專利名稱：：糧食作物深加工制品高通量五重巢式pcr轉(zhuǎn)基因檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是一種用于主要糧食作物深加工產(chǎn)品高通量轉(zhuǎn)基因檢測方法.(二)技術(shù)背景隨著各國有關(guān)轉(zhuǎn)基因生物(geneticallymodifiedorganism,GMO)標簽法的建立和不斷完善，轉(zhuǎn)基因成分的準確檢測也顯得日趨重要，很多國家不但要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行定性檢測，還需要對產(chǎn)品中的GMO含量進行定量檢測，以便標識。歐盟等國家和地區(qū)先后出臺轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標簽制度，出入境產(chǎn)品必須出具是否含有轉(zhuǎn)基因成分的檢測報告。近年來，我國大量進口轉(zhuǎn)基因大豆用于加工，由于市場標識不夠,使我國加工產(chǎn)品出口貿(mào)易遭受損失。為了加強對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，保障人體健康，規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的銷售行為，引導(dǎo)和保護消費者的知情權(quán)，農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，該辦法規(guī)定了在中國境內(nèi)需要標識的第一批轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，即大豆、玉米、油菜、棉花和番茄等5類17種產(chǎn)品。目前國內(nèi)的相關(guān)標準較為混亂，出現(xiàn)了一些技術(shù)標準不一致、法規(guī)滯后、與國際慣例不接軌等現(xiàn)象，致使某些產(chǎn)品實行國際、國內(nèi)市場"雙重標準"，沒有依照中國有關(guān)轉(zhuǎn)基因食品的規(guī)定貼上相關(guān)標識，侵害了中國消費者的利益。大豆、玉米和水稻深加工制品己越來越多，如卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆油、玉米油、玉米蛋白質(zhì)粉、玉米淀粉、麥片等食品，其加工呈現(xiàn)復(fù)雜化和多元化的特點，在國內(nèi)外仍然沒有適合的標準依據(jù)進行檢測。"樂之事件"以及"雀巢食品含轉(zhuǎn)基因"事件都表明，我國在轉(zhuǎn)基因市場的管理上確實存在漏洞，對轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)督力度不足，造成了企業(yè)有法律空子可鉆。要完善、健全我國的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理制度，首要問題是要解決我國尚未統(tǒng)一的檢測標準問題，同時要提高轉(zhuǎn)基因檢測的精確度，以保證我國消費者的利益。目前，歐盟率先倡導(dǎo)并實行轉(zhuǎn)基因標識并要求產(chǎn)品成分中轉(zhuǎn)基因含量大于1%時必須進行標識，因此其檢測技術(shù)早己經(jīng)成熟，檢測下限達0.1%。國內(nèi)一些機構(gòu)，尤其進出口檢疫局也相繼建立檢測實驗室，技術(shù)趨于成熟，但還只限于對轉(zhuǎn)基因原料的檢測，在深加工產(chǎn)品的檢測技術(shù)的研究上還很不成熟，沒有統(tǒng)一的檢測標準，檢測結(jié)果不穩(wěn)定。深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因檢測所需的DNA提取技術(shù)在國外尚處于研究階段，并沒有形成系列化技術(shù)，商品化的提取試劑盒種類單一。由于深加工產(chǎn)品種類繁多，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而深加工品DNA提取技術(shù)應(yīng)該是一系列技術(shù)，提取試劑盒也應(yīng)該是多樣化，不同產(chǎn)品采用不同試劑盒，缺乏針對不同深加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的DNA提取技術(shù)。因此，急需建立了一整套簡便、精確、快捷、成熟、可信度高的轉(zhuǎn)基因糧食作物深加工制品檢測技術(shù)體系，為我國糧食作物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標準化提供技術(shù)平臺，為GMO標簽制度進一步發(fā)展提供技術(shù)保證。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種有效地防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，而且可以提高檢測效率、縮短檢測周期，具有高效、快速、低成本、高靈敏度的糧食作物深加工制品高通量五重巢式PCR轉(zhuǎn)基因檢測方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的檢測方法的檢測過程為材料陽性標準品轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；陰性標準品非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；待檢樣品深加工產(chǎn)品大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、營養(yǎng)麥片、玉米泥；試劑WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒；r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10xPCR緩沖液(含MgCl2)和DLDNA2000分子質(zhì)量標準。