱中 殘余的漂洗液去除。將吸附柱CB3置于一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜 的中間部位懸空滴加10(M洗脫緩沖液TE buffer (10 mM Tris-Cl， 1 mM EDTA， pH 7. 5)，室溫放置5分鐘，室溫12, 000 rpm離心1分鐘。-2(TC保存。
3. 不同體積的活化液對(duì)硅膠膜活化效果的影響
采用以上活化工藝的硅膠膜提取質(zhì)粒DNA，考察不同體積的活化液(50014， 700M1)對(duì)硅膠膜活化效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖l，從圖上可見不同 體積的活化液對(duì)硅膠膜活化效果的影響不大，但是經(jīng)過(guò)活化處理過(guò)的硅膠膜與 未處理的膜相比，質(zhì)粒提取得率明顯提高。
4. 不同活化時(shí)間對(duì)硅膠膜活化效果的影響
采用以上活化工藝的硅膠膜提取質(zhì)粒DNA，考察不同活化時(shí)間(0， 5分鐘， 10分鐘，20分鐘，40分鐘，80分鐘，160分鐘)對(duì)硅膠膜活化效果的影響，活 化液體積均為500W，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，從圖上可見不同活化時(shí)間對(duì)硅膠膜活 化效果的影響不大，但是經(jīng)過(guò)活化處理過(guò)的硅膠膜與未處理的膜相比，質(zhì)粒提 取得率明顯提高。
5. 活化液對(duì)不同溫度放置的硅膠膜活化效果的影響
吸附柱CB3在不同溫度(4"C、 25匸和37'C)下放置七天，采用以上活化 工藝活化硅膠膜后提取質(zhì)粒DNA，考察加與不加活化液對(duì)硅膠膜活化效果的影 響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，從圖上可見提高溫度破壞了硅膠膜結(jié)合核酸的能力，經(jīng) 過(guò)活化處理過(guò)的硅膠膜與未處理的膜相比，質(zhì)粒提取得率明顯提高，并且膜的 穩(wěn)定性和均一性有所改善。 實(shí)施例2硅膠膜活化工藝同實(shí)施例1，只是活化液組成為50mM NaHC03， 1% (w/v) SDS， ImM EDTA。
實(shí)施例3
硅膠膜活化工藝同實(shí)施例1，只是活化液組成為200mMNaHC03， 10% (w/v) SDS， 50mM EDTA。
實(shí)驗(yàn)證明，使用以上實(shí)施例2和實(shí)施例3的活化液處理后的硅膠膜與核酸 的結(jié)合能力增強(qiáng)，且活化液使硅膠膜與核酸的結(jié)合力具有良好的均一性與穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種硅膠膜活化液，其特征在于，硅膠膜活化液由50-200mM NaHCO3、1-10％SDS和1-50mM EDTA組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的硅膠膜活化液，其特征在于，使用該活化液處理后的硅膠 膜與核酸的結(jié)合能力增強(qiáng)，且活化液使硅膠膜與核酸的結(jié)合力具有良好的均一性與穩(wěn)定性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的活化液，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有100 raMNaHCO:,。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的活化液，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有5%SDS。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的活化液，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有25慮EDTA。
6. 利用權(quán)利要求1或2的硅膠膜活化液提取核酸的方法，該方法包括使用硅膠 膜活化液活化硅膠膜、裂解細(xì)胞、硅膠膜吸附核酸、清除硅膠膜上的雜質(zhì)以 及膜上的核酸洗脫的過(guò)程。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有100 mMNa線。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有5%SDS。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有25mMEDTA。
10. —種對(duì)于核酸提取的硅膠膜進(jìn)行處理的方法，該方法包括切割硅膠膜制備吸 附柱、加入權(quán)利要求1的硅膠膜活化液至吸附柱以及離心去除活化液的過(guò)程。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有100 mM NaHC03。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有5呢SDS。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有25mMEDTA。
14. 一種核酸提取試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有權(quán)利要求1的硅膠膜活化 液、裂解液、洗滌液以及洗脫液。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有100 mM 舗CO..i。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有5%SDS。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其特征在于，所述硅膠膜活化液中含有25mM EDTA。
全文摘要
本發(fā)明屬于核酸提取領(lǐng)域的技術(shù)，尤其涉及一種硅膠膜活化液及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)硅膠膜進(jìn)行處理的方法，采用活化工藝可以使其與核酸的結(jié)合力得到增加，且使它們的結(jié)合力具有良好的均一性與穩(wěn)定性，提高其生物利用度，更有效地發(fā)揮其核酸提取的功能；而且通過(guò)該方法使硅膠膜被包裹在活化劑內(nèi)部，隔絕了與外界環(huán)境的接觸，因而性質(zhì)更加穩(wěn)定，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，以滿足不同的生產(chǎn)需要。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101338312SQ20081012607
公開日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者李曉晨 申請(qǐng)人:天根生化科技(北京)有限公司