專利名稱：：測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物和一種測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法?？蓪⒈景l(fā)明用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物和方法應(yīng)用于臨床檢查，其能夠精確地測(cè)定糖化蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：在糖尿病的診斷和控制中測(cè)定糖化蛋白質(zhì)是非常重要的。對(duì)能夠反應(yīng)過去約1至2個(gè)月的平均血糖值的糖化血紅蛋白(GHb)，能反應(yīng)過去約2周的平均血糖值的糖化清蛋白(GA)，一般地指示血清中具有還原能力的糖化蛋白的果糖胺(FRA)等可每天進(jìn)行測(cè)定。GHb是血紅蛋白的糖化產(chǎn)物，即在血紅蛋白P-鏈上N-末端纈氨酸的ot-氨基基團(tuán)被糖化。GA和FRA分別是清蛋白和血清蛋白的糖化產(chǎn)物，即清蛋白或血清蛋白的賴氨酸殘基上的s-氨基基團(tuán)被糖化。酶學(xué)方法是一種簡(jiǎn)易且便宜的精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法。日本專利申請(qǐng)公開No.6-46846，No.5-192193，No.2-195卯0和No.2-195899，以及國際例。然而，為提供一種精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物，有必要1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響以及2)使蛋白酶和能夠至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶保持穩(wěn)定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，則3)精確測(cè)定清蛋白和4)消除糖化血紅蛋白的影響也很重要。1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響的常規(guī)方法已知糖尿病患者的球蛋白的量能夠改變和影響FRA的值[Rodrigues，S.等，臨床化學(xué)(Clin.Chem.)35:134-138(1989)。本發(fā)明人研發(fā)了一種方法，其中通過向蛋白酶反應(yīng)液中加入特定金屬離子和蛋白質(zhì)A或G可選擇性地抑制蛋白酶對(duì)球蛋白組分的作用(日本專利申請(qǐng)No.ll-231259)。利用此發(fā)明的方法，可以測(cè)定糖化蛋白而不會(huì)受到球蛋白組分的影響。應(yīng)用于此方法中的球蛋白選擇性蛋白酶抑制劑可提及的有金屬、蛋白A和蛋白G。在此專利申請(qǐng)所述的金屬中，強(qiáng)效金屬是那些可能會(huì)導(dǎo)致環(huán)境安全問題的重金屬。而弱效金屬如果與其它試劑(或組合物)結(jié)合可能導(dǎo)致試劑溶液渾濁。另外，蛋白A和蛋白G都是非常昂貴的試劑。作為選擇性吸附血液中球蛋白的方法，已知血液處理劑利用色i普學(xué)原理以及具有類固醇骨架的引入了配體的乙烯共聚物可對(duì)血液中的內(nèi)毒素和球蛋白進(jìn)行吸附(日本專利申請(qǐng)>^開No.61-94663)。然而，在日本專利申請(qǐng)公開No.61-94663的實(shí)施例中附表1所示的結(jié)果表明只有ot1-球蛋白和oc2-球蛋白被證明可被吸附，而占球蛋白組分70%或更多的y-球蛋白不能被吸附。假設(shè)Y-球蛋白被吸附，則不會(huì)期望血液處理試劑具有抑制蛋白酶對(duì)Y-球蛋白的作用的能力。近年來，大量抗壞血酸作為增補(bǔ)物凈皮才聶取的情況越來越多。含有高濃度抗壞血酸的臨床樣品也在增加?？箟难嵊捎诰哂袕?qiáng)還原性而對(duì)臨床檢查造成多種影響。作為消除抗壞血酸影響的方法，已知可通過化學(xué)或利用抗壞血酸氧化酶的酶學(xué)方法去除樣品中的抗壞血酸。從對(duì)顯色系統(tǒng)引起較小影響來考慮，當(dāng)利用至少與糖化氨基M應(yīng)的酶對(duì)利用蛋白酶斷裂糖化蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的糖化氨基酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，優(yōu)選預(yù)先地在與蛋白酶反應(yīng)時(shí)利用抗壞血酸氧化酶(ASOx)去除抗壞血酸的方法。作為蛋白酶存在時(shí)利用ASOx去除樣品中抗壞血酸的實(shí)例，對(duì)在pH8.0的2-[4-(2-羥乙基)-l-哌噪基I-乙磺酸(HEPES)緩沖液中使ASOx與樣品溶液反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)已有報(bào)道(ClinicalChemistry(臨床化學(xué))，27:99-106，1998)。文獻(xiàn)《^艮道經(jīng)過兩周的冷藏后處理抗壞血酸的能力沒有變化。然而，本發(fā)明人的研究表明當(dāng)HEPES緩沖液(pH8.0)、蛋白酶和ASOx存在時(shí)，在37。C下j^藏一天或在10。C下J^藏兩周后抗壞血酸處理能力已經(jīng)幾乎完全喪失。2)用于穩(wěn)定蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的現(xiàn)有技術(shù)用于糖化蛋白質(zhì)的臨床檢測(cè)的蛋白酶溶液具有在其它領(lǐng)域如食品業(yè)中無法見到的極高濃度。已知蛋白酶在水溶液中能進(jìn)行自消化。難以想象蛋白酶能以如此高濃度在水溶液中保持穩(wěn)定。因此，在用于鑒定糖化蛋白的組合物中使用的蛋白酶以凍干產(chǎn)物形式提供。目前尚沒有用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物及測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法能使其中的蛋白酶以液態(tài)形式保持穩(wěn)定并可長期貯藏。目前也沒有測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物以及測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法能使其中的至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶以液態(tài)形式保持穩(wěn)定并可長期貯藏。3)有關(guān)精確測(cè)定清蛋白的方法的現(xiàn)有技術(shù)抗清蛋白抗體免疫和利用溴甲酚綠(BCG)、溴曱酚紫(BCP)的染色法等是測(cè)定清蛋白的方法。染色法由于操作簡(jiǎn)便成本低廉而被廣泛用于每日檢測(cè)中。雖然已經(jīng)證實(shí)BCG對(duì)球蛋白組分的作用，但BCG的缺點(diǎn)是對(duì)清蛋白的專一性低。另一方面，BCP盡管對(duì)清蛋白具有高專一性但易受到共存物質(zhì)的影響。尤其是，BCP受到SH化合物的影響，從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果依據(jù)清蛋白的氧化還原狀態(tài)出現(xiàn)差異的問題。為解決這一問題，提出了在蛋白質(zhì)變性劑和/或SH試劑存在時(shí)反應(yīng)BCP的方法(日本專利申請(qǐng)公開No.10-232233)。然而，還沒有關(guān)于BCP對(duì)GA和非糖化清蛋白(NGA)的反應(yīng)性的研究實(shí)例。4)消除糖化血紅蛋白影響的現(xiàn)有技術(shù)如上所述，GA是從清蛋白經(jīng)s-氨基的糖化衍生得到，而GHb是經(jīng)糖化血紅蛋白p-鏈上的N-末端纈氨酸的a-氨基得到。因此，如果GA作為測(cè)量對(duì)象，可能期望只測(cè)定S-氨基被糖化的氨基酸。雖然已知有幾種酶顯示出對(duì)S-氨基的高度專一性而且對(duì)糖化纈氨酸沒有作用(日本專利申請(qǐng)/^開No.ll-243950)，但是沒有一種酶的成本足夠低廉以致可作為實(shí)際應(yīng)用中的酶。其中，來自尖鐮孢(Fusariumoxysporm)的果糖基氛基酸氧化酵(FOD)具有高反應(yīng)性，是有用的。本發(fā)明人單獨(dú)報(bào)道了FOD的基因(日本專利申請(qǐng)^HfNo.10-201473)。雖然利用此基因的方法產(chǎn)率高且能夠以低成本生產(chǎn)FOD，但本發(fā)明人證實(shí)，其與ot-氨基被糖化的糖化纈氨酸的反應(yīng)性沒有顯示出令人滿意的專一性。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是為精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)提供一種組合物，該組合物1)能夠消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響以及2)使蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶保持穩(wěn)定，并提供一種穩(wěn)定方法。本發(fā)明的另一目的是在糖化蛋白質(zhì)是糖化清蛋白的情況下提供一種3)能夠精確測(cè)定清蛋白并且4)能夠消除糖化血紅蛋白的影響的組合物，及提供一種消除糖化血紅蛋白的影響的方法。為精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)，有必要l)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響以及2)使蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶保持穩(wěn)定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，則有必要3)準(zhǔn)確測(cè)定清蛋白和4)消除糖化血紅蛋白的影響。1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人經(jīng)過廣泛研究發(fā)現(xiàn)如果將選自脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽，季銨鹽類陽離子表面活性劑，伴刀豆凝集素A,辛基葡糖苷，和甜菜堿的一種或多種組分添加到蛋白酶反應(yīng)溶液中，則可以選擇性地抑制蛋白酶對(duì)球蛋白組分的作用，而且即使使至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶直接與此反應(yīng)溶液反應(yīng)，也不會(huì)抑制此酶促作用而能簡(jiǎn)單且重復(fù)性極好地精確測(cè)定糖化蛋白。這些化合物具有經(jīng)濟(jì)方面的優(yōu)點(diǎn)，與利用常規(guī)技術(shù)的方法相比沒有環(huán)境和安全的問題，且與樣品混合時(shí)不會(huì)產(chǎn)生混濁。ASOx能有效除去抗壞血酸。然而，通常很難假定ASOx在含有大量蛋白酶的反應(yīng)液中能保持穩(wěn)定。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明人對(duì)各種蛋白酶、蛋白酶抑制劑和各種ASOx的研究，尚未發(fā)現(xiàn)存在能使ASOx在含有大量蛋白酶的反應(yīng)液中保持穩(wěn)定的條件。然而經(jīng)過潛心研究，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)ASOx的穩(wěn)定性依據(jù)緩沖液的類型可以顯著增加。2)蛋白酶和至少與糖化氨基M應(yīng)的酶的穩(wěn)定如上所述，在糖化蛋白的臨床測(cè)定中使用的是高蛋白酶濃度的蛋白酶溶液。原則上，蛋白酶本身在這樣的溶液中是不穩(wěn)定的。然而，經(jīng)過廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如果添加二曱基亞砜，醇，水溶性鈣鹽，氯化鈉，季銨鹽或季銨鹽類陽離子表面活性劑，則蛋白酶的穩(wěn)定性可以顯著增加且蛋白酶能以高濃度溶液形式長期貯藏。至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶是不穩(wěn)定的，因?yàn)槿绻砸簯B(tài)形式在37°C貯藏4天，酶活力將減少到初始活力的約10%。然而，經(jīng)過廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如果將選自糖醇，蔗糖，水溶性鎂鹽，水溶性鉤鹽，硫酸銨，氨基酸和肌氨酸的穩(wěn)定劑添加到至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶中，則能夠產(chǎn)生令人吃驚地高穩(wěn)定作用以致酶以液態(tài)形式在37。C貯藏4天后酶活力幾乎沒有可見的減少。此外，雖然蛋白酶在接近最適pH時(shí)顯示出高的蛋白水解活力，但是同時(shí)發(fā)生的自體消化反應(yīng)使得難于尤其以液態(tài)形式貯藏蛋白酶。然而，經(jīng)過廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過提供第一試劑(其被配制成能適當(dāng)引起蛋白酶的反應(yīng))以及第二試劑(其被配制成能穩(wěn)定液態(tài)蛋白酶)，蛋白酶可以穩(wěn)定地貯藏且不受檢測(cè)時(shí)條件的影響。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)即使將用于預(yù)反應(yīng)的酶摻入到第二試劑中，也可以進(jìn)行精確測(cè)定而不影響測(cè)量結(jié)果。另外，如果將至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶添加到第一試劑中，則可預(yù)先除去樣品中的糖化氨基酸并選擇性地測(cè)定糖化蛋白質(zhì)。3)精確測(cè)定清蛋白的方法經(jīng)本發(fā)明人的研究意外發(fā)現(xiàn)BCP與GA的反應(yīng)性不同于BCP與NGA的反應(yīng)性，而且如果有大量NGA存在，分析值會(huì)受到負(fù)面影響。經(jīng)過廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過在測(cè)定清蛋白之前或同時(shí)以蛋白質(zhì)變性劑和/或具有S-S鍵的化合物處理樣品，實(shí)現(xiàn)對(duì)含有大量NGA的樣品中的清蛋白的精確測(cè)定。4)消除糖化血紅蛋白的影響基于對(duì)上述問題的大量研究，本發(fā)明人通過對(duì)來自尖鐮孢IFO-9972菌林的FOD基因進(jìn)行修飾制備出突變FOD并測(cè)定了突變FOD的性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過以另一個(gè)氨基酸替代從N-端算起的第372位賴氨酸可以使底物特異性發(fā)生明顯改變。而且，本發(fā)明人還制備了幾種對(duì)糖化纈氨酸僅顯示出極低的反應(yīng)性并幾乎專一地與糖化賴氨酸進(jìn)行反應(yīng)的經(jīng)修飾FOD。根據(jù)上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)的這些突變FOD由于以另一氨基酸替代SEQIDNo.l所示氨基酸序列中的第372位賴氨酸，已經(jīng)喪失了與糖化纈氨酸的反應(yīng)性。具體來說，這些突變FOD為權(quán)利要求l所述的突變FOD，其是以色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸替代SEQIDNo.l所示氨基酸序列中的第372位賴氨酸而得到的。