(1)DNA提取(1.1)DNA提取將大豆、玉米、水稻標準品粉末及其它待檢樣品根據(jù)Wizard艮MagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒操作說明分別進行DNA提取。(1.2)DNA樣品濃度檢測DNA濃度通過核酸蛋白分析儀和電泳-EB染色的熒光強度雙重測定。(2)引物設(shè)計利用PrimerPremierV5.0軟件進行五重巢式PCR的引物設(shè)計，用OligoV6.22軟件篩選出引物之間互相干擾最小的引物。引物所擴增目的片段及擴增產(chǎn)物大小如下表。表1多重巢式PCR所用引物序列及擴增片段大小Tab.ListofprimersinmultiplenestedPCR<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR引物AATCTTCTACTGGTACATGGATheprimerofthefirstRbclWFRbclWRCTCATCATCTTTGGTAAAATCARBCL433multipleAGPCRGGACAACAACCCAAACATCACryWFCryWRACTTGGTACAGGTTGCTCAGGCCCTCCrylA(B)322BarWFBarWRGTCTGCACCATCGTCAACCACTCGGCCGTCCAGTCGTABAR201PatWFPatWRAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCGCAACCAACCAAGGGTATCPAT160AATCTTCTACTGGTACATGGARbclNFRbclNRCGACCGTACTTGTTCAACTTATRBCL321第一輪多CC重PCR引物CP4NFCP4NRGGCGACGCCTCGCTCACAAGCGTCATGATCGGCTCGATGCP4-EPSPS240TheprimeroftheBarNFBarNRACAAGCACGGTCAACTTCCACTCGGCCGTCCAGTCGTABARH5secondmultipleCryNFCryNRGGACAACAACCCAAACATCAACCrylA(B)152PCRGCACGAACTCGCTGAGCAGPatNFPatNRAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCACTCTTGTGGTGTTTGTGGCPAT100(3)五重巢式PCR反應(yīng)體系(3.1)第一輪五重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件在第一輪五重PCR反應(yīng)體系中，加DNA模板(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2xPCR緩沖液，引物混合液I10pL，DNA聚合酶4U，補水至50nL。擴增條件為95'C預(yù)變性10min，IO個循環(huán)(95°C，30sec;65°C，60s;72°C，60s);IO個循環(huán)(95。C，30sec;62°C，60s;72°C，60s);IO個循環(huán)(95°C，30sec;60°C，60s;72°C，60s);10個循環(huán)(95°C，30sec;58°C，60s;72°C，60s);最后72。C延伸lOmin。(3.2)第二輪五重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件取第一輪五重PCR產(chǎn)物lpL作為模板，進行五重巢式PCR第二輪擴增。反應(yīng)體系加引物混合液ni0^iL，DNA聚合酶3U，其余同前。擴增條件同第一輪反應(yīng)條件。(4)擴增產(chǎn)物檢測兩輪擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測。瓊脂糖膠濃度為3%，膠中溴化乙錠濃度為0.5^g/mL，電泳緩沖液為lxTAE，DL-2000DNA做分子質(zhì)量標準，電泳條件為以100V/cm電壓，電泳30min。(5)結(jié)果判定(5.1)對照樣品結(jié)果分析陽性對照PCR反應(yīng)中，RBCL內(nèi)標準基因和外源基因均得到了擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而陰性對照中僅擴增出RBCL基因片段，空白對照中沒有任何擴增片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作，否則重新檢測。(5.2)試樣檢測結(jié)果分析a)RBCL內(nèi)標準基因和外源基因均得到了擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明試樣中檢測該外源基因，該樣品中含有轉(zhuǎn)該外源基因成分。b)RBCL內(nèi)標準基因片段得到擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而外源基因未得到擴增，或擴增片段大小與預(yù)期片段大小不一致，表明試樣中未檢測出CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因，該樣品不含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因成分。本發(fā)明方法的有益效果在于多重巢式PCR是近幾年興起的檢測技術(shù)，它結(jié)合了巢式PCR的靈敏度高和多重PCR的操作簡單、特異性高的特點，這兩種方法的結(jié)合不但可以減少假陽性的出現(xiàn)，可以同時檢測多個目的片段，而且可以使檢測的下限下降幾個數(shù)量級。