專利名稱：產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌的快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
對(duì)于產(chǎn)氫反應(yīng)器微生物分子檢測(cè)及其群落多樣性分析是研究反應(yīng)器中微 生物生態(tài)學(xué)所采用的重要技術(shù)手段和內(nèi)容，其最終目的是快速、準(zhǔn)確鑒定產(chǎn)氫 反應(yīng)器中的功能細(xì)菌，并進(jìn)行復(fù)雜微生物群落結(jié)構(gòu)和功能分析。
目前，采用保守的16SrRNA基因引物雖然可以進(jìn)行群落分析，但是無(wú)法 準(zhǔn)確檢測(cè)未培養(yǎng)的產(chǎn)氫細(xì)菌，并且根據(jù)16SrRNA基因與已分離鑒定的產(chǎn)氫細(xì) 菌比較分析，推斷出可能的產(chǎn)氫細(xì)菌，這種檢測(cè)方法不具有特異性，同時(shí)誤差 較大，不能達(dá)到產(chǎn)氫細(xì)菌的準(zhǔn)確檢測(cè)，無(wú)法應(yīng)用于大規(guī)模生物產(chǎn)氫反應(yīng)器啟動(dòng) 和調(diào)控，以及評(píng)估反應(yīng)器的效能和預(yù)測(cè)產(chǎn)氫趨勢(shì)，制約了生物制氫的工業(yè)化進(jìn) 程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有產(chǎn)氫細(xì)菌的檢測(cè)方法存在無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)未培 養(yǎng)的產(chǎn)氫細(xì)菌、檢測(cè)不具有特異性及誤差較大的問(wèn)題，而提供一種產(chǎn)氫細(xì)菌的 特異性快速檢測(cè)方法。'
產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法按以下步驟實(shí)現(xiàn) 一、產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行后 每隔3 7天取出18 22mL的活性污泥，然后采用DNA抽提試劑盒提取活性 污泥DNA，并置于-2(TC的條件下儲(chǔ)存；二、采用[Fe]-氫化酶特異性引物對(duì)活 性污泥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為50 55"C，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30 35;
三、 切取擴(kuò)增得到的目的條帶，然后采用DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA的純化;
四、 將純化得到的DNA采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分離，然后克隆測(cè) 序得到基因序列，再通過(guò)GenBank進(jìn)行相似性檢索和對(duì)比，或者采用phylip 軟件包對(duì)相似序列的對(duì)比及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的繪制，最后通過(guò)Treeview軟件 將進(jìn)化樹(shù)輸出，進(jìn)行分析，即完成產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)；其中步驟二中 [Fe]-氫化酶特異性引物為上游引物Fi 5，-GCCGACCTKACMATMATGGA-3，，下游引物Ri 5，-ATRCARCCRCCSGGRCAGGCCAT- 3';步驟二中PCR擴(kuò)增的 反應(yīng)體系如下
本發(fā)明采用的[Fe]-氫化酶特異性引物是根據(jù)己知的高效產(chǎn)氫細(xì)菌的氫化 酶基因序列設(shè)計(jì)出來(lái)的，在進(jìn)行PCR的過(guò)程中，只有含有氫化酶基因(或者與 氫化酶基因序列相似性較高)的細(xì)菌才容易與引物結(jié)合并進(jìn)行復(fù)制，而含有氫 化酶基因(或者與氫化酶基因序列相似性較高)的細(xì)菌都是在產(chǎn)氫反應(yīng)器中發(fā) 揮重要作用的微生物群體，因此，通過(guò)特異性[Fe]-氫化酶引物的PCR擴(kuò)增， 得到的就是產(chǎn)氫反應(yīng)器的功能細(xì)菌的細(xì)菌群落，避免了非產(chǎn)氫細(xì)菌對(duì)檢測(cè)的干 擾，且使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差小，準(zhǔn)確可靠；本發(fā)明與現(xiàn)有產(chǎn)氫細(xì)菌的檢測(cè)方 法相比，特異性強(qiáng)，可在36 48h內(nèi)檢測(cè)出產(chǎn)氫細(xì)菌，分析出產(chǎn)氫反應(yīng)器中的 產(chǎn)氫微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)演替規(guī)律，結(jié)合產(chǎn)氫反應(yīng)器的運(yùn)行條件和控制參 數(shù)，找出產(chǎn)氫反應(yīng)器快速啟動(dòng)和穩(wěn)定運(yùn)行的規(guī)律，從而加快生物制氫的工業(yè)化 進(jìn)程。