最后，綜合上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了用于精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物和方法。本發(fā)明的構(gòu)成和優(yōu)選實(shí)施方案將在下文進(jìn)行詳述。任何蛋白酶都可應(yīng)用于本發(fā)明，只要該蛋白酶能夠有效地與包含在樣肽即可。實(shí)例包括來源于動(dòng)物，植物，和微生物如芽孢桿菌屬(Bacillus)，曲霉屬(Aspergillus),青霉屬(Penicillium),鏈霉菌屬(Streptomyces)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，梭菌屬(Clostridium)，Lysobacter，Gliflla，酵母屬(Yeast)，麥軸梗霉屬(Tritirachium)，棲熱菌屬(Thermus),假單胞菌屬(Pseudomonus)和無色桿菌屬(Achromobacter)等的蛋白酶。如果待測(cè)定的糖化蛋白是GA，則優(yōu)選對(duì)人類清蛋白(Alb)具有高反應(yīng)性的芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬的微生物蛋白酶。如果待測(cè)定的糖化蛋白是GHb，則優(yōu)選對(duì)人類血紅蛋白(Hb)具有高反應(yīng)性的芽孢桿菌屬、曲霉屬、鏈霉菌屬或麥軸梗霉屬的微生物蛋白酶。本發(fā)明中對(duì)蛋白酶活性的測(cè)定如下?！稖y(cè)定蛋白酶活性的方法》在下列條件下，30'C—分鐘給出相應(yīng)于1jjg酪氨酸的顏色改變的蛋白酶活性被指定為1PU(蛋白水解單位)。<底物>0.6%乳酪蛋白(由Merck&Co.，Inc.生產(chǎn))<酶溶液>稀釋至10-20PU<酶稀釋溶液>20mM乙酸緩沖液(pH7.5)，lmM醋酸鉤，100mM氯化鈉〈反應(yīng)終止溶液X).11M三氯乙酸，0.22M醋酸鈉，0.33M乙酸<步驟>將蛋白酶溶液溶解于酶稀釋溶液中使其濃度為10-20PU/ml。取lml此溶液置于試管中并加熱到30°C。然后加入預(yù)熱至30'C的5ml底物溶液。正好10分鐘之后加入5ml反應(yīng)終止溶液以終止反應(yīng)。將混合物加熱到30。C維持30分鐘以使沉淀物沉積。通過Toyo濾器No.131(9cm)過濾混合物得到濾液。對(duì)于空白實(shí)驗(yàn)，在試管中將lml蛋白酶溶液加熱到30'C，加入5ml反應(yīng)終止溶液，然后再加入5ml底物溶液，之后以同樣的方法對(duì)沉淀物進(jìn)行沉積和過濾。向2ml濾出液中加入5ml的0.55M碳酸鈉溶液和lml稀釋3倍的福林試劑。30'C反應(yīng)30分鐘后，測(cè)定660nm的吸光度。通過從與酶反應(yīng)的樣品的吸光度中減去空白吸光度確定吸光度變化。然后利用單獨(dú)繪制的標(biāo)準(zhǔn)活性曲線確定酶活性。<標(biāo)準(zhǔn)活性曲線的繪制>將濃度調(diào)節(jié)成約50PU/ml的酶溶液進(jìn)行稀釋以制備系列放大稀釋的幾個(gè)酶溶液，濃度在2-50PU/ml。對(duì)每一種酶溶液執(zhí)行上述操作。沿縱軸繪制所得的吸光度變化，沿水平軸繪制稀釋倍數(shù)。另一方面，標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液(酪氨酸濃度9.09ug/ml)的制備是將L-酪氨酸溶于0.2N鹽酸溶液使其濃度為0.01%再將10ml的0.2N鹽酸溶液加入到lml的L-酪氨酸溶液中得到。對(duì)2ml標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液和2ml的0.2N鹽酸溶液執(zhí)行上述測(cè)量操作。所得的吸光度變化對(duì)應(yīng)于18.2jig的酪氨酸。將吸光度變化在上圖中繪出。從繪制點(diǎn)引出的垂直線與水平軸的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)10PU/ml。這些蛋白酶可以以在規(guī)定時(shí)段能夠有效消化革巴蛋白的任意濃度使用，例如通常為1-100，000PU/ml,優(yōu)選10-10，000PU/ml。對(duì)于可應(yīng)用于本發(fā)明中至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶，可選用能夠同含能夠通過蛋白酶的作用實(shí)質(zhì)上測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的任何酶。舉例來說，至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶可以是能夠與ot-氨基被糖化的氨基酸進(jìn)行有效反應(yīng)的酶，及能夠與s-氨基被糖化的氨基酸進(jìn)行有效反應(yīng)的酶，等等。作為能夠與s-氨基被糖化的氨基酸進(jìn)行有效反應(yīng)的所述至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的實(shí)例，有來自赤霉屬(Gibberella),曲霉屬，假絲酵母屬(Candida),青霉屬，鐮孢霉屬(Fusarium)，頂孢霉屬(Acremonium)或德巴利酵母屬(Debaryomyces)的微生物的FOD。作為能夠與a-氨基被糖化的氨基酸進(jìn)行有效反應(yīng)的所述至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的實(shí)例，有來自棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的微生物的酶。另外，作為在蛋白酶存在時(shí)活性充足并且制備成本低的酶的實(shí)例，可提及通過基因重組產(chǎn)生的酮胺氧化酶(R-FOD，由AsahiKasei公司生產(chǎn))和與糖化纈氨酸的反應(yīng)性極大降低的突變FOD(R-FQR-II,由Asahikasei公司生產(chǎn))。編碼來自尖鐮孢IFO-9972菌林(其能產(chǎn)生R-FOD-II)的FOD蛋白的DNA，可利用常規(guī)方法從尖鐮孢IFO-9972菌林中提取染色體DNA并利用PCR或雜交法分離出編碼FOD蛋白的DNA來獲得。為了將突變引進(jìn)所得的FOD基因中，可利用PCR法或定點(diǎn)誘變直接使DNA突變。如果利用隨機(jī)誘變，則可以將DNA修復(fù)缺陷型大腸桿菌用作宿主，也可以對(duì)引入了FOD基因的宿主微生物在含有DNA誘變?cè)吹呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。由此方法獲得的突變FOD基因可利用合適的宿主-載體系統(tǒng)引入宿主微生物。利用表達(dá)載體的標(biāo)記和FOD活性的表達(dá)或DNA探針作為指示對(duì)具有含F(xiàn)OD基因的重組DNA質(zhì)粒的微生物進(jìn)行篩選分離。通過培養(yǎng)基因重組微生物，從微生物中提取重組蛋白質(zhì)，并純化蛋白質(zhì)而獲得突變FOD。獲得突變FOD的一個(gè)具體方法如下所述。在以下步驟中，常規(guī)方法包括，例如，Maniatis等的方法(Maniatis，T.，等MolecularCloning(分子克隆)。ColdSpringHarborLabortory(冷泉港實(shí)驗(yàn)室)1982,1989)或在各種商品酶和試劑盒所附手冊(cè)中描述的方法。為了將突變引入分離出的FOD基因中，可在添加錳離子的條件下使用3'—5'修復(fù)缺陷聚合酶如Taq聚合酶進(jìn)行PCR?；蛘?，可以使用如下方法，即，將此FOD基因引入DNA修復(fù)缺陷的大腸桿菌宿主，在含有能引起基因突變的誘變?cè)慈缏?lián)二茴香胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主微生物，從產(chǎn)生的候選突變菌林中分離出獲得靶底物專一性的突變體。可通過雙脫氧法(Sangar，R(1981)Science(科學(xué))，214，1205-1210)測(cè)定引入突變的基因的堿基序列，對(duì)由上述方法引進(jìn)的FOD突變進(jìn)行驗(yàn)證。一旦突變已確定，還可以利用Zoller等的方法(Zoller，M.J.和Smith,M.(1983)，MethodsinEnzymology(酶學(xué)方法)，154，367)通過定向豫變引進(jìn)特異突變。從突變基因的堿基序列可確定形成突變FOD的多肽的氨基酸序列突變。可通過將突變FOD基因加到適當(dāng)宿主-載體系統(tǒng)中重組產(chǎn)生由上述方法獲得的突變FOD。對(duì)于突變FOD基因所摻入的載體，為基因重組用途從噬菌體或質(zhì)粒構(gòu)建出的能在宿主微生物中自主生長的載體是適用的。對(duì)于噬菌體載體，如以大腸桿菌微生物作為宿主微生物時(shí)，可利用如入gt.入C，入gt.入B等。對(duì)于質(zhì)粒載體，如以大腸桿菌作為宿主微生物，優(yōu)選利用如質(zhì)粒pBR322，pBR325，pACYC184，pUC12，pUC13，pUC18，pUC19,pUC118，pINI和BluescriptKS+;以枯草芽孢桿菌作為宿主樣吏生物時(shí)，可利用pUB110和pKH300PLK;以放線菌(Actinomyces)作為宿主微生物時(shí)，可利用pIJ680和pIJ702;以酵母，尤其釀酒酵母(Saccharomyces)作為宿主孩i生物時(shí)，可利用Yrp7,pYCl和Yep3。為了將突變FOD基因摻入如此獲得的載體中，載體和突變FOD基因都以適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行消化以便產(chǎn)生出相同末端，然后按照常規(guī)方法利用DNA連接酶使含有突變FOD基因的DNA片斷和載體片斷進(jìn)行連接。任何微生物都可以作為宿主微生物向其中轉(zhuǎn)入結(jié)合有突變FOD基因的載體，只要重組DNA能穩(wěn)定自主地生長即可。當(dāng)宿主微生物是屬于大腸桿菌的微生物時(shí)，可使用如大腸桿菌DH1，大腸桿菌JM109，大腸桿菌W3110，大腸桿菌C600等。當(dāng)宿主微生物是屬于枯草芽孢桿菌的微生物時(shí)，可使用枯草芽孢桿菌ISW1214等。當(dāng)宿主微生物是屬于放線菌的微生物時(shí)，可使用鉛青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)TK24等。當(dāng)宿主微生物是屬于釀酒酵母的微生物時(shí)，可使用釀酒酵母INVSC1等。對(duì)于將重組DNA摻入宿主微生物的方法，如宿主微生物屬于大腸桿菌、釀酒酵母或鉛青紫鏈霉菌，可例如按照常規(guī)方法將重組DNA轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)變成感受態(tài)細(xì)胞的宿主微生物中。根據(jù)不同菌林類型可使用電穿孔。為產(chǎn)生突變FOD，可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中對(duì)已經(jīng)引入突變FOD基因的宿主微生物進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)細(xì)胞，通過在適當(dāng)?shù)木彌_液中超聲粉碎或通過溶菌酶處理使細(xì)胞破碎以制備細(xì)胞提取物?？梢蕴砑有盘?hào)序列以引起分泌表達(dá)，這樣突變FOD將在培養(yǎng)液中積聚。可通過常規(guī)的硫酸銨沉淀，凝膠過濾，柱純化等方法分離純化由此產(chǎn)生的突變FOD并作為一種酶制品提供。在上述基因操作技術(shù)中一般按比例使用各組分，例如，對(duì)于源自微生物的0.1-10Mg的DNA和載體DNA，使用約1-10U的限制性內(nèi)切酶，約300U的連接酶，以及約1-10U其它酶。作為包含突變FOD基因并能夠產(chǎn)生突變FOD的轉(zhuǎn)基因微生物的具體實(shí)例，有大腸桿菌JM109pcmFOD3(FERMBP-7847)，即一種以大腸桿菌作為宿主微生物并具有包含突變FOD基因的質(zhì)粒pcmFOD3的轉(zhuǎn)基因微生物；大腸桿菌JM109'pcmFOD4，一種包含pcmFOD4的轉(zhuǎn)基因微生物；以及大腸桿菌JM109pcmFOD5(FERMBP-7848)，一種包含pcmFOD5的轉(zhuǎn)基因樣i生物。這些質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如附圖7所示。2001年1月16日大腸桿菌JM109pcmFOD3和大腸桿菌JM109.pcmFOD5由獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所國際專利生物保藏中"(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,anIndependentAdministrativeInstitution)(日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6，郵編305-8566(Central6，l畫l-lHigashi，Tsukuba畫shi，Ibaraki，日本))保藏，保藏號(hào)分別是FERMBP-7847和FERMBP-7848.在從轉(zhuǎn)基因孩史生物生產(chǎn)突變FOD時(shí)，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因微生物，以便在細(xì)胞或培養(yǎng)液中產(chǎn)生突變FOD，培養(yǎng)結(jié)束后通過過濾或離心培養(yǎng)液來收集細(xì)胞，經(jīng)過機(jī)械法或利用溶菌酶的酶法等石皮碎細(xì)胞，任選地通過加入EDTA和/或適當(dāng)表面活性劑對(duì)突變FOD的水溶液進(jìn)行濃縮，然后利用硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠過濾、吸附層析如親和層析或離子交換層析對(duì)濃縮物或非濃縮水溶液進(jìn)行純化，由此獲得高純度的突變FOD。對(duì)轉(zhuǎn)基因微生物的培養(yǎng)條件的選擇要考慮微生物的營養(yǎng)和生理特點(diǎn)。通常，液體培養(yǎng)條件可在許多情況下應(yīng)用。不過，深通氣攪拌有利于工業(yè)生產(chǎn)。就培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源來說，可利用常規(guī)應(yīng)用于微生物培養(yǎng)的營養(yǎng)源。任何可利用的碳?xì)浠衔锶缙咸烟牵崽?，乳糖，麥芽糖，果糖和糖蜜都可作為碳源。任何可利用的氮化合物如蛋白胨，肉膏，酵母提取物和酪蛋白水解物都可作為氮源。如需要，還可加入其它組分包括鹽類如磷酸，碳酸，硫酸的鹽，鎂鹽，鈣鹽，鉀鹽，鐵鹽，錳鹽和鋅鹽，特定氨基酸和特定維生素。培養(yǎng)溫度可在^:生物能進(jìn)行生長和產(chǎn)生突變FOD的范圍內(nèi)適當(dāng)變化。對(duì)大腸桿菌來說，優(yōu)選溫度范圍是大約20-42X:。雖然根據(jù)培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間可稍有差異，但可在突變FOD產(chǎn)量達(dá)到最大值的適當(dāng)時(shí)間終止培養(yǎng)。對(duì)大腸桿菌來說，培養(yǎng)時(shí)間通常是12-48小時(shí)。培養(yǎng)基的pH可在微生物能進(jìn)行生長和產(chǎn)生突變FOD的范圍內(nèi)適當(dāng)變化。對(duì)大腸桿菌來說，優(yōu)選pH范圍是大約6-8。