專利名稱：：利用質譜技術對蘇云金桿菌菌株進行分類鑒定的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種蘇云金桿菌菌株分類鑒定方法，具體地說，是涉及一種利用質譜技術對蘇云金桿菌菌株進行分類鑒定的方法。
背景技術：
：蘇云金芽胞桿菌(&W'LMt力W^7^'朋W'S，簡稱Bt)是一種廣泛分布的革蘭氏陽性細菌，屬于蠟質芽胞桿菌屬。殺蟲晶體蛋白是蘇云金芽胞桿菌在芽胞形成的同時產(chǎn)生的伴胞晶體的主要組成成分，對節(jié)肢動物門中鱗翅目(L印id叩tera)、鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)等10個目的昆蟲和原生動物門(Protozoa)、扁形動物門(Platghelminthes)、線形動物門(Nemathelminthes)等農(nóng)林害蟲有特異毒殺作用。伴胞晶體進入敏感昆蟲的消化道后發(fā)生溶解并釋放出27-140kD的原毒素。在中腸蛋白酶的作用下，原毒素被激活為23-70kD的毒性多肽。隨后毒素與中腸刷狀緣膜泡(BBMV,Brushbordermembranevesicle)發(fā)生作用并且在細胞膜上形成孔道，破壞細胞的滲透平衡，引起細胞裂解，最終導致幼蟲死亡。自Schn印f等首次從Bt菌株中克隆cry基因至今，已有400多種殺蟲晶體蛋白被報道。1989年，H5fte和Whiteley根據(jù)當時已報道的42個殺蟲晶體蛋白的氮基酸序列的同源性和殺蟲譜的差異，提出了HW分類系統(tǒng)，即將Bt殺蟲晶體蛋白分為兩大類，晶體蛋白基因家族(crystalproteingenes)，即Cry蛋白，包括CryI、CryII、CryIII、CryIV和細胞外溶解性晶體蛋白家族(cytolyticprotein),即Cyt蛋白。隨著Bt分子生物學研究的深入，新的cry基因不斷被分離、克隆，有些Cry蛋白適合原有的HW系統(tǒng)，但是更多的Cry蛋白則不適合這個分類系統(tǒng)。為解決這個問題，1995年，在無脊椎動物病理學年會上成立了由N.Crickmore等組成的殺蟲晶體蛋白及基因命名委員會，由此委員會提出了新的分類系統(tǒng)，即所有來自蘇云金芽胞桿菌的具有殺蟲活性的晶體蛋白只根據(jù)ICPs氨基酸序列同源性的差異，而不再考慮殺蟲譜的不同來命名。同源性在45%以下的殺蟲晶體蛋白，采用阿拉伯數(shù)字來命名，如Cryl、Cry2;同源性在45%-78%之間，采用大寫英文字母命名，如CrylA、CrylB;同源性在78%-95。％之間，采用小寫英文字母命名，如CrylAc、CrylAb;同源性在95%以上，也使用阿拉伯數(shù)字，如CrylAal、CrylAa2。編碼殺蟲晶體蛋白的基因以相應的斜體并小寫首字母命名，如c2丁Wc厶至2007年，Bt的殺蟲晶體蛋白基因種類己經(jīng)擴充到56群，100多個亞群。目前，該系統(tǒng)還在繼續(xù)擴大。蘇云金芽胞桿菌因為含有豐富的殺蟲晶體蛋白而成為目前生物農(nóng)藥的主要生產(chǎn)菌株，菌株和殺蟲蛋白的鑒定是很有必要的(發(fā)現(xiàn)新菌株、新蛋白)。對其進行蛋白質組學分析，有助于研究蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵過程中對晶體蛋白形成有重要影響的相關蛋白。Bt菌株以其產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白為主要殺蟲活性成分，所以鑒定Bt菌株的晶體蛋白組成有助于全面準確地預測其殺蟲活性。目前對Bt殺蟲晶體蛋白的鑒定主要是通過免疫印跡和高效液相色譜(High-PerformanceLiquidChromatography,HPLC)進行的。但是采用液相色譜和免疫印跡鑒定Bt原毒素組成均存在耗時長的缺點，如液相色譜需要提供標準品，因此檢測的前提是構建目的蛋白的表達株并獲得該蛋白的純樣品，而免疫印跡也需要獲得純化的目的蛋白，并免疫兔子等動物，獲得抗血清。