專利名稱：保存溶液中目標(biāo)的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在醇保存溶液(preservative solution)中檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)和 用于識(shí)別用于與這些目標(biāo)結(jié)合的傳感器(sensor)的方法、物品和組合物。發(fā)明背景醫(yī)學(xué)診斷測(cè)試方法是病理狀態(tài)早期檢測(cè)的關(guān)鍵篩選工具。早期檢測(cè)能 夠在更可能進(jìn)行成功治療的階段確定這些病癥。通常早期治療也涉及較小 破壞性或較小侵襲性的治療方法，降低對(duì)患者的影響。除了常規(guī)篩選之外， 診斷測(cè)試也有許多其他應(yīng)用，包括生物活組織檢査分析和監(jiān)測(cè)進(jìn)行中的醫(yī) 學(xué)治療的結(jié)果。分析樣品如醫(yī)學(xué)樣品中存在的特定成分的典型方法可以包括多步處理 步驟如固定、染色、透化、原位雜交以及其他酶學(xué)和/或化學(xué)處理，這取決 于進(jìn)行的具體測(cè)定法。對(duì)可從樣品獲得的診斷信息量的限制因素包括可獲得和易于操作的樣 品的數(shù)量、進(jìn)行多重檢測(cè)所需的處理時(shí)間、樣品在不失去信號(hào)的情況下對(duì) 多重處理步驟的耐受性以及進(jìn)行多重分析方法的費(fèi)用。醫(yī)學(xué)樣品經(jīng)常使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)染色。許多染色液含有固定劑如醇，不過很多方法也需要固定步驟。通常希望獲得關(guān)于各種存在于或 可能存在于樣品中的物質(zhì)(species)的其它信息和/或獲得關(guān)于較小成分如病 毒或其它細(xì)胞成分或其它可能存在于樣品中但通過染色方法不能充分檢測(cè) 的物質(zhì)的信息。 '使用更精確的分子技術(shù)如原位雜交可以從樣品中提供比染色技術(shù)甚至 更為詳細(xì)的信息。但是，原位雜交需要對(duì)樣品進(jìn)行多重繁瑣的操作，包括 固定、轉(zhuǎn)移至載玻片上、通過溶液梯度逐步操作、加蓋玻片、過長的雜交步驟、洗滌、干燥和其它處理步驟。這些方法耗費(fèi)時(shí)間，對(duì)多重步驟需要 嚴(yán)格的注意。本領(lǐng)域需要改進(jìn)的樣品分析方法以及改進(jìn)的用于這些方法的組合物和 物品的制備方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于在醇保存溶液中檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)和用于識(shí)別用于與這些 目標(biāo)結(jié)合的傳感器的方法、物品和組合物。該方法使得樣品的充分固定和 可檢測(cè)的傳感器與樣品中感興趣的目標(biāo)的結(jié)合同時(shí)進(jìn)行。 一方面，本發(fā)明 提供一種方法，其包括使懷疑含有目標(biāo)的樣品與已知與這種目標(biāo)結(jié)合的可 檢測(cè)的傳感器分子在醇保存溶液中接觸。該方法可以以多重的形式(multiplex form)進(jìn)行以同時(shí)分析多種目標(biāo)。本發(fā)明還提供識(shí)別在醇保存溶液 中能夠與期望的目標(biāo)結(jié)合的傳感器的方法。本發(fā)明還提供含有一種或多種 這種可檢測(cè)的傳感器的醇保存溶液。本發(fā)明還提供含有由這種方法提供的 結(jié)合傳感器的樣品。本發(fā)明還提供用于這些方法的試劑盒。附圖簡述

圖1表示用50 x油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對(duì)偶濾波器觀察到 的與對(duì)金黃色葡萄球菌CS. w^""rRNA特異的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記 的PNA探針雜交的金黃色葡萄球菌陰性表皮葡萄球菌(51.印/^rm/^)標(biāo)本 在PreservCyt溶液中雜交90分鐘后的影像。圖2表示用50 x油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對(duì)偶濾波器觀察到 的與對(duì)金黃色葡萄球菌rRNA特異的FITC標(biāo)記的PNA探針雜交的金黃色 葡萄球菌陽性標(biāo)本在PreservCyt溶液中雜交90分鐘后的影像。圖3表示用50 x油浸鏡頭和Omega對(duì)偶濾波器觀察到的與對(duì)白色念珠 菌(C a/Wca"力rRNA特異的FITC標(biāo)記的PNA探針雜交的酵母陰性 ThinPrep制備樣品的影像。圖4表示用50 x油浸鏡頭和Omega FITC/Texas Red對(duì)偶濾波器觀察到 的與對(duì)白色念珠菌rRNA特異的FITC標(biāo)記的PNA探針雜交的酵母陽性 ThinPrep制備樣品的影像。該ThinPrep標(biāo)本于1999年收集，在PreservCyt中儲(chǔ)存四年后雜交。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的發(fā)明人有利地發(fā)現(xiàn)將傳感器分子引入含醇保存溶液中允許多 重細(xì)胞學(xué)操作在同一溶液中進(jìn)行，從而減少處理樣品所需的步驟數(shù)目和時(shí) 間量并增加在給定時(shí)間內(nèi)對(duì)于給定樣品可以進(jìn)行的測(cè)定法的數(shù)目。
例如，繁瑣且需要多重步驟和操作的FISH方法如果在醇保存溶液例如 含有傳感器如檢測(cè)核酸目標(biāo)的PNA探針的PreservCyt中進(jìn)行就可以被簡 化。這有利地消除對(duì)費(fèi)時(shí)且不必要的固定步驟的需要，因?yàn)镻reservCyt中 的甲醇也能充當(dāng)固定劑。
我們進(jìn)行了研究，顯示了通過FISH (熒光原位雜交)利用PNA探針對(duì) PreservCyt中的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌進(jìn)行微生物檢測(cè)。我們證明了 使用PNA探針FISH可以在PreservCyt的溶液基質(zhì)中有效地進(jìn)行。在常規(guī) 方法中，雜交事件在由血液培養(yǎng)物標(biāo)本制備的載玻片上進(jìn)行，為達(dá)到最佳 效果血液培養(yǎng)物標(biāo)本需要是新鮮的。由于PreservCyt具有保存性質(zhì)因而很 好地保持PNA目標(biāo)(rRNA序列)的穩(wěn)定性。我們的研究表明，在PreservCyt 中rRNA的完整性至少保持四年且可被PNA FISH檢測(cè)到。我們還確定了 在室溫下PreservCyt中的雜交事件至少在23日內(nèi)保持穩(wěn)定。這有利地提供 了對(duì)以前采集的樣品進(jìn)行回顧分析的方法。因此，還提供了用于在醇保存 溶液中對(duì)長期儲(chǔ)存后的目標(biāo)的檢測(cè)方法。檢測(cè)目標(biāo)的方法可以在l、 2或3 周后，或者l、 2、 3、 4、 6或9個(gè)月后，或者l、 2、 3、 4或更多年后進(jìn)行。
雖然使用PNA FISH檢測(cè)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌作為模型系統(tǒng) 來舉例說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于檢測(cè)這些微生物的方法。該方法可以 用于檢測(cè)其它感染或致病性物質(zhì)(agent)(包括病毒)以及遺傳分析如點(diǎn)突變 或其它染色體異常的識(shí)別(即檢測(cè)非整倍性的著絲粒探針)。
該方法還用于在醇保存溶液中進(jìn)行分子測(cè)定，例如擴(kuò)增反應(yīng)如PCR， 其包括使用一種或多種PNA探針阻斷不期望的目標(biāo)的擴(kuò)增，例如檢測(cè)特定 選擇的人乳頭瘤病毒(HPV)的菌株如致病性菌株，而同時(shí)避免檢測(cè)到其它未 選擇的菌株如非致病性菌株。該方法可以以多重的形式使用。該方法還可 以用于測(cè)試候選傳感器與期望的目標(biāo)的結(jié)合能力，這種測(cè)試可以以多重的形式進(jìn)行，例如使用化合物庫如小分子、有機(jī)分子和/或無機(jī)分子或測(cè)試寡
核苷酸的混合物來從混合物中識(shí)別具有希望的結(jié)合特征(profile)的適體 (aptamer)。
癌癥的病理診斷通常需要單細(xì)胞或組織活檢物的顯微鏡檢查以識(shí)別指 示惡性的形態(tài)異常。輔助的實(shí)驗(yàn)室檢査可以有助于形態(tài)學(xué)檢查。這些檢查
包括以下檢測(cè)染色體異常(如擴(kuò)增、缺失或易位)、表達(dá)異常的酶、蛋白質(zhì) 或脂質(zhì)或碳水化合物。盡管為證實(shí)異常的細(xì)胞成分可以使用不同的分析方 法，但它們的共同點(diǎn)是分析在與最初的形態(tài)學(xué)檢査中所使用的細(xì)胞不同的 組織切片、懸浮液或顯微鏡載玻片上的一組細(xì)胞中進(jìn)行。這可能給診斷過 程帶來挑戰(zhàn)。
本文所述的方法可以用于通過使用中心體特異的傳感器分析樣品中存 在的中心體。目前中心體計(jì)數(shù)還沒有在實(shí)際中用于對(duì)惡性腫瘤或其前體的 輔助診斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)和中 心體數(shù)目計(jì)數(shù)的方法，這樣通過將兩種因素的信息結(jié)合就可以更準(zhǔn)確地確
定正?；虍惓５姆诸悺＠缈梢杂帽４娴募?xì)胞制備ThinPrep載玻片，進(jìn)行 巴氏染色操作。可以使細(xì)胞在染色操作之前或之后與可檢測(cè)的對(duì)中心體目 標(biāo)特異的傳感器接觸。通過特定的光波長檢查載玻片以測(cè)定形態(tài)學(xué)特征和 中心體特異的傳感器的特異性結(jié)合?？梢允褂米詣?dòng)成像系統(tǒng)如ThinPrep 成像系統(tǒng)根據(jù)可檢測(cè)的傳感器的結(jié)合而定量中心體的數(shù)目。