培養(yǎng)基中的突變FOD可通過收集含有細(xì)胞的培養(yǎng)基就此進(jìn)行利用。然而一般來說，如果突變FOD存在于培養(yǎng)液中，則利用從微生物細(xì)胞中經(jīng)過濾或離心分離出的含突變FOD的溶液。如果突變FOD存在于細(xì)胞中，則通過過濾、離心或其它方法從所得培養(yǎng)液中收集細(xì)胞，然后任選地用機(jī)械法或利用溶菌酶的酶法等破碎細(xì)胞，再將突變FOD溶解于添加了螯合劑如EDTA和/或表面活性劑的水中以選擇和收集突變FOD的水溶液。可以通過減壓或膜過濾濃縮這樣獲得的含突變FOD的溶液，進(jìn)而通過硫酸銨，硫酸鈉等作鹽析處理以分級(jí)沉淀突變FOD。然后可將沉淀物溶于水中并用半透膜透析以去除低分子量的雜質(zhì)?；蛘?，可通過利用吸附劑、凝膠過濾劑等的凝膠過濾、吸附層析如親和層析或離子交換層析對(duì)含突變FOD的溶液進(jìn)行純化?？蓪?duì)經(jīng)這些方法得到的含突變FOD的溶液進(jìn)行減壓濃縮，冷凍干燥或其它加工以提供純化的突變FOD。利用如下方法測(cè)定與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的活性。《測(cè)定與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的活性的方法》<反應(yīng)溶液的組成>50mMTris緩沖液(pH7.5)0.03%4-氨基安替比林(4-AA)(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))0.02%苯酚(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))4.5U/ml過氧化物酶(POD)(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))l.OmMoc-芐酯基-s-D-l-脫氧-果糖基賴氨酸或l-脫氧-果糖基纈氨酸(根據(jù)Hashiba等的方法(Hashiba,H.等，J.Agric.FoodChem.，24;70,1976)進(jìn)行合成和純化。以下分別筒稱"ZFL"和"FV")。將1ml上述反應(yīng)溶液置于一個(gè)小試管中37X:預(yù)熱5分鐘，然后加入0.02ml適當(dāng)稀釋的酶溶液。攪拌混合物以引發(fā)反應(yīng)。反應(yīng)正好10分鐘之后，加入2ml的0.5%SDS以終止反應(yīng)。測(cè)定500nm波長下的吸光度(As)。作為空白實(shí)驗(yàn)，用0.02ml蒸餾水代替酶溶液進(jìn)行同樣操作以測(cè)定吸光度(Ab)。從酶反應(yīng)后的吸光度(As)和空白實(shí)驗(yàn)的吸光度(Ab)的差值(As-Ab)確定酶活性。預(yù)先可利用過氧化氫的標(biāo)準(zhǔn)溶液確定吸光度和所產(chǎn)生的過氧化氫的相關(guān)性。在37。C一分鐘內(nèi)能產(chǎn)生l]amol過氧化氫的酶量被定義為1U。計(jì)算表達(dá)式如下所示。酶活性(U/ml)=[(As—Ab)/12.0]x[3.02/0.02]x1/101x[2/B3.02:反應(yīng)溶液總量(ml)0.02:酶溶液總量(ml)10:反應(yīng)時(shí)間2:表示從兩個(gè)過氧化氫分子使4-AA和苯酚縮和產(chǎn)生1分子有色物質(zhì)的系數(shù)12.0:4-AA-苯酚的毫摩爾吸光系數(shù)B:酶溶液的稀釋^L大倍數(shù)經(jīng)上述方法得到的突變FOD中，其中SEQIDNo.l所示的氨基^列中第372位賴氨酸被色氨酸替代的突變FOD具有下列酶學(xué)性質(zhì)。(1)底物專一性ZFL100%FV0%(2)酶反應(yīng)該酶反應(yīng)至少催化oc-氨基酸或s-氨基酸的阿馬多瑞氏(amadori)化合物分解以產(chǎn)生葡糖醛酮、過氧化氫以及相應(yīng)的oc-氨基酸或s-氨基酸，如下列反應(yīng)式所示。l-脫氧-果糖基氨基酸+02o葡糖醛酮+L-氨基酸+H202(3)分子量利用SephadexG-100和含有0.2MNaCl的0.1M礴酸緩沖液(pH7.0)洗脫液通過柱凝膠過濾法測(cè)定的酶分子量是48,000±2，000。利用SDS-PAGE所得的結(jié)果是47,000±2,000。(4)等電點(diǎn)在以兩性電解質(zhì)為載體的聚焦電泳中4'C下加載700V衡壓保持40小時(shí)對(duì)酶進(jìn)行分級(jí)分離，然后測(cè)定每一級(jí)分的酶活性，由此確定的等電點(diǎn)是pH4.3±0.2。(5)Km值通過在含有50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5),0.03%的4-AA，0.02%苯酚和4.5U/ml過氧化物酶的反應(yīng)溶液中改變ZFL濃度而測(cè)定的合成底物ZFL的Km值是3.4mM。(6)最適pH值按照上述測(cè)定酶活性的方法，但將lOOmM乙酸緩沖液(pH4.4-5.4)、磷酸緩沖液(pH5.6-7.9)Tris-Hcl緩沖液(pH7.3-8.5)或甘氨酸-氬氧化鈉緩沖液(pH8.0-10.3)替代50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)用于反應(yīng)溶液以測(cè)定酶活性。結(jié)果，酶在pH7.5顯示出最大活性。(7)pH穩(wěn)定性將0.5ml含0.5U酶的以0.5M濃度用于測(cè)定最適pH的各種緩沖液，在40。C下孵育IO分鐘，然后按照下面說明的活性測(cè)定方法測(cè)定殘余活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在pH7.0-9.0酶保持了80%或更多活性。(8)熱穩(wěn)定性利用0.2Mtris-HCl緩沖液(pH7.5)制備0.5U酶溶液并加熱10分鐘，然后按照活性測(cè)定方法測(cè)定殘余活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不超過40。C酶保持950/q或更多活性。(9)最適溫度按照活性測(cè)定方法利用40mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)在不同溫度下對(duì)酶進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)10分鐘之后，加入2ml的0.5%十二烷基硫酸鈉(此下稱為"SDS")以終止反應(yīng)。測(cè)定500nm下的吸光度(As)。結(jié)果，酶在50。C下顯示出最大活性。接下來，將討論在用與糖化纈氨酸反應(yīng)性明顯減少的突變FOD消除樣品溶液中的糖化賴氨酸之后，利用與糖化纈氨酸具有反應(yīng)性的FOD測(cè)定樣品中糖化纈氨酸的方法，所述突變FOD通過用另一個(gè)氨基酸替代SEQIDNo.l所示氨基酸序列中的第372位賴氨酸獲得。任何與糖化纈氨酸不具有反應(yīng)性的FOD都可以用于消除樣品溶液中的糖化賴氨酸。例如，可利用通過以另一個(gè)氨基酸替代SEQIDNo.l所示氨基酸序列中的第372位賴氨酸所獲得的、與糖化纈氨酸反應(yīng)性明顯減少的突變FOD。在突變FOD中，優(yōu)選使用SEQIDNo.l所示氨基酸序列中第372位賴氨酸被色氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸中的任一個(gè)所替代的突變FOD。添加到反應(yīng)溶液中的酶量可以是足夠消除樣品溶液中糖化賴氨酸的量，如0.5-200U/ml,更優(yōu)選1-50U/ml。對(duì)用于測(cè)定糖化纈氨酸的FOD沒有限制，只要此FOD能與糖化纈氨酸進(jìn)行反應(yīng)即可。例如，可利用尖鐮孢IFO-9972菌林的FOD。添加到反應(yīng)溶液中的酶量可以是足夠測(cè)定樣品溶液中糖化纈氨酸的量，如0.5-200U/ml，更優(yōu)選1-50U/ml。一個(gè)具體的測(cè)定方法包括在第一反應(yīng)中使含糖化賴氨酸和糖化纈氨酸的樣品溶液中的糖化賴氨酸與突變FOD進(jìn)行反應(yīng)，以過氧化氬酶等分解在反應(yīng)中產(chǎn)生的過氧化氫，使在第二反應(yīng)中通過樣品溶液內(nèi)的糖化纈氨酸與FOD的反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫與4-氨基安替比林(4-AA)和Trinder試劑反應(yīng)，并用比色法測(cè)定產(chǎn)生的顏色?？梢栽诘诙磻?yīng)溶液中加入過氧化氫酶抑制劑疊氮化鈉。對(duì)于可用于本發(fā)明中精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的對(duì)球蛋白組分具有選擇性的蛋白酶抑制劑，任何對(duì)球蛋白組分具有選擇性的抑制劑都可利用，只要在此球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑存在下，當(dāng)樣品溶液與蛋白酶反應(yīng)時(shí)此抑制劑能夠引起主要對(duì)非球蛋白組分的其它蛋白質(zhì)的消化即可。優(yōu)選的實(shí)例有脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽，季銨鹽型陽離子表面活性劑，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷和甜菜堿。作為脫氧膽酰胺，舉例來說，優(yōu)選N,N-二(3-D-葡糖酰氨基丙基)脫氧膽酰胺。作為膽酰胺，舉例來說，優(yōu)選3-[(3-膽酰氨基丙基)二曱基銨-2-羥基丙磺酸，3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨丙磺酸，N，N-二(3-D-葡糖酰氨基丙基)膽酰胺等。作為季銨鹽，舉例來說，優(yōu)選氯化節(jié)基三乙基銨和氯化節(jié)基三正丁基銨。作為季銨鹽型陽離子表面活性劑，舉例來說，優(yōu)選氯化月桂基三甲基銨和月桂基二曱基胺氧化物。這些具有球蛋白組分選擇性的抑制劑既可以單獨(dú)使用，也可以兩種或多種聯(lián)合使用。這些具有球蛋白組分選擇性的抑制劑可以以能夠在反應(yīng)中充分抑制蛋白酶與球蛋白組分的反應(yīng)的量使用。如果利用脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，辛基葡糖苷，季銨鹽或季銨鹽型陽離子表面活性劑，優(yōu)選的濃度為大約0.01-20%，更優(yōu)選的濃度范圍為0.05-10%。濃度也可在這些范圍之外。如果使用伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷或甜菜堿，例如，可應(yīng)用的濃度分別為大約0.01-10mg/ml或0.005-5%，優(yōu)選濃度范圍分別為0.02-2mg/ml或0.05-10%。此范圍外的濃度也可使用。就用于本發(fā)明中精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的ASOx來說，任何能夠有效地與包含在樣品溶液中的抗壞血酸進(jìn)行反應(yīng)的酶都可利用。實(shí)例有來自植物或微生物等的ASOx。下文給出具體實(shí)例，但是這些實(shí)例并不表示限定可用于本發(fā)明的酶。植物來源的ASOx有例如，黃瓜來源的ASOx(由AmanoEnzymeInc.或ToyoboCo.，Ltd.生產(chǎn))和南瓜來源的ASOx(由RocheCo.或ToyoboCo"Ltd.生產(chǎn))微生物來源的ASOx有例如，頂孢霉屬(Acremonium)來源的ASOx(由AsahiKasd公司生產(chǎn))和源于一種微生物的ASOx(由AmanoEnzymeInc.生產(chǎn))。通過以下方法測(cè)定ASOx酶活性?！稖y(cè)定ASOx酶活性的方法》<貯存底物溶液>將176mg的L-抗壞血酸(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))和37mgEDTA(由DaiichiPureChemicalsCo.Ltd.生產(chǎn))溶解于100ml的lmM鹽酸中。<混合反應(yīng)試劑>利用包含0.45mMEDTA的90mM磷酸氫二鉀-5mM磷酸二氫鈉緩沖液將上述貯存底物溶液稀釋20倍。<步驟>將lml上述混合反應(yīng)試劑置于一個(gè)小試管中30。C預(yù)熱5分鐘，然后加入O.lOml適當(dāng)稀釋的酶溶液。攪拌混合物以起始反應(yīng)。反應(yīng)正好5分鐘后，加入3.0ml的0.2N鹽酸水溶液以終止反應(yīng)。測(cè)定245nm波長下的吸光度(As)。對(duì)于空白實(shí)驗(yàn)，將lml上述反應(yīng)溶液置于一個(gè)小試管中30"C預(yù)熱5分鐘，然后加入3.0ml的0.2N鹽酸水溶液以終止反應(yīng)。加入0.10ml適當(dāng)稀釋的酶溶液并對(duì)混合物進(jìn)行攪拌以測(cè)定245nm波長下的吸光度(Ab)。從酶反應(yīng)之后的吸光度(As)和空白實(shí)驗(yàn)的吸光度(Ab)之間的差值(As-Ab)確定酶活性。30。C下一分鐘將1Himol抗壞血酸氧化成脫氫抗壞血酸的酶量被定義為1U。計(jì)算表達(dá)示如下所示?；钚?U/ml)=[(As-Ab)/10.0x[1/5x[4.10/0.10Jx岡10.0:在pH1.0的條件下抗壞血酸的245nm分子吸光系數(shù)(mM)。5:反應(yīng)時(shí)間(min)4.10:反應(yīng)溶液總量(ml)0.10:用于反應(yīng)的酶樣品溶液的量B:酶溶液的稀釋放大倍數(shù)?？梢允褂萌魏螡舛鹊腁SOx，只要在此濃度下當(dāng)?shù)鞍酌负虯SOx同時(shí)存在時(shí)可使用試劑將足夠量的抗壞血酸去除即可，例如通常為0.1-100U/ml，優(yōu)選1-50U/ml的濃度。對(duì)于能夠與ASOx組合用于根據(jù)本發(fā)明精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的不具有4-(2-羥乙基)-l-哌溱基基團(tuán)的緩沖試劑，可使用任何能在ASOx與蛋白酶共存時(shí)使ASOx保持穩(wěn)定的緩沖試劑。除那些具有4-(2-羥乙基)-l-哌嗪基的緩沖試劑如3-[4-(2-羥乙基)-l-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)，2-[4-(2-羥乙基)-l-哌溱基乙磺酸(HEPES)，和2-羥基-3-[4-(2-羥乙基)-l-哌溱基]丙磺酸(HEPPSO)之外的任何緩沖試劑都可使用。其它優(yōu)選的緩沖試劑的實(shí)例包括N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)，N-(2-乙酰胺)亞氨二乙酸(ADA),N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES),N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)，二(2-羥乙基)亞氨三(羥甲基)甲烷(Bis-Tris)，N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)，N-環(huán)己基-2-羥基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)，N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES),3-[N，N-二(2-羥乙基)氨基j-2-幾基丙磺酸(DIPSO)，2-嗎啉代乙磺酸(MES)，3-嗎啉代丙磺酸(MOPS)，2-羥基-3-嗎啉代丙磺酸(MOPSO)，哌溱-1，4-二(2-乙磺酸)(PIPES),哌溱-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)，N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)，2-羥基-N-三(羥曱基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)，N-三(羥甲基)甲基-2-氨基丙磺酸(TES)，N-三(羥曱基)曱基甘氨酸(Tricine)，和三羥曱基氨基甲烷(Tris)。