此外，因為Bt原毒素在三級水平有78免以上的序列同源性，也限制了液相色譜和免疫印跡等傳統(tǒng)方法在原毒素鑒定上的應用。隨著質譜技術的發(fā)展，質譜方法的優(yōu)勢逐漸應用于各個生物組織的蛋白質組學分析。2002年，Ranasinghe等運用SDS-PAGE串聯(lián)基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)分析并鑒定了HDl-Dipel菌株產(chǎn)生的CrylAa、CrylAb、CrylAc和Cry2Aa原毒素，HD73菌株產(chǎn)生的CrylAc;am2菌株產(chǎn)生的CrylHb、CrylDb原毒素等晶體蛋白組分，初次顯示了質譜技術在Bt原毒素鑒定上的優(yōu)勢。2006年，Lee等釆用SDS-PAGE結合ESI-Q-TOF分析了Btkonkukian亞種的晶體蛋白組成，雖然鑒定到了兩種膜蛋白，但沒有鑒定到殺蟲晶體蛋白。雖然質譜方法逐漸應用于不同菌株晶體蛋白、膜蛋白的鑒定，但僅僅局限于蛋白質組學領域內(nèi)的分析，沒有進一步根據(jù)質譜結果推測新蛋白的基因序列，并結合新基因的克隆、表達等分子生物學方法，為蘇云金桿菌菌株的系統(tǒng)分類提供依據(jù),進而為生物農(nóng)藥的生產(chǎn)提供技術支持。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用質譜技術對蘇云金桿菌菌株進行分類鑒定的新方法，該方法能快速、準確地鑒定到與Bt菌株殺蟲活性密切相關的晶體蛋白組成，從而可更快速、準確地對Bt菌株進行分類，從菌株鑒定、分型到殺蟲特性確定,可以一步到位。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的，其包括以下步驟(l)培養(yǎng)蘇云金桿菌菌株直到晶體和芽胞從母細胞中完全釋放，并將菌株芽胞/伴胞晶體混合物進行提純；(2)通過包埋蘇云金桿菌菌株產(chǎn)生的晶體蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝膠塊中，結合LC-MS/MS分析膠內(nèi)酶解的復合肽段，鑒定晶體蛋白中原毒素的組成；(3)根據(jù)質譜結果推測鑒定到的新蛋白的基因序列，并對相應的新基因進行克隆、表達，從而為蘇云金桿菌菌株的系統(tǒng)分類提供依據(jù)。本發(fā)明方法能快速、準確地鑒定到與Bt菌株殺蟲活性密切相關的晶體蛋白組成，從而更快速、準確地對Bt菌株進行分類。從菌株鑒定、分型到殺蟲特性確定,可以一步到位，從而可為優(yōu)質生物農(nóng)藥的生產(chǎn)提供強大技術支持。具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不能認為只局限于下述具體實施方式。對所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的基本前提下，還可以做出若干簡單推演或等同替換，這些等同替換方案仍然將被視為在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。1、Bt菌株培養(yǎng)將菌株用無菌水漂洗，均勻涂布于LB固體平板，30'C倒置培養(yǎng)8h，挑取單菌落，繼續(xù)劃線純化1次。8h后挑單菌落接LB斜面或平板培養(yǎng)。第二天轉接5mLLB搖瓶培養(yǎng)，8h后進行菌種保藏，并按2%的接種量轉接50mLG-Tris培養(yǎng)基。30'C，2000rpm培養(yǎng)60h,直到晶體和芽胞從母細胞中完全釋放。2、Bt菌株芽胞/伴胞晶體混合物的提純將Bt菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)(30'C,200rpm)8h后，轉接到50mL新鮮G-Tris液體培養(yǎng)基中進行搖瓶振蕩培養(yǎng)(30'C，200rpm)60h左右，直到晶體和芽胞從母細胞中完全釋放。