在保存溶液中接觸傳感器之后，可以對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)以確定傳感器是 否己經(jīng)與目標(biāo)結(jié)合。檢測(cè)可以在含有于溶液中的樣品的容器中進(jìn)行，或者 可以在將部分或全部樣品轉(zhuǎn)移至另一容器中或基材如濾紙、載玻片或蓋玻 片上之后再進(jìn)行。可以用一種或多種特定的光波長測(cè)定樣品的形態(tài)學(xué)特征 和目標(biāo)的特異性結(jié)合和傳感器的存在來檢測(cè)樣品。
樣品可以通過手動(dòng)和/或通過合適的裝置如自動(dòng)成像系統(tǒng)來進(jìn)行分析。 自動(dòng)成《象系統(tǒng)的實(shí)例包括Cytyc Corporation的ThinPrep Imaging System、 TriPath FocalPoint Profiler、 ChromaVision Acis System、 CompuCyt iCyte Imaging System 、 Applied Imaging CytoVision System禾卩Veracel Verasys Imaging System。諸如上述這些的裝置可以經(jīng)過改造引入一種或多種檢測(cè)系 統(tǒng)以檢測(cè)引入含醇保存染色溶液中的傳感器上使用的附加標(biāo)記。例如可以使裝置適用于檢測(cè)和/或分析由加入保存溶液中的傳感器(和/或它們的標(biāo)記) 所提供的一種或多種特定的波長。當(dāng)目標(biāo)是中心體時(shí)，可使用自動(dòng)成像系 統(tǒng)通過檢測(cè)與樣品結(jié)合的中心體特異的傳感器的量或數(shù)目來定量中心體數(shù) 目。
在進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體方 法、溶液或裝置，因?yàn)檫@些方法、溶液或裝置當(dāng)然可以改變。還應(yīng)理解本 文使用的術(shù)語僅僅是為了描述具體的實(shí)施方案，而無意于限制本發(fā)明的范 圍。
若非另外明確指出，使用單數(shù)形式"一"、"這"或"那"包括復(fù)數(shù) 的意思。因此，例如所指的"一個(gè)樣品"包括多個(gè)樣品，所指的"一個(gè)傳 感器"包括多個(gè)這種傳感器，所指的"一個(gè)目標(biāo)"包括多個(gè)目標(biāo)等等。此 外，若非另外明確指出，使用明確的復(fù)數(shù)形式如"兩"、"三"等，以同 主題中較大的數(shù)字為準(zhǔn)。
若非另外明確指出，術(shù)語如"連接的(connected)"、"連接的(attached)" 和"連接的(linked)"在本文中可互換地使用，并且包括直接以及間接的連 接或綴合。當(dāng)描述數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解任何介于該范圍的所述上限和下限 之間的整數(shù)值及其分?jǐn)?shù)，以及在這些值之間的任何子范圍也均被具體公開。 任何范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包含在該范圍之內(nèi)或排除于該范圍之 外，而且任何其中兩個(gè)限值之一、兩個(gè)限值都不包括或兩個(gè)限值都包含的 范圍也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。當(dāng)所討論的值具有內(nèi)在的限度時(shí)，例如 當(dāng)組分以0-100%的濃度存在時(shí)，或當(dāng)水溶液的pH范圍為1至14時(shí)，這些 內(nèi)在的限度被具體公開。當(dāng)明確描述一個(gè)值時(shí)，應(yīng)理解與所述值大約相同 的量以及基于其的范圍也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)公開一個(gè)組合時(shí)，該組合 的元素的每個(gè)亞組合也被具體地公開且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。相反，當(dāng)公開 不同元素或多組元素時(shí)，它們的組合也被公開。當(dāng)公開一個(gè)發(fā)明的任何元 素具有多種選擇時(shí)，則其中各自的選擇被單獨(dú)排除或與其它選擇的任意組 合被排除的該發(fā)明的實(shí)例也在本文公開； 一個(gè)發(fā)明中一種以上的元素可以 具有這種排除，具有這種排除的元素的所有組合也在本文公開。
若非另外定義或上下文另外明確指出，本文使用的所有科技術(shù)語都具 有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含意。雖然與本文所述相似或等價(jià)的方法和材料也可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中，但現(xiàn)在描述的方 法和材料是優(yōu)選的。
本文使用的術(shù)語"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"、"核酸分 子"可互換地使用，都指任何長度的多聚形式的核苷酸，而且可以包括核 糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、它們的類似物或它們的混合物。這些術(shù)語僅 僅指該分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括三鏈、雙鏈和單鏈脫氧核糖核
酸("DNA")以及三鏈、雙鏈和單鏈核糖核酸("RNA")。它還包括例如通 過烷基化和/或通過加帽的修飾和非修飾的多核苷酸形式。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定對(duì)于給定測(cè)定形式的合適雜交條件；可調(diào)節(jié) 的非限制性參數(shù)包括測(cè)定成分的濃度、pH、使用的鹽及它們的濃度、離子 強(qiáng)度、溫度等。
更具體地，術(shù)語"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"、"核酸分 子"包括多脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、包括剪接或未剪接的tRNA、 rRNA、 hRNA和mRNA在內(nèi)的多核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它類型的 為嘌吟堿基或嘧啶堿基的N-或C-糖苷的多核苷酸和包括肽核酸(PNA)在內(nèi) 的含有其它骨架的其它聚合物以及其它合成的序列特異性核酸聚合物，條 件是該聚合物含有使得如DNA和RNA中存在的那樣的堿基配對(duì)和堿基堆 積的構(gòu)象的核堿基。術(shù)語"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"和"核 酸分子"之間不存在有意的長度區(qū)別，這些術(shù)語在本文中可以互換使用。 這些術(shù)語僅僅指該分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這些術(shù)語包括例如3'-脫氧 -2',5'-DNA、寡脫氧核糖核苷酸N3'P5'磷酰胺、2'-0-烷基-取代RNA、雙鏈 和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA和它們的雜交體包括例如DNA和/或 RNA和/或PNA和/或其它形式之間的雜交體，也包括多核苷酸或寡核苷酸 的已知類型的修飾形式例如標(biāo)記，烷基化，"帽"，用類似物取代一個(gè)或 多個(gè)核苷酸，核苷酸間修飾例如具有負(fù)電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代 磷酸酯等)的那些、含有側(cè)基(pendantmoiety)如蛋白質(zhì)(包括酶(例如核酸酶)、
毒素、抗體、信號(hào)肽、聚左旋賴氨酸等)的那些、含有嵌入劑(如吖啶、補(bǔ)骨 酯素等)的那些、含有螯合物(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等的螯 合物)的那些、含有垸化劑的那些、具有修飾連接(如a異頭核酸等)的那些， 以及非修飾形式。應(yīng)理解，如本文所用，術(shù)語"核苷"和"核苷酸"包括那些不僅含有 已知嘌呤和嘧啶堿基還含有其它已修飾的雜環(huán)堿基的基團(tuán)。這些修飾包括 甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其它雜環(huán)。修飾的核苷或核苷 酸還可以包括糖基上的修飾，例如其中一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素、脂族基替 代或官能化為醚、胺等。術(shù)語"核苷酸單元"意于包括核酸和核苷酸。
此外，對(duì)核苷酸單元的修飾包括重排、添加(appending)、取代或改變 嘌呤或嘧啶堿基上的與各自互補(bǔ)的嘧啶或嘌呤形成氫鍵的官能基。所得的 修飾核苷酸單元任選可以與其它這樣修飾的核苷酸單元形成堿基對(duì)，但是 不與A、 T、 C、 G或U形成堿基對(duì)?？梢砸氩环恋K多核苷酸功能的無堿 基位點(diǎn)；優(yōu)選多核苷酸不含無堿基位點(diǎn)。多核苷酸中的一部分殘基或全部 殘基可以以一種或多種方式任選被修飾。