最優(yōu)選的緩沖劑有例如，三羥曱基氨基曱烷(Tris)和p/艮、秦-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)。對(duì)于這些能夠與ASOx組合使用的緩沖試劑，可以以在蛋白酶存在時(shí)能保持ASOx穩(wěn)定并且不影響蛋白酶和ASOx的反應(yīng)的任意濃度進(jìn)行利用，例如，通常為lmM至lM，優(yōu)選5mM至500mM。對(duì)于本發(fā)明用于精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的清蛋白變性劑和/或具有S—S鍵的化合物，可使用任何一種使BCP對(duì)GA和NGA的反應(yīng)性相同的化合物。蛋白質(zhì)變性劑的實(shí)例有尿素，胍類化合物和陰離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)，聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽，聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽，和烷基苯磺酸鹽。這些蛋白質(zhì)變性劑既可以單獨(dú)使用也可以兩種或多種聯(lián)合使用。對(duì)于這些蛋白質(zhì)變性劑，可利用能使BCP等同地與GA和NGA反應(yīng)的任意濃度，例如通常為0.01-10%,優(yōu)選0.05-5%。優(yōu)選的具有S-S鍵的化合物的實(shí)例有6，6'-二硫代二煙酸，3,3'-二硫代二丙酸，2，2，-二硫代二安息香酸，4，4'-二硫代二嗎啉，2，2'-二羥基-6，6，-二萘二石克(DDD)，2，2'-二硫代吡咬(2-PDS)，4，4'-二硫代吡咬(4-PDS)，5，5'-二硫代二-(2-硝基安息香酸)(DTNB),和2，2'-二硫代二-(5國硝基吡啶)。對(duì)于具有S-S鍵的這些化合物，可利用能使BCP等同地與GA和NGA反應(yīng)的任意濃度，例如，通常為lfiM至10mM，優(yōu)選10nM至5mM。決不排除此范圍之外的濃度。對(duì)于本發(fā)明用于精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定劑，可利用在貯藏試劑時(shí)能夠抑制蛋白酶活性減少的任何化合物。特別優(yōu)選的是在液態(tài)試劑貯藏過程中能夠抑制蛋白酶活性減少的化合物。優(yōu)選的穩(wěn)定劑的實(shí)例有，例如二曱基亞砜，醇類，水溶性鉀鹽，氯化鈉，季銨鹽，季銨鹽型陽離子表面活性劑。醇類的實(shí)例有乙醇，丙醇，乙二醇和甘油。季銨鹽及季銨鹽型陽離子表面活性劑的實(shí)例有十二烷基硫酸三乙醇胺，氯化十二烷基三甲基銨等。這些蛋白酶穩(wěn)定劑可以以任何濃度進(jìn)行使用，只要在試劑貯存過程中其能夠抑制蛋白酶活性減少即可，尤其是在液態(tài)試劑貯藏中能夠抑制蛋白酶活性減少的濃度。通常利用0.01-30%的濃度，優(yōu)選O.l-20%的濃度。不排除此范圍之外的濃度。對(duì)于本發(fā)明用于精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定劑，可利用在試劑貯藏中能夠抑制此至少與糖化氨基1良應(yīng)的酶的活性減少的任何化合物。特別優(yōu)選的是在液態(tài)試劑貯藏中能夠抑制該酶活性減少的化合物。優(yōu)選的此類穩(wěn)定劑有例如，糖醇，蔗糖，水溶性鎂鹽，水溶性鉤鹽，硫酸銨，氨基酸和肌氨酸。糖醇的實(shí)例有山梨糖醇，甘露醇，海藻糖和甘油。雖然所有氨基酸都顯示出強(qiáng)穩(wěn)定效果，但優(yōu)選的氨基酸是脯氨酸，谷氨酸，丙氨酸，纈氨酸，甘氨基，賴氨酸等。這些至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定劑可以以任何濃度進(jìn)行使用，只要在試劑貯藏中能夠抑制此至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的活性減少即可。特別優(yōu)選的是在液態(tài)試劑貯藏中能夠抑制該酶活性減少的濃度。穩(wěn)定劑如果是糖醇，蔗糖，氨基酸或肌氨酸，則通常使用0.01-30%的濃度，優(yōu)選0.1-20%的濃度。穩(wěn)定劑如果是水溶性鎂鹽，水溶性釣鹽或硫酸銨，則使用lmM到1M的濃度，優(yōu)選10mM到500mM的濃度。不排除這些范圍外的濃度。在制備用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的本發(fā)明組合物時(shí)，可將蛋白水解試劑(包括蛋白酶)和用于測(cè)定所產(chǎn)生的糖化氨基酸或肽的糖化氨基酸檢測(cè)試劑適當(dāng)組合以便使這些試劑可在同一反應(yīng)容器中使用。這些試劑可以以液態(tài)產(chǎn)品，冰凍產(chǎn)品或冷凍干燥產(chǎn)品形式提供。在制備用于本發(fā)明的蛋白水解試劑時(shí)，對(duì)pH、緩沖劑以及蛋白酶濃度進(jìn)行確定以便使蛋白水解反應(yīng)能夠有效進(jìn)行。然后，適當(dāng)?shù)刂苽渚哂星虻鞍捉M分選擇性的蛋白酶抑制劑、ASOx和蛋白酶穩(wěn)定劑并加到上述的有效濃度。舉例來說，如果使用XXIV-型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))，由于蛋白酶在pH7-10附近顯示出強(qiáng)的蛋白水解活性所以可選擇在pH7-10反應(yīng)。就緩沖液來說，可利用不具有4-(2-羥乙基)-l-哌嚷基的緩沖劑的溶液，例如，在pH7.2-8.5范圍內(nèi)具有緩沖作用的POPSO緩沖液，POPSO的濃度可為1-lOOmM，優(yōu)選10-500mM?？衫玫牡鞍酌笣舛仁悄軌蛟趯?shí)際應(yīng)用的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)使樣品中的糖化蛋白質(zhì)充分分解的濃度，優(yōu)選100-500，000PU/ml，更優(yōu)選500-100，000PU/ml。對(duì)于具有球蛋白組分選擇性的蛋白酶抑制劑、ASOx和蛋白酶穩(wěn)定劑的組合，例如可利用由0.01-20%并優(yōu)選0.05-10%的3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨丙磺酸作為球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑、0.1-100U/ml并優(yōu)選l-50U/ml的南瓜抗壞血酸氧化酶(由ToyoboCo.Ltd.生產(chǎn))、以及0.01-30%，優(yōu)選0.1-20%的二甲基亞砜作為蛋白酶穩(wěn)定劑所形成的組合。為了配制用于本發(fā)明測(cè)定糖化氨基酸的試劑，可從確保所利用的至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶能進(jìn)行有效反應(yīng)的最適pH出發(fā)選擇適當(dāng)?shù)膒H，并確定與糖化氨基酸反應(yīng)的酶量，然后加入至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定劑。舉例來說，如果利用R-FOD或R-FOD-II(由AsahiKasei公司生產(chǎn))，由于這些蛋白酶在pH6.5-10的寬范圍內(nèi)顯示出其最大活性的50%或更多，所以可選在pH6.5-10進(jìn)行反應(yīng)。酶的使用濃度可為能夠充分檢測(cè)出所用反應(yīng)溶液中的糖化氨基酸的濃度，優(yōu)選0.5-200U/ml的濃度，并更優(yōu)選l-50U/ml的濃度。舉例來說，谷氨酸可在0,01-30%并優(yōu)選0.1-20%濃度下用作至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定劑。在配制包含至少與糖化氨基M應(yīng)的酶(作為第一試劑)和蛋白酶(作為第二試劑)的組合物時(shí)，可利用任何條件，但第一試劑中的條件如pH，鹽濃度等需使蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶可顯示出活性，而第二試劑中的條件應(yīng)適宜蛋白酶的貯藏。例如，當(dāng)利用R-FOD和XXIV型蛋白酶時(shí)，由于這些酶具有的特定活性pH范圍分別為6.5-10和7-10，所以第一試劑選擇pH7-10，并選擇具有相對(duì)高濃度如20-l，OOOmM的緩沖劑。另一方面，由于此蛋白酶在pH7或更低時(shí)是穩(wěn)定的，因此第二試劑選擇的pH是7或更低，同時(shí)選擇濃度相對(duì)低于第一試劑所用濃度的緩沖劑，如在l-50mM范圍。此外，還優(yōu)選加入蛋白酶穩(wěn)定劑，如大約1-50%二甲基亞砜。在此情況下，如果第一試劑的使用量大于第二試劑，例如第一試劑對(duì)第二試劑的比率為4:1，則可將較高濃度的穩(wěn)定劑加到第二試劑中，并且對(duì)于其它條件如pH，第二個(gè)試劑可選用大幅度偏離第一試劑的條件的條件。在配制根據(jù)本發(fā)明測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的酶反應(yīng)組合物時(shí)，可適當(dāng)?shù)剡x擇和添加表面活性劑，鹽類，緩沖劑，pH調(diào)節(jié)劑，防腐劑等。作為表面活性劑，如聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚乙烯醇等可加入0.01-10%，優(yōu)選0.05-5%的量。作為鹽類，如氯化鋰，氯化鈉，氯化鉀，氯化錳，氯化鈷，氯化鋅，氯化鈣等可加入lmM到5M，優(yōu)選10mM到lM的量。各種緩沖液如Tris-HCl緩沖液，甘氨酸-NaOH緩沖液，磷酸緩沖液，良好(Good)緩沖液等可加入10mM到2M，優(yōu)選20mM到1M的量。各種防腐劑如疊氮化鈉可適當(dāng)?shù)丶尤?.01-10%，優(yōu)選0.05-1%的量。在利用本發(fā)明方法測(cè)定糖化蛋白質(zhì)時(shí)，將0.001-0.5ml的樣品加到用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的本發(fā)明組合物中并在37。C下進(jìn)行反應(yīng)。如果使用速率測(cè)定技術(shù)，可直接或間接地利用上述方法在反應(yīng)開始后兩個(gè)指定時(shí)間點(diǎn)間的幾分鐘到幾十分鐘的一個(gè)時(shí)段內(nèi)，例如在反應(yīng)開始三分鐘后和四分鐘后之間的一分鐘，或在反應(yīng)開始三分鐘后和八分鐘后之間的五分鐘內(nèi)對(duì)輔酶、溶解氧、過氧化氫或其它反應(yīng)產(chǎn)物的量的變化進(jìn)行測(cè)定。如果使用終點(diǎn)測(cè)定技術(shù)，可利用同種方式在反應(yīng)開始后某個(gè)時(shí)段內(nèi)對(duì)輔酶、溶解氧、過氧化氫或其它反應(yīng)產(chǎn)物的量的變化進(jìn)行測(cè)定。在此時(shí)，可通過將吸光度等的變化與所測(cè)定的具已知糖化蛋白質(zhì)濃度的樣品的值進(jìn)行比較，確定樣品中糖化蛋白質(zhì)的量。可以對(duì)應(yīng)用于本發(fā)明的能至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶所進(jìn)行的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，舉例來說，如果使用脫氫酶，可直接測(cè)定輔酶量的變化或通過利用電子載體如各種硫辛酰胺脫氫酶或吩溱硫酸甲酯及還原型顯色劑如以硝基四唑，WST-1或WST-8為代表的四唑鹽(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))間接測(cè)定所形成的還原性輔酶。還可利用其它已知的直接或間接測(cè)定方法。如果使用氧化酶，舉例來說，優(yōu)選測(cè)定氧消耗量或反應(yīng)產(chǎn)物的量。例如，如果使用R-FOD，產(chǎn)生過氧化氫和葡糖醛酮作為反應(yīng)產(chǎn)物。可通過已知方法對(duì)過氧化氫和葡糖醛酮進(jìn)行直接或間接地分析。過氧化氫量可以，例如，通過利用過氧化物酶等產(chǎn)生顯色物質(zhì)并測(cè)定顏色、發(fā)射光或熒光強(qiáng)度，通過電化學(xué)技術(shù)，或通過利用過氧化氬酶從醇產(chǎn)生醛并測(cè)定所產(chǎn)生的醛的量進(jìn)^f于確定。對(duì)于從過氧化氫產(chǎn)生顯色物質(zhì)來說，可利用能夠在過氧化物酶存在時(shí)通過偶合劑如4-AA或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和生色原如苯酚的氧化縮合產(chǎn)生顯色物質(zhì)的Trinder試劑，能夠在過氧化物酶存在時(shí)直接被氧化并產(chǎn)生顏色的Leuko-型試劑，等。作為Trinder試劑的生色原，可利用苯酚衍生物，苯胺衍生物，甲苯胺衍生物等。具體來說，有N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間-甲苯胺(TOOS),N，N-二(4-磺丙基)-3-甲基苯胺二鈉(TODB)(二者皆由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))，等。Leuko-型試劑的具體實(shí)例有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)-聯(lián)苯胺(DA64),10-(羧曱基氨基羰基)-3，7-二(二曱基氨基)吩噻漆(DA67X二者皆由WakoPurechemicalIndustries有限公司生產(chǎn))，等。經(jīng)氧化發(fā)射熒光的化合物如高香草酸和4-羥基苯乙酸可用于熒光方法。對(duì)于化學(xué)發(fā)光方法來說，魯米諾、光澤精，異魯米諾等可用作催化劑。如果利用電極測(cè)定過氧化氫，對(duì)所用電極沒有特殊限制只要電極是由能與過氧化氫交換電子的材料制成即可，例如鈿，金和銀?？衫贸Ｒ?guī)電極方法如電流測(cè)定法，電勢(shì)測(cè)定法和電量分析法?？梢栽陔姌O和氧化酶或底物之間提供電子栽體以便測(cè)定所產(chǎn)生的氧化或還原電流或電量。任何可表現(xiàn)出電子轉(zhuǎn)移功能的材料都可作為電子栽體，舉例來說有二茂鐵衍生物和醌衍生物。還可以在電極和經(jīng)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫之間提供電子載體以便測(cè)定所產(chǎn)生的氧化或還原電流或電量。當(dāng)糖化蛋白是糖化清蛋白并且必須精確測(cè)定出糖化清蛋白的量時(shí)，任何含有蛋白質(zhì)變性劑和/或具有S-S鍵化合物和溴曱酚紫的清蛋白檢測(cè)試劑都能用于本發(fā)明，只要此試劑在GA和NGA之間不產(chǎn)生偏差。例如，如果十二烷基硫酸鈉和5，5'-二硫代二(2-硝基安息香酸)被用作蛋白質(zhì)變性劑和/或具有S-S鍵的化合物，則使用不影響B(tài)PC顯色的低濃度如1-20mM的緩沖液，其中十二烷基硫酸鈉所用的濃度為0.01-10%,優(yōu)選0.05-5%,5，5，-二硫代二(2-硝基安息香酸)所用的濃度為l^iM到10mM，優(yōu)選10fiM到5mM。由于BCP在高于中性的pH明顯地發(fā)生顯色，所以在pH4.5-7,5下利用BCP。在利用本發(fā)明的方法測(cè)定清蛋白中，將0.001-0,5ml的樣品加到用于測(cè)定清蛋白的本發(fā)明組合物中并在37。