Bt4.0718、HD1、HD73菌株嚴格按相同的量平行操作。等體積的培養(yǎng)液10,000rpm離心10min,收集沉淀，0.5M的NaCl洗滌一次；離心獲得的沉淀用生理鹽水懸浮，4'C超聲波處理懸浮液3次；將超聲波處理后的懸浮液離心并用生理鹽水洗滌2次，5%的丙酮和雙蒸水各洗兩次，所得沉淀即為提純的芽胞/伴胞晶體混合物。將該混合物分裝至1.5mL的Ep管中，置于真空冷凍干燥儀進行干燥，所得干粉4'C存放備用。3、Bt菌株伴胞晶體的SDS-PAGE分析取一支晶體蛋白測定樣品，用適量超純水懸浮，加入等體積2XSDS上樣緩沖液，IOO'C煮沸5min,12,000rpm離心5min,取上清進行SDS-PAGE分析，濃縮膠濃度為5%，使用電壓為50V，分離膠濃度為10%,使用電壓為100V,電泳完畢后用考馬斯亮藍R-250染色。脫色后的凝膠用凝膠掃描儀掃描，利用Gel-Proanalyzer軟件計算蛋白的相對.遷移率、分子量和蛋白濃度。濃縮膠與分離膠的配制方法如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4、Bt晶體蛋白樣品的包埋取l支純化的Bt菌株的芽胞/伴胞晶體混合物，加入適量的超純水懸浮，并加等量的2X包埋蛋白樣品處理緩沖液，混合均勻，沸水浴5min,13200rpm離心5min，吸取上清液至一個新Ep管中，配成1-5ug/nL濃度的蛋白混合樣品。取20yg蛋白混合樣品于1個新的0.5mLEp管中，加入30%的丙烯酰胺20"L，補充超純水至總體積48uL，混合均勻，加入lHL新鮮配置的10%APS，1uLTEMED攪拌均勻，取25laL混合物分裝至另一個0.5mLEp管中，室溫放置1h，制成12%的丙烯酰胺膠塊。5、Bt晶體蛋白樣品的原位酶解將制備好的包埋有晶體蛋白樣品的聚丙烯酰胺膠塊浸泡在固定液中過夜，第二天再更換2次固定液。將蛋白固定好的膠塊切成2-3小塊，進行胰蛋白酶原位酶解。6、LC-MS/MS分析Bt菌株晶體蛋白原位酶解肽段(1)ESI-tc-MS/MS分析Bt晶體蛋白中原毒素的組成將酶解好的肽段溶解在33uL含0.1%甲酸的水溶液中，13200rpm離心15min，取30uL至ESI-Trap的樣品瓶中，進行CapLC-MS/MS分析。質譜分析選用英國Micromasss公司的電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜儀(Electrosprayionizationquadrupletime-of-flight，簡稱ESIQ-TOF)進行，配備有毛細管液相色譜儀(CapLC)和納升(Nano)噴霧源。所有測定均在正離子模式下進行。用Glu-fib的串聯(lián)碎片進行校正，質量誤差為士O.1u。霧化氣為氮氣，碰撞氣為氬氣，源溫為80'C,錐孔電壓為45V，噴嘴電壓3000V，MCP檢測器電壓為2700V。儀器的MS和MS/MS的轉換通過儀器控制軟件中的AutomatedDataD印endentAcquisition(DDA)模式控制。自動進樣系統(tǒng)設備裝備一個C18脫鹽預柱(5mm1ongX300umi.d.)和一個C18毛細管柱(150mm1ongX75umLd.)。在進樣后的前5min通過預柱脫鹽和濃縮，流速250nL/min。以后的時間通過梯度洗脫經(jīng)C18毛細管柱進行肽段分離，流速為200nL/min。流動相A液為含0.1%甲酸/4.9%ACN/95X的水溶液，B液為含O.1%甲酸/4.9%H20/95%ACN(v/v/v)。樣品在預柱中用C液脫鹽后，分析柱用以下梯度進行梯度洗脫5-40minB液濃度從5%上升至50%，40-50minB液濃度從50%上升至95%，50-60min,B液濃度保持在95%,60-70minA液平衡分析柱。