修飾核苷酸單元的實(shí)例包括吖丙啶基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-氟尿嘧 啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、肌 苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿苷、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧 啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、 5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、(3-D-甘露糖基Q核苷((3-D-mannosylqueosine)、 5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假 尿嘧啶、Q核苷(queosine)、 2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、 4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2，6-二氨基嘌呤和"鎖定" 核酸單元(LNA)及其類似物。Koshkin等，Tetrahedron Letters 1998 39: 4381-4384; PCT Publ. No. W099/14226。
在使得胸苷的N3-H和C4-氧基分別與腺苷的Nl和C6-NH2之間以及 胞苷的C2-氧基、N3和C4-NH2分別與鳥苷的C2-NH2、 N'-H和C6-氧基 之間形成氫鍵的條件下形成標(biāo)準(zhǔn)A-T和G-C堿基對(duì)。因此，例如鳥苷(2-氨基-6-氧基-9-J3-D-呋喃核糖基-嘌呤)可以修飾成為異鳥苷(2-氧基-6-氨基 -9-l3-D-呋喃核糖基-嘌呤)。這種修飾導(dǎo)致將不再有效地與胞嘧啶形成標(biāo)準(zhǔn)堿 基對(duì)的核酸堿基。但是，將胞嘧啶(l-p-D-呋喃核糖基-2-氧基-4-氨基-嘧啶) 修飾成'為異胞嘧啶(l-p-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧基-嘧啶)導(dǎo)致將不能有效 地與鳥苷形成堿基對(duì)但將與異鳥苷形成堿基對(duì)的修飾核苷酸。異胞嘧啶可以從Sigma Chemical Co. (St Louis, MO)獲得；異胞苷可以通過Switzer等， (1993) Biochemistry 32: 10489-10496及其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的方法 制備；2'-脫氧-5-甲基-異胞苷可以通過Tor等，(1993)J. Am. Chem. Soc. 115: 4461-4467及其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的方法制備；以及異鳥嘌呤核苷酸 可以通過Switzer等，(1993)同上和Mantsch等，(1993) Biochem. 14: 5593-5601中描述的方法或通過Collins等的美國專利5,780,610中描述的方 法來制備。其它非天然堿基對(duì)可以通過Picdrilli等，(1990) Nature 343: 33-37 中描述的關(guān)于合成2,6-二氨基嘧啶及其互補(bǔ)體(1-甲基吡唑并-[4,3]嘧啶 -5,7-(4H,6H)-二酮)的方法來合成。其它這樣形成獨(dú)特堿基對(duì)的修飾核苷酸 單元是己知的，如Leach等，(1992) J, Am. Chem. Soc. 114: 3675-3683和 Switzer等，同上中所描述的那些。
"互補(bǔ)的"或"基本互補(bǔ)的"是指核苷酸或核酸之間例如傳感器肽核 酸與目標(biāo)多核苷酸之間雜交或形成堿基對(duì)的能力?；パa(bǔ)核苷酸通常是A與 T(或A與U)或C與G。對(duì)于兩條單鏈多核苷酸或PNA的堿基，當(dāng)以最佳
方式排列和比較而且具有適當(dāng)?shù)牟迦牖蛉笔r(shí)， 一條鏈的堿基與另一條鏈 的堿基至少約80%，通常至少約90%-95%，更優(yōu)選約98%-100%配對(duì)時(shí)，
則說這兩條鏈?zhǔn)腔净パa(bǔ)的。
或者，當(dāng)多核苷酸或PNA在選擇性雜交條件下與其互補(bǔ)體雜交時(shí)，則 基本互補(bǔ)性存在。通常在至少14-25個(gè)堿基的長度內(nèi)至少具有約65%、優(yōu) 選至少約75%、更優(yōu)選至少約90%的互補(bǔ)時(shí)，會(huì)發(fā)生選擇性雜交。參見 M. Kanehisa Nucleic Acids Res. 12: 203 (1984)。
"優(yōu)先結(jié)合"或"優(yōu)先雜交"是指與樣品中非互補(bǔ)的聚合物相比一個(gè) 多核苷酸或PNA與樣品中它的互補(bǔ)體增加的結(jié)合傾向性。
雜交條件通常包括鹽濃度小于約1 M，更通常小于約500mM，優(yōu)選小 于約200mM。在肽核酸或其它類似核酸與多核苷酸之間雜交的情況下，雜 交可在幾乎不含或不含鹽的溶液中進(jìn)行。雜交溫度可以低至5t:，但通常高 于22'C，更通常高于約3(TC，優(yōu)選高于約37'C。較長的片段對(duì)于特異性雜 交可能需要較高的雜交溫度。其它因素可能影響雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，其包括堿 基組成和互補(bǔ)鏈的長度、有機(jī)溶劑的存在和堿基錯(cuò)配的程度，而所用的參 數(shù)的組合比任一單獨(dú)的參數(shù)的絕對(duì)值都重要。其它可以控制的雜交條件包括緩沖劑類型和濃度、溶液pH、降低背景結(jié)合的封閉試劑如重復(fù)序列或封 閉蛋白溶液的存在和濃度、洗滌劑類型和濃度、增加多核苷酸相對(duì)濃度的 分子如聚合物、金屬離子及它們的濃度、螯合劑及它們的濃度以及本領(lǐng)域 已知的其它條件。本文使用的術(shù)語"適體"(或"核酸抗體")是指通過其形狀識(shí)別期望的 目標(biāo)分子并與之結(jié)合的單鏈或雙鏈多核苷酸。參見例如PCT公開WO 92/14843、 WO 91/19813和WO 92/05285。"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可以互換使用，包括通過肽鍵連接的 氨基酸分子鏈。該術(shù)語不指產(chǎn)物的具體長度。因此，"肽"、"寡肽"和 "蛋白質(zhì)"均包括在多肽的定義之內(nèi)。該術(shù)語包括多肽的含有翻譯后修飾 例如糖基化、乙酰化、磷酸化和硫酸化的多肽。此外，蛋白質(zhì)片段、類似 物(包括非遺傳密碼編碼的氨基酸如高半胱氨酸、鳥氨酸、D-氨基酸和肌酸)、 天然或人工突變體或變異體或它們的組合，融合蛋白、衍生殘基(氨基烷基 化、羧基乙?；蝓セ?等都包括在多肽的含意之內(nèi)。如本文所用，術(shù)語"結(jié)合對(duì)"是指以高于與樣品中其它成分的親和力 彼此特異性結(jié)合的第一個(gè)和第二個(gè)分子。在結(jié)合對(duì)成員之間的結(jié)合通常是 非共價(jià)結(jié)合。結(jié)合對(duì)的實(shí)例包括免疫學(xué)結(jié)合對(duì)(如任何半抗原或抗原復(fù)合物 與相應(yīng)的抗體或其結(jié)合部分或片段的組合，例如地高辛配基與抗地高辛配 基、熒光素與抗熒光素、二硝基苯酚與抗二硝基苯酚、溴脫氧尿苷與抗溴 脫氧尿苷、小鼠免疫球蛋白與羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫學(xué)結(jié)合對(duì)(如生 物素-抗生物素蛋白、生物素-鏈霉抗生物素、激素(如甲狀腺素和可的松)-激素結(jié)合蛋白、受體-受體激動(dòng)劑或拮抗劑(如乙酰膽堿受體-乙酰膽堿或其 類似物)、IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-輔酶、酶-酶抑制劑和能夠 形成核酸二倍體的互補(bǔ)多核苷酸對(duì))等。結(jié)合對(duì)兩成員之一可以或兩者都可 以與其它分子綴合。如本文所用，術(shù)語"抗體"包括從多克隆和單克隆制備物獲得的抗體 以及雜交(嵌合)抗體分子(參見例如Winter等，(1991) Nature 349: 293-299 和美國專利4,816,567); F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共價(jià)異二聚體，參 見例如Inbar等，(1972) Proc Natl Acad Sci USA 69: 2659-2662和Ehrlich等， (1980) Biochem 19: 4091-4096);單鏈Fv分子(sFv)(參見例如Huston等，(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-5883); 二聚和三聚抗體片段構(gòu)建 體；微型抗體(minibody)(參見例如Pack等，(1992) Biochem 31: 1579-1584、 Cumber等、(1992) J Immunology 149B: 120-126);人源化抗體分子(參見例 如Riechmann等，(1988) Nature 332: 323-327、 Verhoeyan等，(1988) Science 239: 1534-1536和1994年9月21日公開的英國專利GB 2,276,169);以及 從這些分子中獲得的任何功能性片段，其中這種片段保留了母抗體分子的 特異性結(jié)合性質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語"單克隆抗體"是指具有同種抗體群體的抗體組合 物。該術(shù)語不限制抗體的種類或來源，也無意被其制備方式所限制。因此， 該術(shù)語包括從鼠雜交瘤獲得的抗體以及用人雜交瘤獲得的或從小鼠表達(dá)的 人免疫球蛋白鏈基因或其部分制備的鼠雜交瘤獲得的人單克隆抗體。參見 例如Cote等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985， p. 77。
本文的"多重的"是指其中多種分析物可同時(shí)被測(cè)定的測(cè)定法或其它 分析方法。
"任選的"或"任選地"是指其后描述的事件或情況可以發(fā)生或不發(fā) 生，而且該描述包括該事件或情況發(fā)生的情況和該事件或情況不發(fā)生的情 況。
樣品