C進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)開始后的一段指定時(shí)間內(nèi)顯色物質(zhì)的量可通過一點(diǎn)分析(onepointassay)的方法進(jìn)行測(cè)定。由于清蛋白-BCP在600nm附近具有最大吸光度，所以測(cè)定550-630nm附近的吸光度。在此情況下，樣品中清蛋白的量還可通過與使用具已知清蛋白濃度的樣品測(cè)定的吸光度和空白(水)的吸光度進(jìn)行比較來確定。任何含有至少糖化蛋白的樣品都可作為本發(fā)明的檢測(cè)對(duì)象。優(yōu)選的樣品包括血液組分如血清，血漿，血細(xì)胞，和全血。此外，分離出的紅細(xì)胞也可用作優(yōu)選樣品，因?yàn)楦鶕?jù)不同分離條件，分離出的紅細(xì)胞樣品可能含有能影響檢測(cè)結(jié)果的球蛋白組分。GA和GHb，但不限于這些蛋白，任何糖化蛋白都可進(jìn)行測(cè)定。附圖簡(jiǎn)述圖1表示的是本發(fā)明實(shí)施例4中HSA底物溶液(4g/dl)，，球蛋白底物溶液，和球蛋白IV底物溶液的測(cè)量曲線和再現(xiàn)性。圖2表示的是本發(fā)明實(shí)施例5中Hb底物溶液(4g/dl)，，球蛋白底物溶液，和球蛋白IV底物溶液的測(cè)量曲線和再現(xiàn)性。圖3表示的是經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例6中的實(shí)驗(yàn)得到的糖化清蛋白的測(cè)量曲線。圖4表示的是本發(fā)明實(shí)施例9中不同類型緩沖劑對(duì)用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物中的抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定作用。圖5表示的是本發(fā)明實(shí)施例11中不同類型穩(wěn)定劑對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定作用。圖6表示的是本發(fā)明實(shí)施例12中不同類型穩(wěn)定劑對(duì)至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定作用。圖7表示本發(fā)明實(shí)施例20中質(zhì)粒pcmFODl到pcmFOD5的共有結(jié)構(gòu)。圖8表示的是本發(fā)明實(shí)施例21中對(duì)被突變果糖基氨基酸氧化酶除去糖化賴氨酸的反應(yīng)液和未進(jìn)行去除處理的反應(yīng)液中的糖化纈氨酸濃度進(jìn)行測(cè)量時(shí)在波長555nm下的吸光度測(cè)量結(jié)果。圖9表示的是本發(fā)明實(shí)施例22中酶學(xué)方法和HPLC方法在糖化清蛋白測(cè)量結(jié)果上的相關(guān)性。圖IO表示的是本發(fā)明實(shí)施例23中糖化蛋白測(cè)定試劑的反應(yīng)曲線。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將通過下列實(shí)施例進(jìn)行闡述，但不意謂限制本發(fā)明。實(shí)施例1為篩選出不與球蛋白組分反應(yīng)的蛋白酶，利用R-FOD(由AsahiKasei公司生產(chǎn))對(duì)由蛋白酶與清蛋白、球蛋白組分以及血紅蛋白反應(yīng)所產(chǎn)生的糖化氨基酸或糖化肽進(jìn)行測(cè)定。<底物溶液>1、HSA底物溶液；人清蛋白；基本無球蛋白；25mg/ml,GA%-31.9%，果糖胺(FRA)值-256nmo1/1(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))；底物溶液中的清蛋白濃度利用清蛋白檢測(cè)試劑盒(清蛋白II-HA檢測(cè)盒Wako;由WakoPureChemicalIndustries有P艮公司生產(chǎn))進(jìn)行測(cè)定。GA%利用糖化清蛋白分析儀(GAA-2000,由ARKRAY公司生產(chǎn))進(jìn)行測(cè)定。2、G-II和III底物溶液，F(xiàn)RA值=48nmol/l[人球蛋白Cohn級(jí)分II和III;16.9mg/ml(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))。3、G-IV底物溶液，F(xiàn)RA值=26nmol/l[人球蛋白Cohn級(jí)分IV;6mg/ml(由Sigma一Aldrich公司生產(chǎn))。4、G-I底物溶液，F(xiàn)RA值=77jimo1/GloveninI:免疫球蛋白制品(由TakedaChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))。5、Hb底物溶液人血紅蛋白；55mg/ml，糖化血紅蛋白比率HbAlc=4.5%[由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)，HbAlc值利用糖化血紅蛋白分析儀(Hi-AUTOA1CHA-8150，由ARKRAY公司生產(chǎn))測(cè)定。底物溶液的果糖胺值利用果糖胺分析盒(Autowako果糖胺，由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))進(jìn)行測(cè)定。<制備蛋白酶反應(yīng)溶液>將200ftl非Hb的底物溶液、40jil的100mg/ml蛋白酶溶液(如果不能制備出濃度100mg/ml的溶液，溶液濃度盡可能接近100mg/ml，或者如果其是液體則使用原樣濃度)和10^1的1MTris緩沖液(pH8)充分混合并在37。C反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)溶液經(jīng)10,000NMWL膜(UltrafreeMC，由Millipore公司生產(chǎn))進(jìn)行過濾。將濾液作為蛋白酶反應(yīng)樣品。利用蒸餾水替代底物執(zhí)行同樣操作以制備空白樣品。對(duì)Hb底物溶液來說，150^1的底物溶液、60jil的200mg/ml蛋白酶溶液(如果不能制備出濃度200mg/ml的溶液，溶液濃度盡可能接近200mg/ml，或者如果其是液體則使用原樣濃度)和5fU的1MTris緩沖液(pH8)充分混合并在37。C反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)溶液經(jīng)10,000NMWL膜(UltrafreeMC，由Millipore公司生產(chǎn))進(jìn)行過濾。將濾液作為蛋白酶反應(yīng)樣品。利用蒸餾水替代底物執(zhí)行同樣操作以制備空白樣品。<測(cè)定蛋白酶反應(yīng)樣品中的糖化氨基酸和糖化肽><反應(yīng)溶液組成>50mMTris緩沖液(pH8.0)0.02%4-AA(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))0.02%N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間-甲苯胺(TOOS)(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))2U/mlR-FOD(由AsahiKasei公司生產(chǎn))5U/mlPOD(由Sigma—Aldrich公司生產(chǎn))<反應(yīng)步驟>將300jil上述用于測(cè)定糖化氨基酸的反應(yīng)溶液加到測(cè)定池中并在37。C保溫3分鐘。測(cè)定555nm的吸光度(Ao)。然后將蛋白酶反應(yīng)樣品加進(jìn)測(cè)定池并在37。C保溫5分鐘。測(cè)定555nm的吸光度(At)。利用空白樣品替代蛋白酶反應(yīng)樣品對(duì)其執(zhí)行同樣操作。測(cè)定吸光度(Ao空白和A，空白)。蛋白酶與糖化蛋白質(zhì)的反應(yīng)由下列吸光度變化指示。AA=(A廣A0)一(Ai空白-Ao空白)在pH8.0典型蛋白酶與清蛋白、球蛋白和血紅蛋白的反應(yīng)性(AA)如表1所示。表l各種蛋白酶作用于各種蛋白的活性(單位mAb)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在球蛋白組分中，表1記述的只是G-I底物溶液的結(jié)果，這是因?yàn)樗械鞍酌概cG-IV底物溶液中的糖化蛋白質(zhì)沒有反應(yīng)或只有極小反應(yīng)，并且G-II和G-III底物溶液的測(cè)定值與G-I底物溶液的測(cè)定值幾乎相同。從表l中可明確看出，源自曲霉屬的蛋白酶和XIV型蛋白酶對(duì)球蛋白組分中的糖化球蛋白顯示出良好的反應(yīng)性。然而，能夠與清蛋白中的GA和血紅蛋白中的GHb反應(yīng)的內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶對(duì)球蛋白組分中的糖化球蛋白也具有反應(yīng)性。這些結(jié)果表明如果對(duì)血清或血漿中的GA或全血或血細(xì)胞中的GHb進(jìn)行測(cè)定，僅選擇蛋白酶的類型不可避免球蛋白組分的影響。實(shí)施例2<球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑的篩選>利用與HSA底物溶液具有高反應(yīng)性的XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))，在HSA底物溶液基礎(chǔ)上篩選出能夠減少蛋白酶與上述球蛋白底物溶液的反應(yīng)的組分。<反應(yīng)溶液組成>R-l蛋白水解試劑150mMTricine緩沖液(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))pH8.5，2，500U/mlXXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))十球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑(脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽，或季銨鹽型陽離子表面活性劑1%，伴刀凝集素A:0.21mg/ml，甜菜堿0.1%,辛基葡糖苷1%，由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑150mMTricine緩沖液(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))pH8.5，0.12%4-AA(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))0.08%TOOS(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))24U/mlR-FOD(由AsahiKasei公司生產(chǎn))20U/mlPOD(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))在R-1蛋白水解試劑中，作為脫氧膽酰胺，利用雙葡糖酰胺基丙基脫氧膽酰胺；作為膽酰胺，利用3-[(3-膽酰氨基丙基)二曱基銨丙磺酸，3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨I-2-羥基丙磺酸，或雙葡糖酰胺基丙基膽酰胺；作為季銨鹽，利用氯化節(jié)基三乙基銨或氯化千基三正丁基銨；作為季銨鹽型陽離子表面活性劑，利用氯化十二烷基三曱基銨或十二烷基二甲基胺氧化物。<底物溶液>1、HSA底物溶液；人清蛋白40mg/ml，GA%-10.5%(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn)，底物溶液中的清蛋白濃度利用清蛋白檢測(cè)試劑盒(清蛋白II-HA檢測(cè)盒Wako;由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))進(jìn)行測(cè)定。GA%利用糖化清蛋白分析儀(GAA-2000,由ARKRAY公司生產(chǎn))進(jìn)行測(cè)定。2、，球蛋白添加底物溶液，將17.0mg/ml的，球蛋白[人y-球蛋白(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))，果糖胺值-34jiM添加到上述HSA底物溶液中。<反應(yīng)步驟>將8^1的每種底物溶液(HSA底物溶液，G-I底物溶液)加到在37°C下保溫的240jtlR-l中。在37。C下引發(fā)反應(yīng)并在正好反應(yīng)5分鐘之后加入80^1的R-2。在添加R-2之前和之后測(cè)定546nm波長下的吸光度。兩個(gè)測(cè)量結(jié)果的差作為吸光度變化。利用水替代底物執(zhí)行同樣操作以制備空白樣品。此外，以未添加球蛋白選擇性蛋白酶抑制劑的反應(yīng)溶液作為對(duì)照。AA(HSA)的計(jì)算是從HSA底物溶液所得的吸光度變化中減去空白樣品的吸光度變化。AA(+^球蛋白)的計(jì)算是從添加？球蛋白的底物溶液所得的吸光度變化中減去空白樣品的吸光度變化。，球蛋白添加的效應(yīng)-(AA(+^球蛋白)-AA(HSA))/AA(HSA)x綱(％)比較各種候選化合物存在和不存在(對(duì)照)時(shí)所得的值。結(jié)果如表2所示。表2篩選球蛋白選擇性蛋白酶抑制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>鹽型陽離子表面活性劑，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷，甜菜堿中鑒定到對(duì)蛋白酶與球蛋白反應(yīng)的抑制作用，證實(shí)了如果利用這些球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑和蛋白酶，則可主要地對(duì)球蛋白以外的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化。利用Hb底物溶液替代HSA底物溶液執(zhí)行同樣的測(cè)量，前提是如果利用Hb底物溶液，則在與R-l反應(yīng)之后利用三氯乙酸除去蛋白質(zhì)，然后對(duì)殘佘物進(jìn)行中和并加入R-2。在利用Hb底物溶液的情況下，同樣證實(shí)脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽或季銨鹽型陽離子表面活性劑，伴刀豆凝集素A，甜菜堿具有抑制蛋白酶與球蛋白反應(yīng)的作用。實(shí)施例3<3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨]丙磺酸的球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制作用>利用各種蛋白酶驗(yàn)證了3-[(3-膽酰氨基丙基)二曱基銨丙磺酸的球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制作用。R-l蛋白水解試劑150mMTricine緩沖液(由WakoPureChemicalIndustrials有限公司生產(chǎn))pH8.5，2，500U/ml蛋白酶六1%3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨丙磺酸*Orientase22BF(由HBI酶公司生產(chǎn))，VIII型蛋白酶，XIV型蛋白酶，和XXVII型蛋白酶(以上由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))用作蛋白酶。R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑同實(shí)施例2。<底物溶液>同實(shí)施例2。