多重巢式PCR的檢測，提高了檢測效率、減少了檢測時間和檢測成本，并可以有效減少假陽性的結(jié)果，因此，可以應(yīng)用于對大豆、玉米和水稻的轉(zhuǎn)基因深加工食品進行DNA檢測，具有實際意義。本發(fā)明檢測方法的靈敏度為0.005%，即多重巢式PCR檢測體系可檢出轉(zhuǎn)CP4基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因的量達0.005%以上的樣品。此檢測體系靈敏度高于Zimmermann等人用巢式PCR方法對轉(zhuǎn)基因玉米進行檢測所得靈敏度(0.01%);而與Forte等靈敏度0.5%)，Germini等(靈敏度0.25%)，Delano等(靈敏度0.1%)應(yīng)用多重PCR進行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測相比，本實驗所用檢測技術(shù)的靈敏度遠遠高于多重PCR。0.005%的靈敏度已經(jīng)達到國際領(lǐng)先水平，可以完全滿足大豆、玉米和水稻深加工產(chǎn)品的檢測需要。另外，本發(fā)明方法對同一目的基因在不同品種和不同品系中的序列進行分析，在保守區(qū)域設(shè)計多對引物，篩選出了可以在不同品種和不同品系中通用的引物進行檢測，大大提高了檢測通量，提高了檢測效率。此外，本發(fā)明方法選用了大豆、玉米和水稻中通用的內(nèi)參照基因RBCL基因作為內(nèi)源參照基因進行轉(zhuǎn)基因檢測，克服現(xiàn)行的"一種植物一種檢測內(nèi)對照"的弊病，不但可有效地防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，而且還可以提高檢測效率、縮短檢測周期。綜上所述，本發(fā)明方法具有高效、快速、低成本、高靈敏度等優(yōu)點，為轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)提供了一個有效的檢測方法，具有重要的實用價值。本檢測方法有很高的經(jīng)濟價值采用本發(fā)明方法進行深加工制品的轉(zhuǎn)基因檢測，通過2次PCR反應(yīng)即可檢測出樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米BTll、BT176、Mon810、轉(zhuǎn)BT基因水稻和轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因大豆，而用傳統(tǒng)的檢測方法需要8次PCR反應(yīng)才能完成，成本降低4倍。另外，該方法將為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的進出口貿(mào)易提供有利的技術(shù)支撐，一方面，可以合理利用目前許多國家使用的，以轉(zhuǎn)基因安全設(shè)置的貿(mào)易技術(shù)壁壘，保護我國的農(nóng)產(chǎn)品市場；另一方面，也可以保障我國的農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易可以根據(jù)不同國家對轉(zhuǎn)基因標識管理的要求，為企業(yè)提供準確有效的檢測參數(shù)，促進農(nóng)產(chǎn)品和食品的國際貿(mào)易。為此，可以產(chǎn)生數(shù)億元的經(jīng)濟效益；此外，該方法還可以直接為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持，可以在農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研究階段、生產(chǎn)應(yīng)用和監(jiān)測中得到廣泛的應(yīng)用。農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全研究、生產(chǎn)和商業(yè)化后的監(jiān)測是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全生產(chǎn)和管理的重要保證，是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物可持續(xù)發(fā)展不可缺少的。該技術(shù)成果對保證轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)、銷售、加工在有序的管理要求下進行，其將為人民健康、環(huán)境安全和生物多樣性產(chǎn)生重要的影響。(四)圖1-圖2為待測樣品多重巢式PCR檢測示意圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明1、實驗材料(1)陽性標準品轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；陰性標準品非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；待檢樣品深加工產(chǎn)品大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、營養(yǎng)麥片、玉米泥；(2)試劑WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒；r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10xPCR緩沖液(含MgC12)和DL-2000分子質(zhì)量標準。2、主要儀器設(shè)備高速離心機(上海安亭，TDL-40B)、PCR儀(德國Biometra，BiometraTgradient)、核酸電泳儀(杭州大合，GE-IOO)、紫外分光光度儀(美國BECKMAN，DU640)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP，G8000)。