要分析的樣品部分可以是可直接或間接從活生物體獲得的任何來源的 生物材料，包括細(xì)胞、組織或液體。樣品的非限制性實(shí)例包括血液、尿、 精液、乳汁、痰、粘液、胸腔液(plueral fluid)、盆腔液、滑膜液(sinovial fluid)、 腹水、體腔灌洗液、眼刷物(eye brushing)、皮膚刮下物(skin scmping)、 口 腔拭物、陰道拭物、巴氏涂片物(papsmear)、直腸拭物、吸出物、穿刺活組 織檢查物(needle biospy)、例如通過手術(shù)或尸檢獲得的組織切片、血漿、血 清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物、淚 液、唾液、腫瘤、器官、微生物培養(yǎng)物、病毒和體外細(xì)胞培養(yǎng)物成分的樣品o
樣品可以是已知含有目標(biāo)的對(duì)照樣品。也可以使用陰性對(duì)照樣品以用于確定是否一套給定的條件產(chǎn)生假陽性。樣品可以在如下所述的溶液中或基材上提供?？梢栽跇悠放c傳感器分 子在保存溶液中接觸之前或之后將樣品轉(zhuǎn)移至基材上?；幕目梢园瑥V范的材料，生物材料、非生物材料、有機(jī)材料、無機(jī)材料或這些材料的任意組合。例如基材可以是聚合的L-B膜、功能性玻璃、 Si、 Ge、 GaAs、 GaP、 Si02、 SiN4、改性硅或多種凝膠或聚合物如(聚)四氟 乙烯、(聚)亞乙烯基二氟、聚苯乙烯、交聯(lián)聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、 聚乙醇酸、聚(丙交酯共乙交酯)、聚酐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯共乙 酸乙烯酯)、聚硅氧烷、聚二氧化硅、膠乳、葡聚糖聚合物、環(huán)氧樹脂、聚 碳酸酯中的任一種或它們的組合?；目梢允瞧矫娼Y(jié)晶基材如二氧化硅基基材(如玻璃、石英等)或例如半 導(dǎo)體和微處理器工業(yè)中使用的結(jié)晶基材如硅、砷化鎵等。硅補(bǔ)強(qiáng)劑也可以用作基材，它可以通過本領(lǐng)域己知的方法制備。氣凝 膠基材可以用作獨(dú)立的基材或作為另一種基材的表面涂層?；目梢允侨魏涡螤?，通常是板、載玻片、蓋玻片、珠、小丸、圓盤、 粒子、鏈、沉淀物、薄片、任選多孔的凝膠、大片、管、球、容器、毛細(xì) 管、墊、片、膜、芯片、多孔板或盤、光纖等。雖然基材一般是無活性的 (inanimate)形式，但是對(duì)于一些應(yīng)用基材可以是硬質(zhì)或半硬質(zhì)的任何形式?；谋砻婵梢杂膳c基材相同的材料組成或者可以由不同材料制成，可 以通過化學(xué)或物理手段與基材偶聯(lián)。這種偶聯(lián)的表面可以由多種材料例如 聚合物、塑料、樹脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金屬、無 機(jī)玻璃、膜或上面列出的基材中的任一種組成。在一種實(shí)施方案中，表面 是光學(xué)透明的而且具有表面Si-OH官能團(tuán)，如在二氧化硅表面上存在的那 些。目標(biāo)目標(biāo)可以是期望視覺可見的樣品中的任何成分。目標(biāo)的非限制性實(shí)例 包括可以針對(duì)其獲得傳感器的多核苷酸、蛋白質(zhì)、多糖、粘多糖、蛋白聚糖、脂質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)胞類型(cdl type)、生物體、病毒、結(jié)構(gòu)或分子。該目 標(biāo)可以是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如中心體或中心體成分或者是細(xì)胞外產(chǎn)物或成分。當(dāng)目標(biāo)是細(xì)胞或細(xì)胞成分或產(chǎn)物時(shí)，該細(xì)胞可以是任何來源的，包括 原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或古細(xì)胞(archea)。該細(xì)胞可以是活的或死的。若來自 于多細(xì)胞生物體，則該細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類型。該細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì) 胞系或原分離物，該細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、爬行動(dòng)物 細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、鄰菌細(xì)胞、螺旋體細(xì)胞或原生動(dòng)物細(xì)胞。該 細(xì)胞可以是人細(xì)胞、鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞、雞細(xì)胞、鵓細(xì)胞或狗 細(xì)胞。該細(xì)胞可以是正常細(xì)胞、突變細(xì)胞、遺傳操作細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。來自多細(xì)胞生物體的細(xì)胞類型的實(shí)例包括嗜酸細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、松果 體細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成釉細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、基(干)細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、肝 細(xì)胞、神經(jīng)元、表面凸出細(xì)胞(bulging surface cdl)、 C細(xì)胞、心肌細(xì)胞、泡 心細(xì)胞、主細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、黃體細(xì)胞、蛻 膜細(xì)胞、樹突、內(nèi)分泌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、紅細(xì) 胞、球外系膜細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞、胎兒紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、卵泡細(xì) 胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、巨大貝茲細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、毛細(xì)胞、內(nèi)毛細(xì)胞、I型毛細(xì) 胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、萊迪希氏細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì) 胞、溶菌酶分泌細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨核細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、系 膜細(xì)胞、單核細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、肌樣細(xì)胞、頸粘液細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、中 性粒細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、卵母細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、 骨細(xì)胞、柱細(xì)胞、sulcal細(xì)胞、甲狀旁腺細(xì)胞、壁細(xì)胞、胃蛋白酶分泌細(xì)胞、 周細(xì)胞、松果體細(xì)胞、垂體細(xì)胞、漿細(xì)胞、血小板、足細(xì)胞、精母細(xì)胞、 浦肯野細(xì)胞、錐體細(xì)胞、紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、施萬細(xì)胞、支持細(xì)胞、柱 狀細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、促生長素抑制素細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、 精子細(xì)胞、精原細(xì)胞、精子、星形細(xì)胞、支持戴特斯細(xì)胞、支持漢森細(xì)胞、 表面細(xì)胞、表面上皮細(xì)胞、表面粘液細(xì)胞、汗腺細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、膜黃 體細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、過渡上皮細(xì)胞、I型肺泡 細(xì)胞和II型肺泡細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞的實(shí)例包括腺瘤、癌、腺癌、纖維腺瘤、成釉細(xì)胞瘤、星形 細(xì)胞瘤、間皮瘤、膽管細(xì)胞癌、膽管纖維瘤、膽管瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、絨毛膜癌、顱咽管瘤、囊腺癌、囊腺瘤、無性細(xì)胞瘤、室管膜瘤、 上皮瘤、紅細(xì)胞性白血病、纖維腺瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠 質(zhì)瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、成神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、粒細(xì)胞性白血病、血管 瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、冬眠瘤、組織細(xì)胞瘤、角化棘皮瘤、平 滑肌瘤、平滑肌肉瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、黃體瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、 淋巴瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、間皮瘤、骨髓脂肪瘤、腎 母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肌神經(jīng)母細(xì)胞瘤、牙瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨 軟骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、乳頭狀瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、松果體瘤、 垂體細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、精原細(xì)胞 瘤、畸胎瘤、泡膜細(xì)胞瘤和胸腺瘤。