<反應(yīng)步驟>利用如實(shí)施例2中的相同方式比較3-[(3-膽酰M丙基)二曱基銨丙磺酸存在和不存在(對(duì)照)時(shí)，球蛋白添加的效應(yīng)。結(jié)果如表3所示。在判斷一欄中，添加y-球蛋白的效應(yīng)被明顯減少的情況以o來表示。表3:3-[(3-膽酰氨基丙基)二曱基銨I丙磺酸的球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>從表3可看出，有3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨丙磺酸存在時(shí)，Orientase22BF，VIII型蛋白酶，XIV型蛋白酶，和XXVII型蛋白酶減少了與y-球蛋白底物的蛋白酶反應(yīng)，但所有這些蛋白酶都保持了與HSA底物的反應(yīng)性。這些結(jié)果說明不論蛋白酶是何類型，本發(fā)明的球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑都是有效的。此外，甚至在測(cè)定GHb時(shí)，利用本發(fā)明也可以消除球蛋白組分的影響。實(shí)施例4<#化清蛋白的稀釋線性>R-l蛋白水解試劑150mMTricine緩沖液(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))pH8.5,2，500U/mlXXVII型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))1%3-[(3-膽酰氨基丙基)二曱基銨-2-羥基丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑同實(shí)施例2。<底物溶液>1、HSA底物溶液同實(shí)施例l,但使用的溶液濃度為4.0g/dl。2、y-^"蛋白底物溶液同實(shí)施例2。3、球蛋白IV底物溶液同實(shí)施例l。<步驟>將HSA底物溶液(4g/dl)，，球蛋白(yG)底物溶液(1.7g/dl),以及球蛋白IV(GIV)底物溶液(1.7g/dl)進(jìn)行稀釋放大O.O、0.5、1.0、1.5和2.0倍以驗(yàn)證稀釋線性。接著執(zhí)行與實(shí)施例3相同的操作，但將HSA的1.0倍稀釋樣品測(cè)定10次以計(jì)算CV值。結(jié)果如圖1所示。從圖1可看出，改變，球蛋白底物溶液或球蛋白IV(GIV)底物溶液的濃度，吸光度沒有變化。另一方面，HSA底物溶液相應(yīng)于濃度顯示出良好的線性，這表明對(duì)糖化清蛋白的測(cè)定可以實(shí)質(zhì)上不受球蛋白組分的影響。已經(jīng)用HSA的l,0倍濃度證實(shí)CV值-0.9。/。具有極好的重復(fù)性，這表明，如果利用本發(fā)明的測(cè)定方法，在10分鐘反應(yīng)時(shí)間內(nèi)能夠以良好的靈敏性和極好的重復(fù)性對(duì)糖化清蛋白進(jìn)行選擇性地測(cè)定。實(shí)施例5<#化血紅蛋白的稀釋線性>R-l蛋白水解試劑77mMTris緩沖液(pH8.0)2，500U/mlXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))1%3-[(3-膽酰氨基丙基)二曱基銨-2曙羥基丙磺酸(由Sigma-Aldrich7>司生產(chǎn))R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑同實(shí)施例2。<底物溶液>利用與實(shí)施例1中相同的Hb底物溶液和與實(shí)施例4中相同的，球蛋白底物溶液和球蛋白IV底物溶液。<步驟>制備Hb底物溶液(4g/dl)，，球蛋白(yG)底物溶液(1.7g/dl)，以及球蛋白IV(GIV)底物溶液(1.7g/dl)的0.0、0.5、1.0、1.5和2,0倍濃度樣品以驗(yàn)證稀釋線性。接著執(zhí)行與實(shí)施例1相同的操作，但將Hb的1.0倍稀釋樣品測(cè)定10次以計(jì)算CV值。結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，改變？球蛋白底物溶液或球蛋白IV(GIV)底物溶液的濃度，吸光度沒有變化。另一方面，Hb底物溶液相應(yīng)于濃度顯示出良好的線性，這表明對(duì)糖化血紅蛋白的測(cè)定實(shí)質(zhì)上不受球蛋白組分的影響。已經(jīng)用HSA的l.O倍濃度證實(shí)CV值-2.0。/。具有極好的重復(fù)性，這表明，如果利用本發(fā)明的測(cè)定方法，在10分鐘反應(yīng)時(shí)間內(nèi)能夠以良好的靈敏性和極好的重復(fù)性對(duì)糖化血紅蛋白進(jìn)行選擇性地測(cè)定。實(shí)施例6<糖化清蛋白的線性>R-l蛋白水解試劑同實(shí)施例4。R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑同實(shí)施例4。<底物溶液>血清A)a糖尿病患者的血清GA。/。=32.9%;清蛋白濃度4.3g/dl血清B)*健康人的血清GA%-16.4%;清蛋白濃度4.1g/dl*將上述血清A)和血清B)以10:0，8:2，6:4，4:6,2:8和0:10的比率進(jìn)行混合得到混合樣品。<步驟>同實(shí)施例3。結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出，利用具有相同清蛋白濃度和不同糖化清蛋白比率的樣品獲得極好的線性。因此，證明本發(fā)明用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法能夠?qū)嶋H地定量分析血清和血漿中的糖化清蛋白。此外，由于證明用溶解紅細(xì)胞制備的血紅蛋白底物溶液替代血清具有相同線性，所以證明本發(fā)明用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法也能夠定量分析糖化血紅蛋白。實(shí)施例7<糖化清蛋白的HPLC和酶學(xué)方法(本發(fā)明)之間的相關(guān)性>R-l蛋白水解試劑同實(shí)施例4。R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑同實(shí)施例4。<底物溶液>糖尿病患者的血清14個(gè)樣品健康人的血清25個(gè)樣品<步驟>執(zhí)行與實(shí)施例2相同的步驟。本發(fā)明的酶學(xué)方法和已知的HPLC法之間的相關(guān)性利用14個(gè)糖尿病患者血清樣品進(jìn)行確定。利用糖化清蛋白分析儀(GAA-2000，由ARKRAY公司生產(chǎn))通過HPLC法測(cè)定糖化清蛋白的比率。由本發(fā)明方法得到的吸光度變化與此糖化清蛋白比率具有相當(dāng)高的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0.991)，這證明本發(fā)明的測(cè)定方法能夠精確測(cè)定糖化清蛋白。實(shí)施例8<緩沖劑的類型對(duì)抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定作用><反應(yīng)溶液組成>150mM各種緩沖液(pH8.0)2，500U/mlXXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))或鏈霉蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))10U/ml抗壞血酸氧化酶(ASO-311，由ToyoboCo.,Ltd.生產(chǎn))或熱穩(wěn)定型抗壞血酸氧化酶(ASO-312,由ToyoboCo.，Ltd.生產(chǎn))R-l:作為蛋白水解試劑中的緩沖劑，利用3-4-(2-羥乙基)-l-哌嗪基丙磺酸(EPPS)，2-4-(2-羥乙基)-l-哌嗪基l乙磺酸(HEPES)，2-羥基-3-[4-(2-羥乙基)-l-哌溱基j丙磺酸(HEPPSO)，三羥曱基氨基甲烷(Tris)，旅溱-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)(上述化合物由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))和磷酸(由WakoPureChemicalIndustrials有限公司生產(chǎn))。<步驟>利用各種緩沖劑制備上述反應(yīng)溶液。測(cè)定抗壞血酸氧化酶活性后，將每種溶液的一部分用作對(duì)照。利用上述《測(cè)定抗壞血酸氧化酶(ASOx)活性的方法》進(jìn)行活性測(cè)量。將剩余反應(yīng)溶液在室溫下貯存2天，再以同樣的方法測(cè)量活性。計(jì)算在室溫下貯存2天后的活性與對(duì)照活性的比例以比較抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定性。結(jié)果如表4所示。表4緩沖劑類型對(duì)抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定作用<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>從表4可看出，蛋白酶存在時(shí)抗壞血酸氧化酶明顯在利用不具4-(2-羥乙基)-l-哌噪基的三羥甲基絲甲烷(Tris)，哌溱-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)或磷酸作為緩沖劑的情況下比在利用具4-(2-羥乙基)-l-哌嚷基的3-[4-(2-羥乙基)-l-哌，秦基丙磺酸(EPPS)，2-[4-(2-羥乙基)-l-哌溱基I乙磺酸(HEPES)或2-羥基-3-[4-(2-羥乙基)-l-P底溱基I丙磺酸(HEPPSO)作為緩沖劑的情況下更穩(wěn)定。而且明顯地，不論抗壞血酸氧化酶和蛋白酶為何種類型，都證實(shí)了具有同樣的作用。實(shí)施例9<用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物中緩沖劑類型對(duì)抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定作用><反應(yīng)溶液組成>R-l蛋白水解試劑150mM各種緩沖液(pH8.0)2，500U/mlXXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))2.0mM4-氨基安替比林(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))10U/ml抗壞血酸氧化酶(由ToyoboCo.，Ltd.生產(chǎn))R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑150mMHEPES緩沖液(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))pH7.56.0mMTOOS(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))24U/mlR-FOD(由AsahiKasei公司生產(chǎn))20U/mlPOD(由Sigma醫(yī)Aldrich公司生產(chǎn))EPPS，HEPES，HEPPSO，Tris和POPSO用作R-l蛋白水解試劑中的緩沖劑。<對(duì)照底物溶液和抗壞血酸添加底物溶液>抗壞血酸添加底物溶液通過將1體積的抗壞血酸(lg/dl)(由KokusanChemicalCo.Ltd.生產(chǎn))加到9體積的人類庫(pool)血清中進(jìn)行制備。由添加蒸餾水替代抗壞血酸所制備的溶液作為對(duì)照底物溶液。<反應(yīng)步驟>將8fU的對(duì)照底物溶液或抗壞血酸添加底物溶液加到240jil的37。C保溫的R-l中。在37°C引發(fā)反應(yīng)并在正好5分鐘之后加入80nl的R-2。在添加R-2之前和添加R-2之后5分鐘測(cè)定555nm的吸光度。AAG的計(jì)算是通過從對(duì)照底物溶液和抗壞血酸添加底物溶液吸光度測(cè)量所得的吸光度變化中減去利用蒸餾水替代底物溶液的空白樣品所得的吸光度變化來進(jìn)行。將同樣R-l反應(yīng)溶液在室溫下貯存24小時(shí)，之后以同樣方法測(cè)定吸光度計(jì)算出AA24。將從對(duì)照底物溶液所得的吸光度變化設(shè)定為100，計(jì)算從抗壞血酸添加底物溶液所得的AAo和AA24的比例。結(jié)果如圖4所示。由于抗壞血酸對(duì)測(cè)量系統(tǒng)具有顯著地負(fù)面影響，如果利用100mg/dl的濃度，則將清除反應(yīng)省略就不能觀察到糖化蛋白質(zhì)的信號(hào)。從圖4可看出，利用不含4-(2-羥乙基)-l-哌溱基的Tris或POPSO的糖化蛋白質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)在室溫下貯存24小時(shí)之后，其在抗壞血酸去除能力上沒有變化。另一方面，利用含4-(2畫羥乙基)曙l-哌溱基的EPPS，HEPES或HEPPSO作為緩沖劑的系統(tǒng)在室溫下貯存24小時(shí)之后，幾乎沒有抗壞血酸去除能力。根據(jù)上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在蛋白酶和抗壞血酸氧化酶共同存在的糖化蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑中，抗壞血酸氧化酶在利用不具4-(2-羥乙基)-l-哌溱基的緩沖劑的系統(tǒng)中比在利用具4-(2-羥乙基)-l-哌嚷基的緩沖劑的檢測(cè)系統(tǒng)中更穩(wěn)定。此外，上述結(jié)果明顯地證明本發(fā)明可用于測(cè)定糖化清蛋白、果糖胺和糖化血紅蛋白。實(shí)施例10<溴曱酚紫對(duì)糖化清蛋白和非糖化清蛋白的反應(yīng)性差異，及蛋白質(zhì)變性劑和/或具s-s鍵的化合物的作用〉<反應(yīng)溶液組成>R-l預(yù)處理試劑10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)+各種濃度的蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物；加入蒸餾水作為對(duì)照R-2清蛋白顯色劑200mM琥賴酸i爰沖液(由WakoPureChemicalIndustries有限7>司生產(chǎn))pH5.50.15mM溴甲酚紫(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))0.3%Tx-100(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))下列化合物1)-9)用作R-l預(yù)處理試劑中的蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物。1)6，6'-二硫代二煙酸lOOmM2)3,3'-二硫代二丙酸lOOmM3)2，2，-二硫代二安息香酸lOOmM4)4，4'-二石克代二嗎啉lOOmM5)DTNB(50mM)6)DDD(33mM)7)2-PDS(25mM)8)4-PDS(50mM)9)SDS(0.3%)1)國5)由WakoPureChemicalIndustries有限z〉司生產(chǎn)6)-9)由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)<樣品>將糖化清蛋白，非糖化清蛋白，健康人血清和患者血清用作樣品，并將蒸餾水作為空白樣。糖化清蛋白和非糖化清蛋白是從人血清得到，通過已知方法利用硼酸-固定化樹脂進(jìn)行純化。<反應(yīng)步驟>將2nl樣品加入到160jil在37。C保溫的預(yù)處理試劑中。在37。C引發(fā)反應(yīng)并在正好5分鐘之后加入160|iil的清蛋白顯色劑。在添加清蛋白顯色劑前和添加清蛋白顯色劑之后5分鐘測(cè)量600nm的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線利用蒸餾水和具有已知清蛋白濃度的樣品替代上述樣品進(jìn)行制作。