分離后的肽段直接進入離子源，一次選擇三個最大強度(超過設定的域值并帶2個或者2個以上正電荷)的肽段進行MS/MS分析。(2)蛋白質的數(shù)據(jù)庫搜尋鑒定ESI-(hTOF獲得的數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(NCBInr)，使用Mascot軟件中的串級質譜數(shù)據(jù)搜索功能(MS/MSIonsSearch或Sequencequery)進行搜索(http://www.matrixscience.com)0數(shù)據(jù)庫的搜索選擇下列參數(shù)固定修飾數(shù)據(jù)庫搜索所選擇的參數(shù)如下固定修飾為Carbamidomethyl(Cys)，切害!j酶為Trypsin,允許最大未酶切位點(Missedcleavages)數(shù)為1，可變修飾為甲硫氨酸氧化，肽段的質量容差為1.2Da,碎片離子的質量容差為0.6Da。肽段的得分(Individualionscores)超過它的閾值(threshold)的被視為準確鑒定的肽段，具有的可信度大于95%。對于第一個匹配的總得分最高，且匹配多條得分超過閾值的肽段的候選蛋白，不進行人工的檢査，就認為該蛋白質得到了準確的鑒定。對于得分第二的候選蛋白，經(jīng)過人工檢測其是否匹配有1條以上高分蛋白未匹配的新肽段，從而確定結果的取舍。如果總得分較低的候選蛋白匹配有1條或1條以上在得分較高的蛋白中未出現(xiàn)的多肽，則認為這蛋白質得到準確鑒定，否則予以舍棄。根據(jù)這個原則進行Bt菌株中具有高同源性的原毒素的鑒定。鑒定的蛋白質通過網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez和http:〃麗.expasy.org/sprot/里的Swiss-Prot/TrEMBL進行比對分析。7、新蛋白基因序列的克隆與表達對于準確鑒定的新蛋白，以其鑒定的多肽氨基酸序列為依據(jù)，根據(jù)密碼子反向推測其基因序列，并以此為模板設計引物。對該菌株總DM進行PCR擴增，并克隆PCR產(chǎn)物，獲得新蛋白的基因序列。根據(jù)該序列進一步擴增到后期的全長序列，并進行表達，進r步準確鑒定新蛋白，確定蘇云金芽孢桿菌新菌株的分類地位。權利要求1.利用質譜技術對蘇云金桿菌菌株進行分類鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)培養(yǎng)蘇云金桿菌菌株直到晶體和芽胞從母細胞中完全釋放，并將菌株芽胞/伴胞晶體混合物進行提純；(2)通過包埋蘇云金桿菌菌株產(chǎn)生的晶體蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝膠塊中，結合LC-MS/MS分析膠內(nèi)酶解的復合肽段，鑒定晶體蛋白中原毒素的組成；(3)根據(jù)質譜結果推測鑒定到的新蛋白的基因序列，并對相應的新基因進行克隆、表達，從而為蘇云金桿菌菌株的系統(tǒng)分類提供依據(jù)。全文摘要利用質譜技術對蘇云金桿菌菌株進行分類鑒定的方法，其包括以下步驟(1)培養(yǎng)蘇云金桿菌菌株直到晶體和芽胞從母細胞中完全釋放，并將菌株芽胞/伴胞晶體混合物進行提純；(2)通過包埋蘇云金桿菌菌株產(chǎn)生的晶體蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝膠塊中，結合LC-MS/MS分析膠內(nèi)酶解的復合肽段，鑒定晶體蛋白中原毒素的組成；(3)根據(jù)質譜結果推測鑒定到的新蛋白的基因序列，并對相應的新基因進行克隆、表達，從而為蘇云金桿菌菌株的系統(tǒng)分類提供依據(jù)。文檔編號C12Q1/02GK101382520SQ200810143029公開日2009年3月11日申請日期2008年9月28日優(yōu)先權日2008年9月28日發(fā)明者丁學知,付祖姣,夏立秋,孫運軍,燦袁申請人:湖南師范大學