細(xì)菌的實(shí)例包括金黃色葡萄球菌、嗜肺菌團(tuán)菌(i^gz'o e/to _p"e，o/ Ma)、大腸桿菌(Esc/zm'c/n'a co/z')、結(jié)核分枝桿菌(M ft/6em//0^)、 鼠傷寒沙門氏菌(51. 2^/n'mwn'i/m)、霍亂弧菌(KA/7'o c/w/era)、產(chǎn)氣莢膜梭菌 (C7osmWw附/7e吵tozge"力、破傷風(fēng)梭菌(C7as/r/^w附feto"/)、 肉毒梭菌 (C7fw/rifi /w;w Z)oftz/iwM附)、巴氏梭菌(C7cwfnWMm 6araW) 、 X艮3隹梭菌 (C/os^rWwm力;^d/e)、麻風(fēng)分枝桿菌(M /e; rae)、幽門螺旋桿菌(/^/z'co6a"" /5[y/on')、 B型流感嗜血桿菌(i/e附o/ /w7ws ^/ e 6)、 白喉?xiàng)U菌(Co，e6ot"e"'Mrw 卻/z/Zzm,ae)、 微小棒狀桿菌(Co，e6a"m'歸 w/"w^sj/附mw)、百曰咳桿菌(丑0^^&//0 / er^sw's)、月市炎鏈球菌(5^e/ fococc附 /wewmom'ae)、淋病奈瑟氏球菌(iVe&seWa go"on^oeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌 (A^/wen'a wem'wgz'ricfes)、痢疾致賀氏菌(S/n'ge〃a辦sewfen'ae)、銅綠假單胞菌 CP"wfito附o"as aerwg/wora)、脆弱擬桿菌(5flcfera/^fes々"g/fe)、產(chǎn)黑素普雷沃 氏菌CPrevofe/Aa附e/""/"oge"/c")、梭桿菌屬(FwsoZ acfer/w傷)、豬紅珍王丹毒絲 菌C&7w)3e/0^7Wx Wzww'o; af/n'ae)、 單核細(xì)胞增生禾!j斯特氏菌(丄/Wer/a wo"oc聲oge"as)、 炭疽芽孢桿菌(5a。7/ws of"Aracz's)、 杜氏嗜血桿菌 (^"emop&'/ws dwcr^y0、 土拉熱弗朗西絲氏菌(Fra"c&e〃a m/a廠era&)、鼠疫耶 爾森氏菌(7"eM/m'a 、漢氏巴爾通氏體(5"^0恥//" /^rae/"e)、克雷伯氏菌屬(《/&> &//00、腸桿菌屬C&7fera6a"w)、沙雷氏菌屬CS^raria)、變形菌屬 (iVofew)和致賀氏菌屬0S7n'ge//(3)。螺旋體的實(shí)例包括蒼白密螺旋體(7V印onewa Pfl///^m)、極細(xì)密螺旋體(r 、斑點(diǎn)病密螺旋體(r caratewm)、回歸熱疏螺旋體CBo^re/Zarece"他)、奮森氏疏螺旋體(及v/"ce"riz')、布氏疏螺旋體(及6wrgafo;^r/) 禾口出血黃疸鉤端蟲累方定體(丄e/ tos/ /ra /cfera/zaewon-/7<ag/ae)0真菌的實(shí)例包括牛型放線菌(A^"om少ces k W力、煙曲霉(^ / wg/〃us /w附/ga^s)、皮炎芽生菌CB/osto附少cas cfermflririd^)、 白色念珠菌、粗球孢子 菌(CoccWoW&s /附附她)、新型隱球菌(Oy/7tococcMS e"。y^膨"力、莢膜組織 胞衆(zhòng)菌(/^sto/ /os附a ca;ww/afM附)、申克氏抱子絲菌0S/ oro^7'c/zw附sc/ze"cA:zY)、 衣氏放線菌(力cfz'"om;;c" &rae/z7)、牛型放線菌、煙曲霉、皮炎芽生菌、白 色念珠菌、粗球孢子菌、新型隱球菌、莢膜組織胞漿菌、星狀諾卡氏菌 (A^c"nZ/" as/ero/^fes)、卡氏月市囊蟲(戶"ewwoc"http://5 car/w//)、申克氏孢子絲菌 (S/ ora^n'x sc/ e"cA:z7;)、巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/n'a ; astor/s)、酉良酒酵母 (<Sacc/zflram_yces cerev&z'ae)禾口粟酒裂殖酵母(5b/z/zosacc/zarowyc&s ; ow6e)?？梢跃幋a的原生動(dòng)物和寄生蟲的實(shí)例包括惡性瘧原蟲(/V^moA"w yb/czJ9orwm)、痢疾內(nèi)阿米巴(五wto/woeZ a /z/Mo/;^/ca)、錐蟲(^ypa womas)、禾!j 什曼原蟲(丄e^/2wa"/a)、剛地弓形蟲(7bx/ o/asma go"必')、賈第鞭毛蟲 (G7ani/a/a /a附W/a)禾口沙目艮衣原體(CWam:v^^3 frac/zo附o^s)。當(dāng)目標(biāo)是多核苷酸時(shí)，該目標(biāo)多核苷酸可以是單鏈、雙鏈或更高級(jí)的， 并可以是任何拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)例如線性、環(huán)狀、分支。單鏈目標(biāo)多核苷酸的實(shí)例 包括mRNA、 DNA、 tRNA、 hnRNA、 ssRNA或ssDNA病毒基因組，不過這些多核苷酸可以含有內(nèi)部互補(bǔ)序列和顯著的二級(jí)結(jié)構(gòu)。雙鏈目標(biāo)多核苷 酸的實(shí)例包括基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、 dsRNA或dsDNA病毒基因組、質(zhì)粒、噬菌體和類病毒。 傳感器傳感器可以是穩(wěn)定、可溶且能在含醇保存溶液中與它的目標(biāo)特異性結(jié) 合的任何物質(zhì)。傳感器的非限制性實(shí)例包括小的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)、無機(jī)分子、 上述的多核苷酸包括肽核酸和適體。也可以使用不同傳感器的組合，其允 許對(duì)樣品中的多種目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和分析。傳感器可以是一種被選擇的與細(xì) 胞成分如中心體或其子成分特異性結(jié)合的傳感器?？梢詼y(cè)試多種候選傳感 器分子例如化學(xué)物質(zhì)庫與期望的目標(biāo)的結(jié)合，該測(cè)試可以在醇保存溶液中完成。傳感器必須是可以檢測(cè)的，可以是自然可檢測(cè)的或者可以是通過與標(biāo) 記偶聯(lián)而使之成為可檢測(cè)的?？梢允褂萌魏斡行У臋z測(cè)方法，包括光學(xué)法、 分光鏡法、電法、壓電法、磁法、拉曼散射法、表面等離子體共振法、放 射顯影法、比色法、量熱法等。優(yōu)選傳感器對(duì)人和/或檢測(cè)裝置是光學(xué)可檢 測(cè)的或者可以使其變?yōu)楣鈱W(xué)可檢測(cè)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用發(fā)光二極管(LED)進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，傳感器可以是與懷疑存在于樣品中的目標(biāo)多核苷 酸特異性結(jié)合的PNA。 PNA是一種合成核酸類似物，具有肽衍生結(jié)構(gòu)。它 具有由重復(fù)N-2-氨乙基甘氨酸單元組成的骨架，這些單元通過酰胺鍵而不 是DNA中存在的糖-磷酸基連接(l)。 PNA通常被稱為"擬DNA" (DNA mimk)，因?yàn)樗c互補(bǔ)的核酸目標(biāo)雜交遵守沃森-克里克堿基配對(duì)法則(2)。 但是由于它們具有肽骨架，PNA帶中性電荷而且具有優(yōu)于DNA的獨(dú)特性 質(zhì)，包括熱穩(wěn)定性增加、雜交動(dòng)力學(xué)速率快(為DNA : DNA雜交速率的 50000倍)(3)和對(duì)蛋白酶和核酸酶的降解作用具有耐受性。另夕卜，由于其疏 水性(4)PNA可以容易地穿過生物體的細(xì)胞壁并找到它的核酸目標(biāo)。這些特 征使得PNA成為體外診斷特別是原位雜交的優(yōu)異工具。在另一個(gè)實(shí)施方案中，傳感器可以是一種適體。與期望的目標(biāo)結(jié)合的 寡核苷酸的制備在Blackwell, T. K.等，Science (1990) 250: 1104-1110; Blackwell， T. K.等，Science (1990) 250: 1149-1152; Tuerk， C.和Gold, L.， Science (1990) 249: 505-510; Joyce, G. F.， Gene (1989) 82: 83-87; 1993年12 月14日授予Gold等的美國專利5,270,163中描述。這種寡核苷酸被稱為"適 體"。Tuerk禾口 Gold描述了名為"systematic evolution ofligands by exponential enrichment"的方法的應(yīng)用。在該方法中，通過固定于硝酸纖維素濾膜上的 期望的核酸結(jié)合蛋白來對(duì)特定部位上完全隨機(jī)的一組RNA進(jìn)行結(jié)合選擇。 然后回收結(jié)合的RNA并擴(kuò)增為能進(jìn)行后續(xù)體外轉(zhuǎn)錄的雙鏈DNA。