通過免疫方法以膠乳試劑(LX試劑，Alb一II，由EikenChemicalCo.Ltd生產(chǎn))作為對(duì)照對(duì)樣品分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表5(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>從表5可看出，在BCP法中未進(jìn)行預(yù)處理而測(cè)定的針對(duì)NGA的值出乎意料地低。同樣，在含少量NGA的患者樣品中免疫法和BCP法的偏差小于在含大量NGA的健康人樣品中的免疫法和BCP法的偏差。通過蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物的預(yù)處理，與免疫法的偏差明顯減少。其中，2,2'-二硫代二安息香酸和4，4'-二硫代二嗎啉，DDD，2-PDS，4-PDS,DTNB以及十二烷基硫酸鈉的作用尤其顯著。結(jié)果，證明如果在測(cè)定糖化清蛋白的比率時(shí)樣品以蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物進(jìn)行預(yù)處理，并且在預(yù)處理同時(shí)和之后進(jìn)行BCP反應(yīng)，則可消除由NGA引起的負(fù)面誤差，確保糖化清蛋白比率的精確測(cè)定。實(shí)施例11<蛋白酶的穩(wěn)定><反應(yīng)溶液組成>R-l蛋白水解試劑150mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)5，000PU/mlXXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))8mM4-氨基安替比林(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))15U/ml過氧化物酶1.0%3-[(3-膽酰氨基丙基)二曱基銨-2-羥基丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))+各種濃度的蛋白酶穩(wěn)定劑(加入蒸餾水作為對(duì)照)R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑150mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)24U/mlR-FOD-II(由AsahiKasei公司生產(chǎn))12mMTOOS(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))下列化合物1)-7)用作預(yù)處理試劑中的蛋白酶穩(wěn)定劑。1)0.5mM氯化鎂2)lOmM氯化釣3)lOOmM氯化鈉4)0.1%乙二醇(EtGly)5)10%二甲基亞砜(DMSO)6)1%乙醇(EtOH)7)0.1%十二烷基硫酸三乙醇胺(TEALS)1)-7)由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn)<樣品>5g/dlHSA(LOT38H7601;由Sigma誦Aldrich公司生產(chǎn))<反應(yīng)步驟>將8^1樣品加入到240^1在37。C保溫的蛋白水解試劑中。在37。C引發(fā)反應(yīng)并在正好5分鐘之后加入80^1的糖化氨基酸檢測(cè)試劑。在添加糖化氨基酸檢測(cè)試劑前和添加糖化氨基酸檢測(cè)試劑之后5分鐘測(cè)量546nm的吸光度。AAG的計(jì)算是通過從底物溶液吸光度測(cè)量所得的吸光度變化中減去利用蒸餾水替代底物溶液的空白樣品所得的吸光度變化來進(jìn)行。將同樣反應(yīng)溶液蛋白水解試劑在37。C下貯存24小時(shí)，并以同樣方法測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度測(cè)量結(jié)果計(jì)算出AA24。對(duì)利用含穩(wěn)定劑的試劑的實(shí)驗(yàn)到利用不含穩(wěn)定劑的試劑的實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出相對(duì)靈敏度，其中將利用不含穩(wěn)定劑并未經(jīng)貯存的試劑時(shí)所測(cè)得的AAo設(shè)定為100%。結(jié)果如圖5所示。從圖5可看出，如果不使用穩(wěn)定劑則相對(duì)靈敏度減少到60%，這表明蛋白水解試劑具有穩(wěn)定作用。在添加穩(wěn)定劑的實(shí)驗(yàn)中，觀察到添加氯化釣，氯化鈉，DMSO，EtOH或TEALS的穩(wěn)定作用。其中氯化4丐和DMSO的性能幾乎沒有減少。繼續(xù)利用DMSO和氯化鉤進(jìn)行的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在37。C貯存4周仍可看到其性能幾乎沒有減少。此外，證明如果在冰箱中以液態(tài)貯存，這些化合物則具有一年或更長時(shí)間的l&存穩(wěn)定作用。實(shí)施例12<至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定><反應(yīng)溶液組成>R-l蛋白水解試劑150mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)8mM4-氨基安替比林(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))15U/ml過氧化物酶R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑150mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)24U/mlR-FOD-II(由AsahiKasei公司生產(chǎn))12mMTODB(由Dojindo實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))+各種濃度的蛋白酶穩(wěn)定劑(加入蒸餾水作為對(duì)照)下列化合物1)一15)用作糖化氨基酸檢測(cè)試劑中至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定劑。1)5%甘露醇2)5%山梨糖醇3)5%蔑糖4)5%海藻糖5)0,5mM氯化鈣6)0.5mM氯化鎂7)3%L-谷氨酸(Glu)8)3%L-谷氨酰胺(Gin)9)3%L-脯氨酸(Pro)10)3%L-丙氨酸(Ala)11)3%L-纈氨酸(Val)12)3%甘氨酸(Gly)13)3%L-賴氨酸(Lys)14)3%肌氨酸15)lOOmM硫酸銨1)—14)由WakoPureChemicalIndustries有P艮公司生產(chǎn)<樣品>0.5mMFZL<反應(yīng)步驟>將8pl樣品加入到240jil在37'C保溫的蛋白水解試劑中。在37'C引發(fā)反應(yīng)并在正好5分鐘之后加入80jil的糖化氨基酸檢測(cè)試劑。在添加糖化氨基酸檢測(cè)試劑前和添加糖化氨基酸檢測(cè)試劑之后5分鐘測(cè)量546nm的吸光度。AAo的計(jì)算通過從底物溶液吸光度測(cè)量所得的吸光度變化中減去利用蒸餾水替代底物溶液的空白樣品所得的吸光度變化來進(jìn)行。將同樣反應(yīng)溶液糖化氨基酸檢測(cè)試劑在37r下貯存2天，并以同樣方法測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度測(cè)量結(jié)果計(jì)算出AA24。對(duì)利用含穩(wěn)定劑的試劑的實(shí)驗(yàn)到利用不含穩(wěn)定劑的試劑的實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出相對(duì)靈敏度，其中將利用不含穩(wěn)定劑并未經(jīng)貯存的試劑時(shí)所測(cè)得的AAo設(shè)定為100%。結(jié)果如圖6所示。從圖6可看出，如果不使用穩(wěn)定劑則相對(duì)靈敏度減少到30%,這表明糖化氨基酸檢測(cè)試劑具有穩(wěn)定作用。在添加穩(wěn)定劑的實(shí)驗(yàn)中，觀察到添加甘露醇，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，氯化鈣，氯化鎂，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸，甘氨酸，L-賴氨酸，肌氨酸和疏酸銨的穩(wěn)定作用。其中，糖醇，氨基酸和肌氨酸顯示出尤其強(qiáng)的穩(wěn)定作用。繼續(xù)利用L-丙氨酸，甘氨酸或肌氨酸進(jìn)行的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在37。C貯存4周仍看到性能幾乎沒有減少。此外，證明如果在水箱中以液態(tài)貯存時(shí)，這些化合物具有一年或更長時(shí)間的貯存穩(wěn)定作用。實(shí)施例13<制備含有突變FOD基因的DNA片斷文庫>將具有序列表SEQIDNo.5所示堿基序列中第1-30位的堿基序列的寡核苷酸以及具有序列表SEQIDNo.6所示堿基序列中第l-30位的堿基序列的寡核苷酸的合成委托給BEX有P艮公司來完成。利用Taq聚合酶試劑盒(由TakaraShuzoCo.Ltd.生產(chǎn))，才艮據(jù)試劑盒所附的i兌明書以來自尖鐮孢IFO-9972的能夠編碼FOD蛋白的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而擴(kuò)增FOD結(jié)構(gòu)基因。反應(yīng)是在反應(yīng)液中加入Mg++離子使其終濃度為0.5mM的情況下以不均衡分布的堿基濃度(dATP:0.51mM，dCTP:0.20mM，dGTP:1.15mM和dTTP:3.76mM)進(jìn)行的，以便提高誘變效率。實(shí)施例14<制備突變FOD重組文庫>將在實(shí)施例13中所得的含有擴(kuò)增的FOD基因的DNA片斷以限制性內(nèi)切酶Ncol和EcoRI進(jìn)行消化，然后與由同種限制性內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒oTV119N(由TakaraShuzoCo.，Ltd.生產(chǎn))連接，再引入大腸桿菌JM109菌林(由ToyoboCo.Ltd.生產(chǎn))中。將細(xì)胞在含有100ng/ml氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基(由DIFCO公司生產(chǎn))上37'C下過夜培養(yǎng)，形成轉(zhuǎn)化體菌落。實(shí)施例15<篩選賴氨酸特異性的突變FOD>將在實(shí)施例14中制備的菌落文庫在兩塊LB瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)制，每一塊平板含有100jig/ml氨節(jié)青霉素和ImMIPTG(由WakoPureChemicalIndustries有P艮公司生產(chǎn))。每塊培養(yǎng)基上平鋪一層含有5U/ml過氧化酶(由AsahiKasd公司生產(chǎn))，0.02%鄰聯(lián)茴香胺(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))，2.0mM糖化纈氨酸或糖化賴氨酸(通過Hashiba等的方法制備。Hashiba,H.(1976)J.Agric.FoodChem.，24，70)的LB瓊脂(0.3%)培養(yǎng)基。37。C培養(yǎng)8小時(shí)后，觀察到由FOD氧化糖化氨基酸所形成的氧自由基和由鄰聯(lián)茴香胺引起的菌落顯色。這樣就篩選出被糖化賴氨酸染成黑紫色且未被糖化纈氨酸染色的菌落，并獲得相應(yīng)菌落的164個(gè)菌林。實(shí)施例16<制備突變FOD候選菌林的細(xì)胞提取液>將實(shí)施例15中得到的164個(gè)突變菌林在1.5ml含有50ftg/ml氨節(jié)青霉素和ImMIPTG的3.7%BHI液體培養(yǎng)基(由DIFCO公司生產(chǎn))中30'C培養(yǎng)16小時(shí)。對(duì)1ml培養(yǎng)液進(jìn)行離心U5，000G，4'C離心1分鐘)以收集細(xì)胞。向收集的細(xì)胞中加入200nl的10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)。利用超聲粉碎儀將細(xì)胞粉碎之后，對(duì)混合物進(jìn)行離心(14，000G，4'C離心5分鐘)獲得作為上清液的細(xì)胞提取物。實(shí)施例17<突變FOD的底物專一性驗(yàn)證>利用上述的FOD酶活性測(cè)量方法對(duì)包含在實(shí)施例16制備的細(xì)胞提取物中的FOD突變重組體的糖化氨基酸底物專一性進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果，在候選菌林中鑒定出兩個(gè)突變體，其與糖化纈氨酸的反應(yīng)性小于與糖化賴氨酸的反應(yīng)性的1/1,000。這兩個(gè)突變體被作為靼突變體。實(shí)施例18<重組質(zhì)粒的提取>將實(shí)施例17中挑選出的突變體接種在1.5ml含50ng/ml氨爺青霉素的LB液體培養(yǎng)基中并在37"C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。按照常規(guī)方法提取質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒命名為pcmFODl和pcmFOD2。實(shí)施例19<確定突變FOD基因的堿基序列>按照雙脫氧法對(duì)實(shí)施例18中得到的突變FOD基因的堿基序列進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變體具有相同結(jié)構(gòu)，即在序列表SEQIDNo.l所示的堿基序列中第1115位A被G替代，并且對(duì)于編碼的重組突變FOD，在序列表SEQIDNo.l所示的氨基酸序列中第372位賴氨酸被精氨酸替代。實(shí)施例20<每個(gè)突變體的底物專一性的驗(yàn)證>為了觀察在實(shí)施例19鑒定的突變氨基酸位點(diǎn)以其他氨基酸進(jìn)行替代的效果，按照Kunkel等的方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變。將具有序列表SEQIDNo.7所示序列中第1-27位堿基序列的寡核苷酸的合成委托給外源(BEX有限公司)完成。利用Mutan-K試劑盒(由TakaraShuzoCo.Ltd.生產(chǎn))按照試劑盒所附的說明書對(duì)寡核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變。將所得的突變基因再次連入表達(dá)質(zhì)粒pTV119N中，然后引入大腸桿菌宿主，并在含有50ng/ml氨芐青霉素和lmM的IPTG的3.7%BHI液體培養(yǎng)基中30"C下培養(yǎng)16小時(shí)，產(chǎn)生突變FOD蛋白質(zhì)。利用經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的多種突變體按照實(shí)施例16和17中的同樣方法測(cè)定底物專一性，以發(fā)現(xiàn)具有除精氨酸外的色氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，丙氨酸，絲氨酸，半胱氨酸或甘氨酸替代的突變體是否顯示出與具精氨酸替代的突變體相同的糖化賴氨酸特異性的底物專一性。結(jié)果顯示在表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在此表中，"低于界限"表示"低于檢測(cè)界限"，"N.D.，，表示"沒有數(shù)據(jù)"。