專利名稱：嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氫菌的分離方法。
技術背景纖維素是自然界中儲量最豐富的天然物質，具有品種多，再生時間短等優(yōu)點。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的生物質資源高達1.55x109 噸，其中只有很少部分被用作牲畜飼料和農(nóng)村家用燃料外，而剩下的約89% 尚未被利用或未被合理利用——絕大多數(shù)作為環(huán)境污染物被廢棄而長期滯留 在環(huán)境中或者被焚燒，不僅造成環(huán)境污染更加的導致了生物質資源的巨大浪 費。氫能是一種無污染、可再生及能量密度高的能源，被公認為是最有吸引力 的替代能源。目前應用纖維素產(chǎn)氫菌的方法中比較普遍和成功為纖維素濾紙球 磨漿法，但是此方法在分離過程中存在結晶度低、較難降解及培養(yǎng)出的產(chǎn)氫菌 產(chǎn)氫率低的問題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有產(chǎn)氫菌的培養(yǎng)方法存在結晶度低、較難降解及 培養(yǎng)出的產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫率低的問題。而提供嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法。嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法按以下步驟實現(xiàn) 一、將4.0 6.0g采 集樣品放入裝有數(shù)顆玻璃球的250mL滅菌血清瓶中，然后加入80 120mL滅 菌水，通入氮氣后封口，而后以100 200r/min的振速振蕩4 6h，得菌懸液 A; 二、取4 6mL菌懸液A轉入裝有l(wèi)OOmL纖維素粉固體培養(yǎng)基的250rnL 滅菌血清瓶中，然后在60士2。C的條件下恒溫培養(yǎng)5 7天，得富集后菌懸液； 三、取lmL富集后菌懸液然后用無菌厭氧水倍比稀釋，然后分別取104倍、 105倍和106倍的稀釋液lmL與融化的纖維素粉固體培養(yǎng)基混合均勻后進行滾 管，而后在60士2t:的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)；四、挑取透明圈 菌落放在纖維素粉液體培養(yǎng)基上，然后在80 90。C的條件下水浴處理8 12min，然后在60i2"C的條件下恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液混濁，得菌懸液B;五、取lmL菌懸液B然后用無菌厭氧水倍比稀釋，然后分別取104倍、105倍和106 倍的稀釋液lmL與融化的纖維素粉固體培養(yǎng)基混合均勻后進行滾管，而后在 60士2'C的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)，然后再挑取透明圈菌落放在纖 維素粉液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；六、重復步驟三到步驟五5次，即可分離出嗜熱厭 氧纖維素產(chǎn)氫菌。本發(fā)明采用纖維素粉滾管黏附法分離出嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌，在富集物 中將存在數(shù)量占優(yōu)勢但纖維素降解活性較弱的種群，利用不溶性纖維素粉更能 有效地分離得到纖維素酶活較強的菌株；纖維素粉(PHIOI Avicel)結晶度高， 與纖維素降解細菌的黏附作用較強且黏附維持時間較長，轉接過程二者不易脫 落；分離出來的產(chǎn)氫菌接入到纖維素粉液體培養(yǎng)基中容易降解且大大提高了產(chǎn) 氫率(產(chǎn)氫氣量為661.76 808.32mL/L，產(chǎn)氫率約為現(xiàn)有產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫率的6 8倍)。


圖1為具體實施方式
十五中分離的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌擴大一萬倍的 原子力電鏡照片；圖2為具體實施方式
十五中分離的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的 透射電鏡照片；圖3為具體實施方式
十五步驟三中透明圈變化圖。
具體實施方式
本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方 式間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法按以下步 驟實現(xiàn) 一、將4.0 6.0g采集樣品放入裝有數(shù)顆玻璃球的250mL滅菌血清瓶 中，然后加入80 120mL滅菌水，通入氮氣后封口，而后以100 200r/min 的振速振蕩4 6h，得菌懸液A; 二、取4 6mL菌懸液A轉入裝有l(wèi)OOmL 纖維素粉固體培養(yǎng)基的250mL滅菌血清瓶中，然后在60士2。C的條件下恒溫培 養(yǎng)5 7天，得富集后菌懸液；三、取lmL富集后菌懸液然后用無菌厭氧水倍 比稀釋，然后分別取104倍、10 5倍和106倍的稀釋液lmL與融化的纖維素粉 固體培養(yǎng)基混合均勻后進行滾管，而后在60士2。