圖1為具體實(shí)施方式
七中分析產(chǎn)氫反應(yīng)器不同運(yùn)行時(shí)間的污泥樣品中產(chǎn) 氫微生物群落DGGE分離圖譜，其中"M"泳道標(biāo)樣為Maker, "Id"泳道標(biāo) 樣為第一天產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)的微生物群落DNA樣品，"8d"泳道標(biāo)樣為第 一天產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)的微生物群落DNA樣品，"15d"泳道標(biāo)樣為第一天產(chǎn) 氫反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)的微生物群落DNA樣品，"22d"泳道標(biāo)樣為第一天產(chǎn)氫反應(yīng) 器運(yùn)行時(shí)的微生物群落DNA樣品，"29d"泳道標(biāo)樣為第一天產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行 時(shí)的微生物群落DNA樣品，"36d"泳道標(biāo)樣為第一天產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)的微 生物群落DNA樣品。
10xPCR Buffer(Mg,
dNTPs(10mmol/L)
上游引物(l(^mol/L)
下游引物(10pmol/L)
~ E(2.5U4iL)
活性污泥DNA模板(50pg/L)
補(bǔ)足dH20
2foL l單 0,5|xL 0.5 jiL
2jxL
至20^iL


具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法按以下步驟 實(shí)現(xiàn) 一、產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行后每隔3 7天取出18 22mL的活性污泥，然后 釆用DNA抽提試劑盒提取活性污泥DNA，并置于-2(TC的條件下儲(chǔ)存；二、 采用[Fe]-氫化酶特異性引物對(duì)活性污泥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為50 55°C，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30 35;三、切取擴(kuò)增得到的目的條帶，然后采用DNA 純化試劑盒進(jìn)行DNA的純化；四、將純化得到的DNA釆用變性梯度凝膠電 泳(DGGE)分離，然后克隆測(cè)序得到基因序列，再通過(guò)GenBank進(jìn)行相似性 檢索和對(duì)比，或者采用phylip軟件包對(duì)相似序列的對(duì)比及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的繪 制，最后通過(guò)Treeview軟件將進(jìn)化樹(shù)輸出，進(jìn)行分析，即完成產(chǎn)氫細(xì)菌的特 異性快速檢測(cè)；其中步驟二中[Fe]-氫化酶特異性引物為上游引物F, 5'-GCCGACCTKACMATMATGGA-3， ， 下 游 引 物 R！ 5'-ATRCARCCRCCSGGRCAGGCCAT-3';步驟二中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如 下
10xPCRBuffer(Mg2+) 2jxL dNTPs(10mmol/L) l單 上游引物(10ixmol/L) 0.5jxL 下游引物(l(Himol/L) 0.5pL 腳E(2.5U/nL) 0單 活性污泥DNA模板(50pg/L) 2pL 補(bǔ)足dH20 至20iiL 。
本實(shí)施方式中的[Fe]-氫化酶特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有 限公司合成。 本實(shí)施方式中DNA抽提試劑盒與DNA純化試劑盒均按說(shuō)明書(shū)操作。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中產(chǎn)氫反
應(yīng)器運(yùn)行后每隔4 6天取出19 21mL的活性污泥。其它步驟及參數(shù)與具體
實(shí)施方式二相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中產(chǎn)氫反
應(yīng)器運(yùn)行后每隔5天取出20rnL的活性污泥。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中采用 DNA抽提試劑盒提取活性污泥DNA之前，對(duì)活性污泥DNA進(jìn)行超聲波預(yù)處 理，超聲時(shí)間為27s，超聲功率為50Hz。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相 同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中退火溫 度為52"C，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中退火溫 度為55。