3、樣品檢測(1)樣品DNA提取將大豆、玉米、水稻標準品粉末及其它待檢樣品根據(jù)WizardMagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒操作說明分別進行DNA提取，通過核酸蛋白分析儀和電泳-EB染色的熒光強度雙重測定樣品DNA濃度。(2)五重巢式PCR反應(yīng)在第一輪五重PCR反應(yīng)體系中，加樣品DNA模板1^L(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2xPCR緩沖液，引物混合液I10pL，DNA聚合酶4U，補水至50pL。擴增條件為95'C預(yù)變性10min，IO個循環(huán)(95°C，30sec;65°C，60s;72°C，60s);IO個循環(huán)(95°C，30sec;62°C，60s;72°C，60s);IO個循環(huán)(95°C，30sec;60。C，60s;72。C，60s);IO個循環(huán)(95。C，30sec;58°C，60s;72°C，60s);最后72。C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取第一輪五重PCR產(chǎn)物lpL作為模板，進行五重巢式PCR第二輪擴增。反應(yīng)體系加引物混合液IIl(HiL，DNA聚合酶3U，其余同前。擴增條件同第一輪反應(yīng)條件。(3)擴增產(chǎn)物檢測兩輪擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測。瓊脂糖膠濃度為3%，膠中溴化乙錠濃度為0.5pg/mL，電泳緩沖液為lxTAE，DL-2000DNA做分子質(zhì)量標準，電泳條件為以100V/cm電壓，電泳30min。結(jié)果如圖顯示，陰性對照中僅擴增出RBCL基因，陽性對照的CP4-EPSPS基因、RBCL基因、CrylA(B)基因、BAR基因和PAT基因擴增片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。陰性對照結(jié)果表明實驗過程中無假陽性結(jié)果，排除轉(zhuǎn)基因成分污染的可能；陽性對照結(jié)果說明擴增體系正常，可以擴增出目的基因；空白對照無擴增條帶說明PCR反應(yīng)體系無污染。樣品卵磷脂、大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉擴增出RBCL基因和CP4-EPSPS基因片段，即以上4種樣品含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因成分；大豆精煉油大豆色拉油和玉米油未檢出任何條帶，即未從這3種樣品中提取出DNA;玉米淀粉和玉米泥擴增出RBCL基因、CrylA(B)基因和PAT基因片段，即以上兩種樣品含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因和PAT基因成分；玉米蛋白粉擴增出RBCL基因、CrylA(B)基因和BAR基因片段，即含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因和BAR基因成分；營養(yǎng)麥片擴增出RBCL基因和CrylA(B)基因片段，即含有轉(zhuǎn)CrylA(B)基因成分。結(jié)合圖1-圖2，圖1為第一輪擴增結(jié)果的電泳圖，圖2為第二輪擴增結(jié)果的電泳圖，其中A，第一輪PCR擴增；B，第二輪PCR擴增；M，DL-2000分子質(zhì)量標準；1，空白對照；2，陰性對照；3，陽性對照；4，卵磷脂；5，大豆蛋白質(zhì)粉；6，巧克力飲品；7，嬰兒米粉;8，大豆精煉油；9，大豆色拉油；10，玉米油；11，玉米淀粉；12，玉米蛋白粉；13，營養(yǎng)麥片；14，玉米泥。4、結(jié)果判定(1)對照樣品結(jié)果分析陽性對照PCR反應(yīng)中，RBCL內(nèi)標準基因和外源基因均得到了擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而陰性對照中僅擴增出RBCL基因片段，空白對照中沒有任何擴增片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作，否則重新檢測。(2)試樣檢測結(jié)果分析a)RBCL內(nèi)標準基因和外源基因均得到了擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明試樣中檢測該外源基因，該樣品中含有轉(zhuǎn)該外源基因成分。b)RBCL內(nèi)標準基因片段得到擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而外源基因未得到擴增，或擴增片段大小與預(yù)期片段大小不一致，表明試樣中未檢測出CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因，該樣品不含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS、CrylA(B)、PAT和BAR基因成分。權(quán)利要求1.