C的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有 透明圈出現(xiàn)；四、挑取透明圈菌落放在纖維素粉液體培養(yǎng)基上，然后在80 9(TC的條件下水浴處理8 12min，然后在60士2。C的條件下恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液混濁，得菌懸液B;五、取lmL菌懸液B然后用無菌厭氧水倍比稀釋，然后 分別取104倍、105倍和106倍的稀釋液lmL與融化的纖維素粉固體培養(yǎng)基混 合均勻后進行滾管，而后在60士2'C的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)， 然后再挑取透明圈菌落放在纖維素粉液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；六、重復步驟三到步 驟五5次，即可分離出嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌。本實施方式中所使用的纖維素粉為PH101 Avicd纖維素粉。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中采集樣品為固態(tài)溫泉底泥、固態(tài)秸稈堆肥物、多年朽木木屑或固態(tài)有機廢水厭氧 反應器活性污泥。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中氮氣的純度為99.99%。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟一中將5.0g采集樣品放入裝有數(shù)顆玻璃球的250mL滅菌血清瓶中，然后加入 100mL滅菌水。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中以 150r/min的振速振蕩5h。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中纖維素粉固體培養(yǎng)基由l.Og的氯化銨、2.0g的氯化鈉、1.5g的磷酸氫二鉀、3.5g 的磷酸二氫鉀、0.5g的半胱氨酸、0.2g的MgCl2'6H20、 0.2g的氯化鉀、2g 的酵母粉、2g的蛋白胨、lmL的微量金屬元素貯液、lmL的維生素]T:液、lmL 的濃度為0.196。(w/v)刃天青、10 g/L的纖維素粉、2%的瓊脂和1000mL的蒸 餾水組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六不同的是微量金屬元素 貯液由1.5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg的硼酸、O.lg的MnCl2.4H20、 2mg的CuCl2'2H20、 0.19g的CoCl2.6H20、 24mg的NiCl2.6H20、 36mg的 Na2M04'H20、 15mg的鎢酸鈉和15mg的Na2Se04'5H20溶于lOOOmL的蒸餾 水制成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
六相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
六不同的是維生素貯液由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、l.Omg的維生素Bu和 lOO.Omg的鹽酸吡哆醇溶于lOOOmL蒸餾水制成。其它步驟及參數(shù)與具體實施 方式六相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一或六不同的是步驟二中 取5mL菌懸液A轉入裝有100mL纖維素粉固體培養(yǎng)基的250mL滅菌血清瓶 中。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一或六相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中在 60士2'C的條件下恒溫培養(yǎng)6天。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟四中纖維素粉液體培養(yǎng)基由l.Og的氯化銨、2.0g的氯化鈉、1.5g的磷酸氫二鉀、3.5g 的磷酸二氫鉀、0.5g的半胱氨酸、0.2g的MgCl2'6H20、 0.2g的氯化鉀、2g 的酵母粉、2g的蛋白胨、lmL的微量金屬元素貯液、lmL的維生素貯液、 lmL的濃度為0.196。(w/v)刃天青、10g/L的纖維素粉和1000mL的蒸餾水組成。 其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十二本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟四中挑 取透明圈菌落放在纖維素粉液體培養(yǎng)基上，然后在85'C的條件下水浴處理 10min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
十一不同的是微量金屬 元素貯液由1.5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg的硼酸、0.1g的MnCl2.4H20、 2mg的CuCl2'2H20、 0.19g的CoCl2.6H20、 24mg的MC12'6H20、 36mg的 Na2M04'H20、 15mg的鎢酸鈉和15mg的Na2Se04'5H20溶于lOOOmL的蒸餾 水制成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十一相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