C,擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法按以下步驟 實(shí)現(xiàn) 一、產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行后每隔7天取出20mL的活性污泥，然后采用DNA 抽提試劑盒提取活性污泥DNA，并置于-20'C的條件下儲(chǔ)存；二、采用[Fe]-氫 化酶特異性引物對(duì)活性污泥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為55"C，擴(kuò)增循 環(huán)數(shù)為35;三、切取擴(kuò)增得到的目的條帶，然后采用DNA純化試劑盒進(jìn)行 DNA的純化；四、將純化得到的DNA采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分離， 然后克隆測(cè)序得到基因序列，再采用phylip軟件包對(duì)相似序列的對(duì)比及系統(tǒng)發(fā) 育進(jìn)化樹(shù)的繪制，最后通過(guò)Treeview軟件將進(jìn)化樹(shù)輸出，進(jìn)行分析，即完成 產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)；其中步驟二中[Fe]-氫化酶特異性引物為上游引物 F！ 5'-GCCGACCTKACMATMATGGA-3，， 下 游 引 物 Ri 5，-ATRCARCCRCCSGGRCAGGCCAT-3，；步驟二中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如 下
1 OxPCR Buffer(Mg2+) 2pL dNTPs(10mmol/L) l單 上游引物(10^imol/L) 0.5piL 下游引物(10pimol/L) 0.5^L %《E(2.5U/nL) 0萃 活性污泥DNA模板(50jig/L) 2jxL補(bǔ)足dH20 至20pL 。
本實(shí)施方式中產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)與現(xiàn)有產(chǎn)氫細(xì)菌的檢測(cè)方法相 比，特異性強(qiáng)，可在36h內(nèi)檢測(cè)出產(chǎn)氫細(xì)菌。
本實(shí)施方式中采用[Fe]-氫化酶特異性引物對(duì)反應(yīng)器污泥PCR擴(kuò)增得到目 的條帶，將其進(jìn)行DNA的純化后采用變性梯度凝膠電泳(DGEE)分離，得到產(chǎn) 氫反應(yīng)器運(yùn)行期間的功能微生物群落結(jié)構(gòu)和演替動(dòng)態(tài)，結(jié)果如圖1所示，每個(gè) 泳道的每個(gè)條帶都分別代表著一種細(xì)菌，可以看出，在反應(yīng)器運(yùn)行期間，反應(yīng) 器中的微生物群落出現(xiàn)了演替， 一些細(xì)菌在反應(yīng)器運(yùn)行期間，競(jìng)爭(zhēng)處于劣勢(shì)， 種群數(shù)量有所降低，而一些優(yōu)勢(shì)種群更加明顯，逐漸形成穩(wěn)定的群落，這說(shuō)明 在反應(yīng)器中起主導(dǎo)作用的是這些穩(wěn)定的功能菌群；然后通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu) 建，發(fā)現(xiàn)全部的氫化酶基因序列可以分為五個(gè)種群，分別與C7o欲Wwm 犯cc/zara/ e^m(v/"ce/om'cww2(相似性48.9%)， C7oWnWwm ^2ermoce〃i/m(相4以性 60.9%), *Sy"^"C|p/wZjacfer /wmarax/fibm1(相{以'性 61.9%)， (S少"/ra/ / owowas 0//"'(相似性60.6%)， Megosp/wfera e/Wem'《相似性77.8%)，和E. /z^^/wmse(相 似性90.5.%);結(jié)果表明檢測(cè)到的這些細(xì)菌是未被培養(yǎng)的，是同5.^A/"e"化， C ^^r附oce〃wm， <S. wo^/fe/， ^stfem7禾口 5".y^附"rax/cfa似親緣關(guān)系較相近的細(xì) 菌。序歹lj表
<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)
<120>產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法
<160>2
<210> 1 <211>20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223> [Fe]-氫化酶特異性上游引物 <220>
<221> misc_feature <222> (9,12,15) 〈223〉k^g或t/u， m-a或c
<400> 1
gccgacctka cmatmatgga 20
<210>2 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<220><223> [Fe]-氫化酶特異性下游引物 <220>
<221〉 misc—feature <222〉 (3,6,9,12,15) <223> r= g或a, s=g或c
<400>2
atrcarccrc csggrcaggc cat 2權(quán)利要求