然后將 新轉(zhuǎn)錄的RNA通過這一方法循環(huán)以富集具有共有序列的寡核苷酸以與關(guān) 連蛋白結(jié)合。然后可以對(duì)這樣獲得的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序以用于進(jìn)一步研究。 Tuerk和Gold將該方法用于識(shí)別通過T4 DNA聚合酶的RNA結(jié)合域結(jié)合 的RNA寡核苷酸?？梢栽诖急４嫒芤喝鏟reservCyt中測(cè)試含有適體的傳感器的結(jié)合，或 者可以通過使用這種溶液的測(cè)定法進(jìn)行。傳感器適體可以通過已知的任何 方法包括合成、重組和純化方法制備，且可以單獨(dú)使用或與其它對(duì)同一目 標(biāo)特異的適體組合使用。適體可以標(biāo)記到和/或綴合于其它物質(zhì)上。術(shù)語"適 體"特別包括含有衍生自將兩種或多種己知適體與給定目標(biāo)相比較的共有 序列的"二級(jí)適體"。適體的制備在1996年12月10日授予Toole等的美 國專利5，582，981中有廣泛的討論。用作確定適體傳感器的特異性結(jié)合序列 的原料的寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。原料寡核苷酸將含有 隨機(jī)序列部分，通常包括約10-400個(gè)核苷酸，更優(yōu)選20-100個(gè)核苷酸。隨 機(jī)序列被引物序列側(cè)翼，這允許將聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)用到從復(fù)合物中獲得的 寡核苷酸。可以將發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)結(jié)合的適體分離、測(cè)序然后再合成為常規(guī) DNA或RNA部分，或者可能是上述的"修飾的"多核苷酸。例如，通常 存在的任一羥基可以被磷酸酯基、磷酸基替代、被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)或被活 化以準(zhǔn)備與另外核苷酸的另外連接，或者可以與固體載體綴合。通常5'末 端的OH是游離的但可以被磷酸化，3'末端的OH取代基也可以被磷酸化。 羥基還可以衍生為標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基。 一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵可以被另外的連接 基替代。這些另外的連接基包括但不限于下述實(shí)施方案其中P(O)O被 P(O)S、 P(0)NR2、 P(O)R、 P(O)OR'、 CO或CNR2替代，其中R是H或垸 基(1-20C)，而R'是烷基(1-20C);此外，該基團(tuán)可以通過O或S與相鄰的核 苷酸相連。連接并不需要都相同?？梢源_定對(duì)于任何期望目標(biāo)例如中心體 成分的適體。小分子如2002年4月9日授予Kong的美國專利6,368,818 中描述結(jié)晶劑也可以用于與細(xì)胞器包括中心體、微管和/或細(xì)胞骨架結(jié)合。細(xì)胞分裂過程涉及一系列受控、互相依賴的生化反應(yīng)，首先產(chǎn)生染色 體拷貝，之后是細(xì)胞分裂。稱為有絲分裂的該過程開始時(shí)包括亞細(xì)胞器的 形成，亞細(xì)胞器提供了細(xì)胞分裂所必需的結(jié)構(gòu)骨架。 一個(gè)重要的細(xì)胞器是 中心體，其與相關(guān)成分一起起定位點(diǎn)的作用，微管蛋白網(wǎng)絡(luò)可以從這個(gè)定 位點(diǎn)將母細(xì)胞DNA與子細(xì)胞的分開。正常的靜止細(xì)胞通常具有一個(gè)中心 體，但在細(xì)胞分裂之前有中心體復(fù)制，因此形成兩個(gè)定位點(diǎn)。癌細(xì)胞或?qū)?致癌癥的前體細(xì)胞可能具有異常的中心體數(shù)目。因此中心體計(jì)數(shù)可以用來 識(shí)別異常細(xì)胞。在一種實(shí)施方案中，提供通過使樣品與引入醇保存溶液中的中心體特 異的傳感器接觸，之后將從該混合物中取出的樣品進(jìn)行定量成像而進(jìn)行中 心體計(jì)數(shù)的方法。因此，可以使用優(yōu)先與中心體或中心體外周物質(zhì)結(jié)合的 傳感器以允許通過視覺檢査或通過計(jì)算機(jī)成像來進(jìn)行中心體計(jì)數(shù)。中心體目標(biāo)分子的實(shí)例包括劍蛋白、劍蛋白亞基(參見2002年8月6日授予Vale 等的美國專利6,429,304)、 eg5 (參見2002年10月29日授予Uhlmann等的 美國專利6,472,521)、 Nlkl(參見美國專利6,476,193)、 HSP90 (參見2002年 1月1日授予Gonzalez等的美國專利6,335,157)、 trinectin、中心粒周蛋白 (pericentrin)、 cpl40、中心體蛋白、i微管蛋白、a-微管蛋白、P-微管蛋白(參 見1999年10月26日授予Doxsey的美國專利5,972,626)、 CENP畫F (參見 1997年2月4日授予Yen等的美國專利5,599,919)、 aurora蛋白(參見美國 專利6,207,401 、5,972,676和5，962,312)和BTAK(參見美國專利6,352,858)。 本文使用的術(shù)語"中心體"和"中心體的"等是指中心體外周區(qū)域以及中 心體區(qū)域，因此例如術(shù)語"中心體目標(biāo)"包括中心體外周目標(biāo)以及中心體 目標(biāo)。傳感器還可以包括可檢測(cè)的中心體酶的底物，該底物在結(jié)合時(shí)可以 是可檢測(cè)的和/或在被中心體酶作用時(shí)可以產(chǎn)生可檢測(cè)的反應(yīng)產(chǎn)物。標(biāo)記本文描述的用于本發(fā)明的標(biāo)記包括與樣品中存在的目標(biāo)締合的當(dāng)傳感 器與目標(biāo)結(jié)合時(shí)可以直接或間接被檢測(cè)的任何物質(zhì)。標(biāo)記的實(shí)例包括發(fā)色 團(tuán)、發(fā)光團(tuán)、熒光團(tuán)、色原體、半抗原、抗原、放射性同位素、磁性顆粒、 金屬納米顆粒如金或銀納米顆粒、酶、抗體或其結(jié)合部分或同等物、適體 和結(jié)合對(duì)中的一員。熒光團(tuán)可以是吸收一種波長的光而發(fā)射另一種波長的光的任何物質(zhì)。 典型的熒光團(tuán)包括熒光染料、半導(dǎo)體納米晶體、鑭系元素螯合物和綠色熒 光蛋白。熒光染料的實(shí)例包括熒光素6-FAM、羅丹明、徳克薩斯紅、四甲基羅 丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、 arboxyrhodol、羧基羅丹明110、 Cascade Blue、 Cascade Yellow、香豆素、Cy2 、 Cy3 、 Cy3.5 、 Cy5 、 Cy5.5 、 Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP (多甲藻黃素葉綠素-a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE (6-羧基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基熒光素)、NED、 ROX (5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、熒光黃、Marina Blue、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Alexa Fluor 350、 Alexa Fluor 430、 AlexaFluor 488、 Alexa Fluor 532、 Alexa Fluor 546、 Alexa Fluor 568、 AlexaFluor 594、 Alexa Fluor 633、 Alexa Fluor 647、 Alexa Fluor 660、 Alexa Fluor 680、 7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BODIPY FL、 BODIPY FL-Br2、 BODIPY 530/550、 BODIPY 558/568、 BODIPY 564/570、 BODIPY 576/589、 BODIPY 581/591、 BODIPY 630/650、 BODIPY 650/665、 BODIPY R6G、 BODIPY TMR、 BODIPY TR、它們的綴合物和組合。鑭系元素 螯合物的實(shí)例有銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。本領(lǐng)域己知多種熒光半導(dǎo)體納米晶體(SCNC)，半導(dǎo)體納米晶體的制備 和使用方法在1999年5月27日公開的發(fā)明人為Bawendi等的PCT公開 WO 99/26299、 1999年11月23日授予Weiss等的美國專利5,990,479和 Bruchez等，Science 281: 2013， 1998中有描述?？梢垣@得具有峰發(fā)射波長明 確的(well-defmed)極窄發(fā)射帶的半導(dǎo)體納米晶體，這允許許多不同的SCNC 在同一測(cè)定中作為信號(hào)發(fā)色團(tuán)，任選與其它非SCNC型信號(hào)發(fā)色團(tuán)組合使 用。術(shù)語"綠色熒光蛋白"既指天然水母綠色熒光蛋白也指已經(jīng)確定的表 現(xiàn)改變的熒光特征的突變型，改變的熒光特征包括改變的激發(fā)和發(fā)射最大 波長以及不同的激發(fā)和發(fā)射光譜形狀(Delagrave, S.等，(1995) Bio/Technology 13: 151-154; Heim， R.等，(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504; Heim,R.等，(1995) Nature 373: 663-664)。 Delgrave等分 離了克隆Aequorea victoria GFP的激發(fā)光譜發(fā)生紅移的突變型 (Bio/Teclinology 13: 151-154(1995)。 