十一不同的是維生素C: 液由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg的鹽酸硫胺素、 50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、l.Omg的維生素B12 和lOO.Omg的鹽酸吡哆醇溶于lOOOmL蒸餾水制成。其它步驟及參數(shù)與具體實 施方式十一相同。
具體實施方式
十五本實施方式嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法按以下 步驟實現(xiàn) 一、將5.0g多年朽木木屑放入裝有數(shù)顆玻璃球的250mL滅菌血清瓶中，然后加入lOOmL滅菌水，通入純度為99.99%的氮氣后封口，而后以 150r/min的振速振蕩5h，得菌懸液A; 二、取5mL菌懸液A轉入裝有100mL 纖維素粉固體培養(yǎng)基的250mL滅菌血清瓶中，然后在60±2°C的條件下恒溫培 養(yǎng)5天，得富集后菌懸液；三、取lmL富集后菌懸液然后用無菌厭氧水倍比 稀釋，然后取106倍的稀釋液lmL與融化的纖維素粉固體培養(yǎng)基混合均勻后 進行滾管，而后在60土2"C的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)；四、挑取 透明圈菌落放在纖維素粉液體培養(yǎng)基上，然后在85'C的條件下水浴處理 10min，然后在60i2"C的條件下恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液混濁，得菌懸液B;五、取 lmL菌懸液B然后用無菌厭氧水倍比稀釋，然后取106倍的稀釋液lmL與融 化的纖維素粉固體培養(yǎng)基混合均勻后進行滾管，而后在60士2'C的條件下恒溫 培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)，然后再挑取透明圈菌落放在纖維素粉液體培養(yǎng)基上 培養(yǎng)；六、重復步驟三到步驟五5次，即可分離出嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌。本實施方式分離的嗜熱厭氧纖維素菌種通過原子力顯微鏡照片(圖1)和 透射電鏡照片(圖2)表述菌體形態(tài)。從圖1與圖2中可以很清楚的看出菌體 表面光滑、細胞呈桿狀、周生鞭毛、單個、成對排列、菌體大小為(0.3pm 0.4^im)x(3iam ^im)，有芽孢并革蘭氏染色呈陰性，此菌株的形態(tài)特征與高 溫厭氧芽孢桿菌屬(7T7^7Woawaew6a"en'ww)的熱解糖高溫厭氧芽孢桿菌 (772erwoawae/-o6<3cten'ww Aerwosacc/zara/^f/cww )相同。本實施方式步驟三中透明圈出現(xiàn)后，隨著時間的延長，透明圈變化如圖3 所示，從圖3中可以看出透明圈變大并逐漸清晰。本實施方式分離出的嗜熱厭氧纖維素菌種接入到纖維素粉液體培養(yǎng)基中， 在溫度為60土2。C、振速為130r/min的條件下振蕩培養(yǎng)2 3天后，用lmL無 菌注射器抽取發(fā)酵氣體，經(jīng)S C-II型氣相色譜儀檢測氣相得到發(fā)酵氣體中有氫 氣產(chǎn)生；產(chǎn)氫量為808.32mL/L，纖維素降解率為56.9%。
權利要求
1、嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在于嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法按以下步驟實現(xiàn)一、將4.0～6.0g采集樣品放入裝有數(shù)顆玻璃球的250mL滅菌血清瓶中，然后加入80～120mL滅菌水，通入氮氣后封口，而后以100～200r/min的振速振蕩4～6h，得菌懸液A；二、取4～6mL菌懸液A轉入裝有100mL纖維素粉固體培養(yǎng)基的250mL滅菌血清瓶中，然后在60±2℃的條件下恒溫培養(yǎng)5～7天，得富集后菌懸液；三、取1mL富集后菌懸液然后用無菌厭氧水倍比稀釋，然后分別取104倍、105倍和106倍的稀釋液1mL與融化的纖維素粉固體培養(yǎng)基混合均勻后進行滾管，而后在60±2℃的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)；四、挑取透明圈菌落放在纖維素粉液體培養(yǎng)基上，然后在80～90℃的條件下水浴處理8～12min，然后在60±2℃的條件下恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液混濁，得菌懸液B；五、取1mL菌懸液B然后用無菌厭氧水倍比稀釋，然后分別取104倍、105倍和106倍的稀釋液1mL與融化的纖維素粉固體培養(yǎng)基混合均勻后進行滾管，而后在60±2℃的條件下恒溫培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)，然后再挑取透明圈菌落放在纖維素粉液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；六、重復步驟三到步驟五5次，即可分離出嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌。