1、產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法，其特征在于產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行后每隔3～7天取出18～22mL的活性污泥，然后采用DNA抽提試劑盒提取活性污泥DNA，并置于-20℃的條件下儲(chǔ)存；二、采用[Fe]-氫化酶特異性引物對(duì)活性污泥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為50～55℃，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30～35；三、切取擴(kuò)增得到的目的條帶，然后采用DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA的純化；四、將純化得到的DNA采用變性梯度凝膠電泳分離，然后克隆測(cè)序得到基因序列，再通過(guò)GenBank進(jìn)行相似性檢索和對(duì)比，或者采用phylip軟件包對(duì)相似序列的對(duì)比及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的繪制，最后通過(guò)Treeview軟件將進(jìn)化樹(shù)輸出，進(jìn)行分析，即完成產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)；其中步驟二中[Fe]-氫化酶特異性引物為上游引物F15’-GCCGACCTKACMATMATGGA-3’，下游引物R15’-ATRCARCCRCCSGGRCAGGCCAT-3’；步驟二中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下10×PCR Buffer(Mg2+)2μLdNTPs(10mmol/L) 1.6μL上游引物(10μmol/L) 0.5μL下游引物(10μmol/L) 0.5μLTaq E(2. 5U/μL) 0.2μL活性污泥DNA模板(50μg/L) 2μL補(bǔ)足dH2O至20μL。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法，其特征在于 步驟一中產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行后每隔4 6天取出19 21mL的活性污泥。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法，其特征在于 步驟一中產(chǎn)氫反應(yīng)器運(yùn)行后每隔5天取出20mL的活性污泥。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l'所述的產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法，其特征在于 步驟一中采用DNA抽提試劑盒提取活性污泥DNA之前，對(duì)活性污泥DNA進(jìn) 行超聲波預(yù)處理，超聲時(shí)間為27s，超聲功率為50Hz。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟二中退火溫度為52"C，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法，其特征在于 步驟二中退火溫度為55'C，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35。
全文摘要
產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)方法，它涉及一種細(xì)菌的快速檢測(cè)方法。它解決了現(xiàn)有產(chǎn)氫細(xì)菌的檢測(cè)方法存在無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)未培養(yǎng)的產(chǎn)氫細(xì)菌、檢測(cè)不具有特異性及誤差較大的問(wèn)題。方法一、取活性污泥，然后采用DNA抽提試劑盒提取活性污泥DNA，并儲(chǔ)存；二、采用[Fe]-氫化酶特異性引物對(duì)活性污泥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；三、切取擴(kuò)增得到的目的條帶，然后采用DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA的純化；四、純化得到的DNA采用變性梯度凝膠電泳分離，再對(duì)克隆測(cè)序得到基因序列進(jìn)行分析，即完成產(chǎn)氫細(xì)菌的特異性快速檢測(cè)。本發(fā)明避免了非產(chǎn)氫細(xì)菌對(duì)檢測(cè)的干擾，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差小，準(zhǔn)確可靠，特異性強(qiáng)，可在36～48h內(nèi)檢測(cè)出產(chǎn)氫細(xì)菌。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101429543SQ20081013759
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者萬(wàn)晶晶, 任南琪, 謝天卉, 邢德峰 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)