Heim， R.等報(bào)道了具有藍(lán)色熒光的突變 型(Tyr66至His) (Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) USA 91: 12501-12504)。酶的實(shí)例包括在含醇保存溶液中穩(wěn)定的酶。在這些條件下可以測(cè)試它 們穩(wěn)定性的酶包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、葡萄糖 氧化酶、細(xì)菌熒光素酶、昆蟲熒光素酶和海腎(sea pansy)熒光素酶(Renilla koellikeri)，它們?cè)诒绢I(lǐng)域己知的合適的底物的存在下和測(cè)定條件下可以產(chǎn) 生可檢測(cè)的信號(hào)。半抗原和/或結(jié)合對(duì)成員的實(shí)例包括抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、地 高辛配基、生物素以及上述的那些。保存溶液保存溶液適用于在室溫下保存細(xì)胞和組織。該溶液含有醇且優(yōu)選含有 緩沖劑，并可以用于生物活組織檢査之后和染色或其它分析形式之前在室溫下體外保存哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該溶液可以是如1993年10月26日授予Huriey 等的美國專利5,256,571中描述的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，該保存溶液提 供用于相對(duì)長期的室溫保存的介質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該保存溶液提 供用于轉(zhuǎn)運(yùn)和除去樣品溶液中不期望的成分例如蛋白質(zhì)的介質(zhì)。更特別地，該保存溶液含有可與水混溶的醇且優(yōu)選含有抗聚集劑和緩 沖劑。醇組分以足以固定樣品細(xì)胞或組織同時(shí)仍使得傳感器與它的目標(biāo)有可接受的結(jié)合的量存在。醇通常是低級(jí)烷基(Cw6)醇，可以是Q4醇，可以選自甲醇、乙醇和異丙醇。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該醇是甲醇。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，醇以足以固定和保存感興趣的樣品成分 的水平存在，可以以高于約40%且低于約60%的量存在，可以為約45%或 以上，可以為約55%或以下。含約60%或以上醇的溶液傾向于表現(xiàn)聚集或 凝結(jié)，這干擾了后續(xù)的將樣品細(xì)胞有效染色的能力。相反，如果在該實(shí)施 方案中醇濃度為40%或以下，那么細(xì)胞就不能充分固定以進(jìn)行相對(duì)長期的 保存，而是隨時(shí)間引起細(xì)胞降解。在該實(shí)施方案中，該溶液含有占溶液的 約50。/6的甲醇。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，醇以占溶液的至少20%的量存在。盡 管如上所述，這一濃度的醇不能夠?qū)崿F(xiàn)長期保存(即多于兩日)，但它在該時(shí) 間內(nèi)充分地固定細(xì)胞以進(jìn)行后續(xù)分析?；蛘?，可以將細(xì)胞從該20%的實(shí)施 方案溶液轉(zhuǎn)移至較高濃度例如50%的醇溶液中以進(jìn)行后續(xù)的于分析之前的 長期保存。抗聚集劑可以以足以防止細(xì)胞在溶液中聚集的量存在。可以使用在醇 保存溶液中有效的任何合適的抗聚集劑，可以是例如螯合劑，該螯合劑選 自例如乙二胺四乙酸(EDTA)及其鹽如二鈉鹽、三鉀鹽和四鈉鹽。認(rèn)為可用 作抗聚集劑的其它活性劑包括cuminin、肝素、鏈激酶以及存在于溶解或抗凝劑組合物中的活性劑。可以使用能在使用期間將保存溶液維持在所期望的pH的任何緩沖劑。 緩沖劑的實(shí)例包括PBS、 Tris、乙酸鈉和枸櫞酸。EDTA及其鹽也可以用作 緩沖劑。優(yōu)選在保存期間將溶液pH維持在約4至約7之間的緩沖劑。因此， 優(yōu)選的緩沖劑是乙酸鹽緩沖劑如乙酸鈉、乙酸鎂、乙酸鈣和它們的組合。 雖然在本發(fā)明的溶液中也可以使用其它緩沖劑如磷酸鹽或Tris緩沖劑，但 是認(rèn)為這些緩沖劑對(duì)在期望的pH處的有效緩沖范圍不如乙酸鹽廣泛。所使用的緩沖劑特別是長期儲(chǔ)存所使用的緩沖劑優(yōu)選具有大的緩沖范 圍以調(diào)節(jié)因懸浮于溶液中的樣品細(xì)胞的自溶副產(chǎn)物所導(dǎo)致的任何pH變化。 例如，頸細(xì)胞老化時(shí)它們釋放改變懸浮溶液的pH平衡的自溶副產(chǎn)物。此外， 保存不同的細(xì)胞類型可能需要不同酸度和不同pH范圍的溶液。因此，具有寬的緩沖范圍的溶液可以用于多種細(xì)胞類型。在一個(gè)實(shí)施方案中，該保存溶液含有甲醇、作為酸的EDTA和乙酸鈉。 在該實(shí)施方案中，該溶液含有占約45-55%的甲醇、占約2-4X的EDTA和 占約6-8%的乙酸鈉緩沖劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該保存溶液含有甲醇、EDTA鈉鹽和鉀鹽的組 合和乙酸鹽緩沖劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該溶液含有甲醇、乙酸鎂、乙 酸鈣、氯化鉀和氯化鈉，其中醇占溶液的約20%，氯化鈉占約0.1%，氯化 鉀為10mM，乙酸鈣為2mM且乙酸鎂為lmM。該保存溶液適用于在約4X:至約8'C的環(huán)境溫度下保存懸浮的細(xì)胞至少 約三周。在這期間，細(xì)胞保留足以染色的結(jié)構(gòu)而沒有完整性的顯著丟失。 該溶液可以增強(qiáng)細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)的維持，因?yàn)樗芫S持細(xì)胞膜使之足以進(jìn)行 后續(xù)的細(xì)胞學(xué)染色。該溶液還可以破壞樣品中的微生物病原體和抑制逆轉(zhuǎn) 錄病毒的活性。該溶液可以除去樣品中不期望的成分如蛋白質(zhì)。該持續(xù)期間可以被該溶液在環(huán)境細(xì)胞懸浮之前的儲(chǔ)存時(shí)間、細(xì)胞取樣 與細(xì)胞懸浮之間的時(shí)間和含醇量所改變。例如，如果該溶液已儲(chǔ)存了相當(dāng) 長的一段時(shí)間，無論是冷藏狀態(tài)還是室溫狀態(tài)，那么該溶液剩下的保存細(xì) 胞生存力都可能是有限的。除了保存細(xì)胞之外，該溶液還可以殺死選擇的病原體。例如，該溶液 有效地殺死測(cè)試樣品中的下列微生物白色念珠菌、黑曲霉0^p^g說^w/ger)、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。在溶液中可以使用洗滌劑。該洗滌劑可以是非離子的、陽離子的、陰 離子的或兩性離子的。也可以使用洗滌劑的混合物。洗滌劑種類的實(shí)例包 括醇醚硫酸鹽、醇硫酸鹽、垸醇酰胺、垸基磺酸鹽、胺氧化物、兩性洗滌 劑、陰離子洗滌劑、甜菜堿衍生物、陽離子洗滌劑、二磺酸鹽、十二烷基 苯磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水 溶物、月桂基硫酸鹽、單酸甘油酯和甘油二酯、非離子洗滌劑、磷酸酯、 季銨鹽洗漆劑和脫水山梨糖醇衍生物。試劑盒本發(fā)明還提供可含有用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑的試劑盒。在一個(gè)實(shí) 施方案中，試劑盒含有醇保存溶液和存在于溶液中時(shí)適于與樣品中的中心 體目標(biāo)結(jié)合的可檢測(cè)的傳感器。該傳感器可以與標(biāo)記綴合，標(biāo)記可以是包 括熒光團(tuán)在內(nèi)的發(fā)色團(tuán)。試劑盒的組分可通過包裝物(housing)來保存。使用試劑盒實(shí)施本發(fā)明 方法的說明書也可以與試劑盒一同提供，它可以以任何固定媒介形式提供。 該說明書可以在包裝物之內(nèi)或之外，可以印刷于使該說明書清楚易讀的形 成該包裝物的任一表面的內(nèi)面或外面上。該試劑盒可以是多重的形式，含 有多種可以與樣品中的相應(yīng)的不同目標(biāo)結(jié)合的一種或多種不同傳感器。實(shí)施例闡述以下的實(shí)施例是為了向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和使用 本發(fā)明的完整實(shí)施方式，而無意限制本發(fā)明的范圍。雖然努力確保所使用 數(shù)字的準(zhǔn)確性(例如量、溫度等)，但是應(yīng)考慮存在一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。若 非另外說明，部分是以重量計(jì)部分，溫度是攝氏度，壓力是或者接近于大 氣壓，所有的材料均可商購獲得。實(shí)施例1將50 pi體積的PNA混合入含有一定體積的細(xì)胞PreservCyt (Cytyc Corp.)的ThinPrep小瓶(Cytyc Corp.)或微離心管中，雜交事件在溶液中使用55'C的水浴進(jìn)行?；蛘?，雜交事件在室溫下進(jìn)行過夜。雜交后，將標(biāo)本以 12000rpm離心5分鐘，使細(xì)胞沉淀然后重懸于一定體積的洗滌緩沖液中。 通過將樣品置于55"C水浴中30分鐘來洗滌細(xì)胞。洗滌后，將樣品再次以如 上所述的方法離心，再次重懸于一定體積的新洗滌緩沖液中，然后轉(zhuǎn)移至 載玻片上。將載玻片風(fēng)干，蓋上蓋玻片并觀察是否陽性(多個(gè)視野中存在一 簇一簇的綠色熒光生物體)?；蛘撸部梢酝ㄟ^在T2處理器上處理標(biāo)本來 洗滌標(biāo)本，制備載玻片(T2操作的細(xì)胞收集處理期間除去未結(jié)合的探針)。 這里制備的載玻片被T2處理器釋放至含有l(wèi)x洗滌緩沖液(AdvanDx)的收集 小瓶中，然后在55t的緩沖液中溫育30分鐘。實(shí)施例2建立了通過FISH (熒光原位雜交)使用PNA技術(shù)檢測(cè)PreservCyt溶液 中的微生物的方法。