2、 根據(jù)權利要求1所述的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在 于步驟一中氮氣的純度為99.99%。
3、 根據(jù)權利要求1所述的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在 于步驟一中以150r/min的振速振蕩5h。
4、 根據(jù)權利要求1所述的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在 于步驟二中纖維素粉固體培養(yǎng)基由l.Og的氯化銨、2.0g的氯化鈉、1.5g的磷 酸氫二鉀、3.5g的磷酸二氫鉀、0.5g的半胱氨酸、0.2g的MgCl2.6H20、 0.2g 的氯化鉀、2g的酵母粉、2g的蛋白胨、lmL的微量金屬元素貯液、lmL的維 生素貯液、lmL的濃度為0.1。/。。(w/v)刃天青、10 g/L的纖維素粉、2%的瓊脂 和1000mL的蒸餾水組成。
5、 根據(jù)權利要求4所述的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在 于微量金屬元素貯液由1.5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg的硼酸、O.lg 的MnCl2.4H20、2mg的CuCl2'2H2O、0.19g的CoCl2.6H20、24mg的NiCl2.6H20、36mg的Na2M04'H20、 15mg的鴇酸鈉和15mg的Na2Se04'5H20溶于lOOOmL的蒸餾水制成。
6、 根據(jù)權利要求4所述的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在 于維生素貯液由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg 的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、 l.Omg的維生素B!2和lOO.Omg的鹽酸吡哆醇溶于lOOOmL蒸餾水制成。
7、 根據(jù)權利要求1所述的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在 于步驟四中纖維素粉液體培養(yǎng)基由l.Og的氯化銨、2.0g的氯化鈉、1.5g的磷 酸氫二鉀、3.5g的磷酸二氫鉀、0.5g的半胱氨酸、0.2g的MgCl2'6H20、 0.2g 的氯化鉀、2g的酵母粉、2g的蛋白胨、lmL的微量金屬元素貯液、lmL的 維生素貯液、lmL的濃度為0.1。/。。(w/v)刃天青、10 g/L的纖維素粉和lOOOmL 的蒸餾水組成。
8、 根據(jù)權利要求7所述的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在 于微量金屬元素貯液由1.5g的氯化亞鐵、70mg的氯化鋅、6mg的硼酸、O.lg 的MnCl2.4H20、2mg的CuCl2.2H2O、0.19g的CoCl2'6H20、24mg的NiCl2'6H20、 36mg的Na2M04'H20、 15mg的鎢酸鈉和15mg的Na2Se04'5H20溶于lOOOmL的蒸餾水制成。
9、 根據(jù)權利要求7所述的嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，其特征在 于維生素貯液由50.0mg的硫辛酸、20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg 的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0fng的葉酸、50.0mg的泛酸韓、 l.Omg的維生素Bu和lOO.Omg的鹽酸吡哆醇溶于lOOOmL蒸餾水制成。
全文摘要
嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的分離方法，它涉及一種產(chǎn)氫菌的分離方法。它解決了現(xiàn)有產(chǎn)氫菌的培養(yǎng)方法存在結晶度低、較難降解及培養(yǎng)出的產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫率低的問題。分離方法一、制備菌懸液A；二、制備富集后菌懸液；三、將富集后菌懸液倍比稀釋后進行滾管，培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)；四、制備菌懸液B；五、將菌懸液B倍比稀釋后進行滾管，培養(yǎng)至管中有透明圈出現(xiàn)，然后挑取透明圈菌落再次培養(yǎng)；六、重復步驟三到步驟五5次，即可分離。本發(fā)明分離嗜熱厭氧纖維素產(chǎn)氫菌的方法具有結晶度高，容易降解及分離出產(chǎn)氫菌的產(chǎn)氫率約為現(xiàn)有產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫率的6～8倍的優(yōu)點。
文檔編號C12N1/20GK101402925SQ20081013750
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月12日 優(yōu)先權日2008年11月12日
發(fā)明者任南琪, 劉冰峰, 曹廣麗, 朱玉紅, 王愛杰, 許繼飛, 川 陳 申請人:哈爾濱工業(yè)大學