一種糧食作物深加工制品高通量五重巢式PCR轉(zhuǎn)基因檢測方法，其特征在于其檢測方法為材料陽性標準品轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；陰性標準品非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻；待檢樣品深加工產(chǎn)品大豆蛋白質(zhì)粉、巧克力飲品、嬰兒米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、營養(yǎng)麥片、玉米泥；試劑id="icf0001"file="A2008101374610002C1.tif"wi="13"he="3"top="82"left="42"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>MagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒，r-TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCR緩沖液(含MgCl2)和DLDNA2000分子質(zhì)量標準；(1)DNA提取(1.1)DNA提取將大豆、玉米、水稻標準品粉末及其它待檢樣品根據(jù)id="icf0002"file="A2008101374610002C2.tif"wi="13"he="3"top="113"left="124"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>MagneticDNAPurificationSystemforFood試劑盒操作說明分別進行DNA提取；(1.2)DNA樣品濃度檢測DNA濃度通過核酸蛋白分析儀和電泳-EB染色的熒光強度雙重測定；(2)引物設(shè)計利用PrimerPremierV5.0軟件進行五重巢式PCR的引物設(shè)計，用OligoV6.22軟件篩選出引物之間互相干擾最小的引物，引物所擴增目的片段及擴增產(chǎn)物大小如下表表多重巢式PCR所用引物序列及擴增片段大小<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables><tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>(3)五重巢式PCR反應(yīng)體系(3.1)第一輪五重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件在第一輪五重PCR反應(yīng)體系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR緩沖液，引物混合液I10μL，DNA聚合酶4U，補水至50μL，擴增條件為95℃預(yù)變性10min，10個循環(huán)(95℃，30sec；65℃，60s；72℃，60s)；10個循環(huán)(95℃，30sec；62℃，60s；72℃，60s)；10個循環(huán)(95℃，30sec；60℃，60s；72℃，60s)；10個循環(huán)(95℃，30sec；58℃，60s；72℃，60s)；最后72℃延伸10min；(3.2)第二輪五重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件取第一輪五重PCR產(chǎn)物1μL作為模板，進行五重巢式PCR第二輪擴增，反應(yīng)體系加引物混合液II10μL，DNA聚合酶3U，其余同前。擴增條件同第一輪反應(yīng)條件；(4)擴增產(chǎn)物檢測兩輪擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測，瓊脂糖膠濃度為3％，膠中溴化乙錠濃度為0.5μg/mL，電泳緩沖液為1×TAE，DL-2000DNA做分子質(zhì)量標準，電泳條件為以100V/cm電壓，電泳30min；(5)結(jié)果判定(5.1)對照樣品結(jié)果分析陽性對照PCR反應(yīng)中，RBCL內(nèi)標準基因和外源基因均得到了擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而陰性對照中僅擴增出RBCL基因片段，空白對照中沒有任何擴增片段，表明PCR反應(yīng)體系正常工作，否則重新檢測；(5.2)試樣檢測結(jié)果分析a)RBCL內(nèi)標準基因和外源基因均得到了擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，表明試樣中檢測該外源基因，該樣品中含有轉(zhuǎn)該外源基因成分；b)RBCL內(nèi)標準基因片段得到擴增，且擴增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而外源基因未得到擴增，或擴增片段大小與預(yù)期片段大小不一致，表明試樣中未檢測出CP4-EPSPS、Cry1A(B)、PAT和BAR基因，該樣品不含有轉(zhuǎn)CP4-EPSPS、Cry1A(B)、PAT和BAR基因成分。全文摘要本發(fā)明公開一種糧食作物深加工制品五重巢式PCR轉(zhuǎn)基因檢測方法，其檢測方法為1.DNA提取和濃度檢測；2.引物設(shè)計；3.第一、二輪五重巢式PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件；4.擴增產(chǎn)物檢測；5.結(jié)果判定。本發(fā)明技術(shù)具有高通量、快捷、準確、靈敏、經(jīng)濟的諸多優(yōu)點，不僅可以用來檢測轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和水稻的單一深加工制品，還可以檢測轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和水稻的混合深加工制品。本發(fā)明提高了檢測效率、減少了檢測時間和檢測成本，并可以有效減少假陽性的結(jié)果，因此，可以應(yīng)用于對主要糧食作物如大豆、玉米和水稻豆油等轉(zhuǎn)基因深加工食品進行DNA檢測，具有實際意義。文檔編號C12Q1/68GK101402996SQ20081013746公開日2009年4月8日申請日期2008年11月6日優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日發(fā)明者仇有文,營劉,敖金霞,波曲,李慶章,袁肖寒,高學軍申請人:東北農(nóng)業(yè)大學