這些研究中使用的PNA探針來自于AdvanDx， Inc。 AdvanDx, Inc.經(jīng) Boston Probes, Inc.許可生產(chǎn)檢測(cè)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的PNA試劑 盒。期望用途是檢測(cè)從血液培養(yǎng)物制備的涂片中的白色念珠菌和黃色葡萄 球菌(僅供研究使用)。在PreservCyt中的溶液內(nèi)雜交步驟1. 將50 pi PNA探針加入500 |il PreservCyt標(biāo)本*中，渦旋混合。置于 55'C水浴中(90 min或過夜)雜交。2. 在T2處理器上處理標(biāo)本以將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至ThinPrep載玻片上。制備 好細(xì)胞點(diǎn)后，儀器會(huì)把載玻片釋放入含有l(wèi)x洗滌緩沖液(AdvanDx)的收集 小瓶中。3. 將載玻片(浸沒在lx洗滌緩沖液中)在55'C水浴中溫育30分鐘。4. 取出載玻片，風(fēng)干。固定，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。通 過多個(gè)視野中存在一簇一簇的綠色熒光生物體來確定陽性。*該方法主要是使用加入了白色念珠菌或金黃色葡萄球菌的細(xì)胞 PreservCyt來實(shí)施。但是，使用長達(dá)四年的白色念珠菌陽性ThinPrep標(biāo)本(載 玻片基)也已經(jīng)證實(shí)了該測(cè)定法的性能。常規(guī)方法(AdvanDx試劑盒插入頁中所描述)1. 將一滴固定溶液(AdvanDx)置于顯微鏡載玻片(AdvanDx)上，然后加 一滴血液培養(yǎng)物標(biāo)本并混合。2. 通過將涂片在55-80"C下加熱20分鐘以固定。3. 將載玻片浸入80%或96%乙醇中5-10分鐘，風(fēng)干。4. 將一滴PNA探針加至固定的涂片上，蓋上蓋玻片，在55。C下溫育 卯分鐘雜交。5. 將載玻片置于55'C下預(yù)熱的lx洗滌溶液中，移去蓋玻片。在55'C 的洗滌溶液中溫育30分鐘。取出載玻片，風(fēng)干。固定，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。通過 多個(gè)視野中存在一簇一簇的綠色熒光生物體來確定陽性。結(jié)論在PreservCyt中進(jìn)行溶液內(nèi)雜交證實(shí)了用ThinPrep⑧小瓶進(jìn)行輔助分 子測(cè)試的技術(shù)。這表明含有PNA探針的ThinPrep標(biāo)本可以在FISH后在 ThinPrep 2000處理器上進(jìn)行處理，而不損害目標(biāo)進(jìn)行PNA雜交事件。細(xì)胞 和目標(biāo)生物體都被轉(zhuǎn)移至載玻片上，形成比常規(guī)涂片法更容易解析的單層 細(xì)胞。另外，ThinPrep處理器使從樣品中除去未結(jié)合的PNA容易，使得制 備的載玻片具有較低的背景噪音。在ThinPrep小瓶中進(jìn)行雜交和在 ThinPrep處理器上制備載玻片在使輔助分子測(cè)試的過程流線化的同時(shí)通過 減少步驟而使FISH方法簡化。
權(quán)利要求
1.測(cè)定方法，其包括提供懷疑含有目標(biāo)的樣品；提供能夠在不含甲酰胺的醇保存溶液中與所述目標(biāo)結(jié)合的傳感器，所述傳感器與發(fā)色團(tuán)綴合；在如果所述目標(biāo)存在的話所述傳感器能夠與所述目標(biāo)結(jié)合的條件下，使所述樣品在所述不含甲酰胺的醇保存溶液中與所述傳感器接觸；向所述溶液施加能夠激發(fā)所述發(fā)色團(tuán)的光源；和檢測(cè)光是否從所述目標(biāo)發(fā)射出。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品選自血液；尿；精液；乳汁；痰； 粘液；胸腔液；盆腔液；滑膜液；腹水；體腔灌洗液；眼刷物；皮膚刮下 物；口腔拭物；陰道拭物；巴氏涂片物；直腸拭物；吸出物；穿刺活組織 檢查物；組織切片；血漿；血清；脊髓液；淋巴液；皮膚、呼吸道、腸道 或泌尿生殖道的外分泌物；淚液；唾液；腫瘤；器官；微生物培養(yǎng)物；和 體外細(xì)胞培養(yǎng)物成分。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述傳感器包括適體。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述傳感器包括多核苷酸。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述傳感器包括肽核酸。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述傳感器包括鎖定核酸。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中使所述樣品與多個(gè)不同的傳感器接觸，所 述多個(gè)中每一個(gè)均包括相應(yīng)的不同可檢測(cè)標(biāo)記，其中所述多個(gè)中每一個(gè)均 能夠選擇性地與相應(yīng)的不同目標(biāo)結(jié)合。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)色團(tuán)是熒光團(tuán)。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述熒光團(tuán)選自半導(dǎo)體納米晶體、熒光染 料和鑭系元素螯合物。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述熒光團(tuán)是半導(dǎo)體納米晶體。
11. 權(quán)利要求9的方法，其中所述熒光團(tuán)是熒光染料。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述熒光染料是熒光素。
13. 權(quán)利要求9的方法，其中所述熒光團(tuán)是鑭系元素螯合物。
14. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)是DNA。
15. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)是RNA。
16. 權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品是細(xì)胞部分。
17. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)是中心體。
18. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)是病理生物體。
19. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)是病毒。
20. 權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將從所述檢測(cè)得到的結(jié)果與從 對(duì)照樣品得到的結(jié)果相比較。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述對(duì)照樣品是陽性對(duì)照。
22. 權(quán)利要求20的方法，其中所述對(duì)照樣品是陰性對(duì)照。
23. 權(quán)利要求l的方法，其進(jìn)一步包括在所述檢測(cè)之前洗滌所述樣品。
24. 權(quán)利要求l的方法，其中所述方法為自動(dòng)化的。
25. 權(quán)利要求1的方法，其中所述方法手動(dòng)完成。
26. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)是細(xì)菌或其成分或產(chǎn)物。
27. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標(biāo)是酵母或其成分或產(chǎn)物。
28. 識(shí)別與期望的目標(biāo)特異性結(jié)合的傳感器的方法，其包括使懷疑 含有感興趣目標(biāo)的樣品與可檢測(cè)的傳感器接觸，其中所述接觸在保存溶液 中進(jìn)行，所述保存溶液含有一定量的一種或多種有效地防止這種溶液被至 少一種污染物污染的水溶性醇且不含甲酰胺；和檢測(cè)所述傳感器是否已經(jīng) 與所述目標(biāo)結(jié)合。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述方法對(duì)多種候選傳感器進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)定方法，其包括提供懷疑含有目標(biāo)的樣品；提供能夠在不含甲酰胺的醇保存溶液中與所述目標(biāo)結(jié)合的傳感器，所述傳感器與發(fā)色團(tuán)綴合；在如果所述目標(biāo)存在的話所述傳感器能夠與所述目標(biāo)結(jié)合的條件下，使所述樣品在所述不含甲酰胺的醇保存溶液中與所述傳感器接觸；向所述溶液施加能夠激發(fā)所述發(fā)色團(tuán)的光源；和檢測(cè)光是否從所述目標(biāo)發(fā)射出。本發(fā)明還涉及識(shí)別與期望的目標(biāo)特異性結(jié)合的傳感器的方法，其包括使懷疑含有感興趣目標(biāo)的樣品與可檢測(cè)的傳感器接觸，其中所述接觸在保存溶液中進(jìn)行，所述保存溶液含有一定量的一種或多種有效地防止這種溶液被至少一種污染物污染的水溶性醇且不含甲酰胺；和檢測(cè)所述傳感器是否已經(jīng)與所述目標(biāo)結(jié)合。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101329275SQ20081013150
公開日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月11日
發(fā)明者埃林·科夫曼, 布萊恩·B·蘭特里奇亞, 詹姆斯·林德, 邁克爾·科恩福特 申請(qǐng)人:Cytyc公司