上述結(jié)果證明如果序列表SEQIDNo.l的M酸序列中的第372位賴氨酸被其它氨基酸替代，F(xiàn)OD與糖化賴氨酸的反應(yīng)性同與糖化纈氨酸的反應(yīng)性相比可以被相對(duì)減少。尤其，發(fā)現(xiàn)色氨酸，曱硫氨酸或纈氨酸替代賴氨酸所得的突變體具有高度的糖化纈氨酸特異性和優(yōu)良的酶性能。用色氨酸替代賴氨酸所得的突變體命名為FOD-W，產(chǎn)生FOD-W的表達(dá)質(zhì)粒命名為pcmFOD3，曱硫氨酸替代賴氨酸所得的突變體命名為FOD-M，產(chǎn)生FOD-M的表達(dá)質(zhì)粒命名為pcmFOD4，纈氨酸替代賴氨酸所得的突變體命名為FOD-V，產(chǎn)生FOD-V的表達(dá)質(zhì)粒命名為pcmFOD5。圖7表示質(zhì)粒的共同結(jié)構(gòu)。實(shí)施例21<測(cè)定樣品中去除(FV)>-L-賴氨酸(ZFL)后的果糖基-L-纈氨酸反應(yīng)試劑150mM5U/ml反應(yīng)試劑250mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)FOD-V過氧化氫酶20U/ml0.05%0.04%0.04%Tris-HCl緩沖液(pH7.5)FOD過氧化物酶疊氮化鈉4-氨基安替比林TOOS樣品溶液添加有終濃度為0，0.1，0.2或0.3mM的FV的0.3mMZFL溶液。0.5ml的反應(yīng)溶液1在37。C預(yù)熱5分鐘后，加入0.05ml的上述樣品溶液并在37。C反應(yīng)5分鐘。然后，加入0,5ml的反應(yīng)溶液2，5分鐘后測(cè)定555nm下的吸光度。以蒸餾水替代樣品溶液作為空白實(shí)驗(yàn)。作為對(duì)照，以同樣方法對(duì)未添加FOD-V的反應(yīng)溶液1進(jìn)行處理。在圖8中，空心圓形表示未添加FOD-V所得的結(jié)果，空心方形表示添加FOD-V所得的結(jié)果。從圖8可看出，F(xiàn)OD-V和FOD的組合使用確保了在去除樣品溶液中的ZFL后對(duì)FV的定量測(cè)定。以色氨酸，甲硫氨酸和纈氨酸替代序列表SEQIDNo.l氨基酸序列中第372位賴氨酸所得的氨基酸序列分別顯示在序列表SEQIDNo.2，3和4中。實(shí)施例22<糖化清蛋白的比率測(cè)定>R-l蛋白水解試劑50mMPOPSO酸緩沖液(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))pH7.52，500U/mlXXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))1%3-[(3-膽酰氨基丙基)二曱基銨l-2-羥基丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))5U/ml抗壞血酸氧化酶(由F.Hoffmann-LaRoche有P艮公司生產(chǎn))5%DMSO5mM4-氨基安替比林R-2糖化氨基酸檢測(cè)試劑150mMHEPES酸緩沖溶液(由WakoPureChemicalIndustries有限7>司生產(chǎn))PH7.55mMTODBlOU/mlPOD20U/mlR-FOD畫II3%谷氨酸R-3清蛋白預(yù)處理試劑10mMTris-HCl緩沖液(pH8.0)0.3%十二烷基硫酸鈉R-4清蛋白顯色試劑200mM琥珀酸緩沖液(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))pH5.50.15mM溴甲酚紫(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))0.3%Tx-100(由WakoPureChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))<樣品>1.健康人和糖尿病患者血清，每種35個(gè)樣品2.對(duì)照血清H(由BML公司生產(chǎn))作為校準(zhǔn)物學(xué)方法得到的臨床樣品檢測(cè)結(jié)果能相符合。CRM470值用作清蛋白值。<反應(yīng)步驟>將8pl樣品加入到240nl在37。C保溫的R-l中。在37。C引發(fā)反應(yīng)并在正好5分鐘之后加入80jU的R-2。在添加R-2前和添加R-2之后5分鐘測(cè)量555nm的吸光度。分別測(cè)量對(duì)照血清H和蒸餾水以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的糖化清蛋白的濃度進(jìn)行確定。將2jU樣品加入到160jd在37。C保溫的R-3清蛋白預(yù)處理試劑中。在37。C引發(fā)反應(yīng)并在正好5分鐘之后加入160fil的清蛋白顯色試劑R-4。在添加清蛋白顯色試劑前和添加清蛋白顯色試劑之后5分鐘測(cè)量600nm的吸光度。利用蒸餾水和具有已知清蛋白濃度的樣品替代清蛋白濃度待測(cè)樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶學(xué)方法的GA%以如下公式進(jìn)行確定GA%=(GA濃度/清蛋白濃度)xioo。利用Hi-AUTOGAA-2000(由ARKRAY公司生產(chǎn))測(cè)得根據(jù)HPLC方法的值，結(jié)果如圖9所示。從圖9可看出，酶學(xué)方法和HPLC方法顯示出極好的相關(guān)性r=0.998。所有這些試劑以液態(tài)在37。C貯存2周后在性能上沒有變化。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)，清楚地證明這些試劑能夠精確測(cè)定糖化清蛋白和確定糖化清蛋白比率，這是因?yàn)樗鼈兡?)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響2)使蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶保持穩(wěn)定3)精確測(cè)定清蛋白，以及4)消除糖化血紅蛋白的影響實(shí)施例23<將至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶用于第一試劑及將含蛋白酶的組合物用于第二試劑>R-l200mMPOPSO緩沖液(pH7.5)5mM4-氨基安替比林騰/mlPOD20U/mlR-FOD5U/ml抗壞血酸氧化酶3%谷氨酸R-220mM旅噪-1，4-二(2-乙磺酸)緩沖液(pH6.5)20%DMSO8,000U/mlXXIV型蛋白酶4%3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨l-2-羥基丙磺酸5mMTODBR-3，R-4同實(shí)施例22<樣品>同實(shí)施例22的樣品和10-200nM的FZL<反應(yīng)步驟>同實(shí)施例22。結(jié)果如圖10所示。55從圖10可看出，即使在將至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶加入第一個(gè)試劑，將蛋白酶加入第二個(gè)試劑的情況下，也在IO分鐘的短反應(yīng)時(shí)間內(nèi)對(duì)糖化蛋白質(zhì)進(jìn)行了極好測(cè)定。此外，即使樣品中有糖化氨基酸，樣品中的糖化氨基酸也可被配制在R-l中的至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶去除，這樣就能對(duì)糖化蛋白質(zhì)進(jìn)行精確測(cè)定。本發(fā)明試劑與HPLC方法具有良好相關(guān)性(R-0.99)即酶學(xué)方法GA%-1.03xHPLC方法GA%-0.3這表明本發(fā)明試劑能夠精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)。本發(fā)明試劑在37'C貯存3周或在冰箱中貯存15個(gè)月后，性能沒有降低。工業(yè)實(shí)用性通過本發(fā)明可以對(duì)樣品中的糖化蛋白質(zhì)和糖化清蛋白的比率進(jìn)行精確測(cè)定。因此，本發(fā)明的組合物可有效地用作臨床檢測(cè)試劑。有關(guān)生物材料保藏的附注(1)(a)保藏生物材料的機(jī)構(gòu)名稱和地址名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所國際專利生物保藏中心地址日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6,郵編305-8566(b)送交保藏機(jī)構(gòu)(a)保藏的日期2001年1月16日(c)保藏機(jī)構(gòu)(a)給予的保藏號(hào)FERMBP-7847(2)(a)保藏生物材料的機(jī)構(gòu)名稱和地址名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所國際專利生物保藏中心地址日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6,郵編305-8566(b)送交保藏機(jī)構(gòu)(a)保藏的日期2001年1月16日(c)保藏機(jī)構(gòu)(a)給予的保藏號(hào)FERMBP-7848<110>旭化成株式會(huì)社<120>測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物<130><150>JP2001/22953JP2001/39796JP2001/240002<151><160>2001-2001-2001-7-31-16-8<170><210>1<211>1320<212>DNA<213>尖鐮孢(Fusariumoxysporum)IFO-9722<220><221>CDS<222>(1)…(1320)《300><308>DDBJE16562O09>1999-07-28<310>JP1998201473-A/1<311>1997-01-20<312>1998-08_04<400>1gcctc3AlaSersettggThrTrp33CgtcAsnValgggcatsetThrggsGlyThr35etclieutgcCys20gttVal3CCThr5tC3SeretcLeu333LiyssetThrAspC3gGingccAlagtcValtCCC33SerGinetcestLeuHis25aatcgcAsnArg40attetcategttlieLeulieVal10etcgcccgteggLeuAlaArgArgateccgtcsccglieProSerPro45ggtGly.ggtGly303t3lieggcggaGlyGly15TyrThrtcsgccSerAlagtaaacaaacttgetggccgactgtegactgccgatage4896144192GlyHisAspVal50asaggtgatgatLysGlyAspAsp65getcaaggatggAlaGinGlyTrpacaggctctgtcThrGlySerVal100gtagaagatgsgValGluAspGlu115gc3gasg3tThrAlaGluAsp130aactttccaggcAsnPheProGlyg匕tcatgetcgsValHisAlaArgcttggtgtcsasLeuGlyValLys180ctgatetttgaaLeuliePheGlu195aaggagcac3g3I.'ysGluHisArg210gsgttcttcetcGluPhePheLeu225ctgggccatateLeuGlyHisliectgcc3cctcttIjeuProProLeu260gaggatcttestGluAspLeuHis275AsnLysLeuAla55g33gsctC3stcGluAspSerlie70etccscgaccctLeuHisAspPro85gtggetggctc3ValAlaGlySer3tcggtgacgsc工leGlyAspAsp120ttcagasagaccPheArg!LysThr135tggasgggctttTrpLysGlyPhe150aaagetstgassLysAlaMetLys165ttcstcactggcPhelieThrGlygacggcgatgttAspGlyAspVal200gcggatcgaactAlaAspArgThr215gsttttg3gascAspPheGluAsn230csg3tgCC3Gin工leThrPro245ttC3tC33CPheAsn工leAsncsaetcaagstgGin!LeuLysMet280GlyArgLeuSerThr60tggassgescttageTrpLysAlaLeuSer75gtCttCC33CC3ttcValPheGinProPhe90seaccaasgtctateThrProLysSer工le105stcgaccagtataca工leAspGinTyrThr125atgcctgagggtateMetProGluGlylietac33gcccscgggtTyrLysProThrGly155getgetttcgaagagAlaAlaPheGluGlu170tctcccgasggaasgSerProGluGlyLys185cgsggtgecaagacgArgGlyAlaLysThr205attctttecgetggtlieLeuSerAlaGly220cagatecagcctacgGinlieGinProThr235gaag3aaccaagctgGluGluThrLys!Leu250ggtttcttc3tgGinGlyPhePheMet265tgcgstgsacatccgCysAspGluHisPro285AlaAspSertscgecges240TyrAlaAla80tgccacaat288CysHisAsn9533gc3gctg336LysGinLeu110cctetcaac384ProLeuAsnctgseaggt432LeuThrGlytctggttgg480SerGlyTrp160agegsgsgg528SerGluArg175gtggsg3gt576ValGluSer190gcagatggt624AlaAspGlygetteagc3672AlaSerAlagcgtggacc720AlaTrpThrt3Casg33C768TyrLysAsn255gaacctgat816GluProAsp270ggct3ctgc864GlyTyrCysaactgggttgaaAsnTrpValGlu290gcaasgestca3Ala!LysHisGin305ctgaaagat3tcLeuLysAsp工lecgsatetgctggArglieCysTrp340l:stestcctcgsTyrHisProArg355scgggttsc33gThrGlyTyrLys370atggagggtacgMetGluGlyThr385ccagagaagtttProGluLysPheggagetgacgatGlyAlaAspAsp420tggacaastateTrpThrAsn工le435aagcctggttctaagLysProGlySerLys295gtgccaaccgaggetValProThrGluAla310atgcctcagcttgcaMetProGinLeuAla325tgcgetgatacacagCysAlaAspThrGin345catcccteacttgtcHisProSerLeuVal360C3t3tC3C3tC33ttHis工leThrSerlie375cttgaggaaaggtttLeuGluGluArgPhe390accgagttctggggtThrGluPheTrpGly405aagateatggatttgLyslieMetAspLeu425asgsatg3t3tcLysAsnAsplie440tscccccagtecTyrP;roGinSer300gsacgscgcstgGluArgArgMet315gsteggccgcttAspArgProLeu330gatagsatgttcAspArgMetPheattgettcsggt工leAlaSerGly365ggasagttcateGlyLysPhelie380gecaagttctggAlaLysTyrTrp395asagatcctctgLysAspProLeu410cccsagsgtgstProLysSerAspatecccttc912lieProPheaagcagttt960LysGinPhe320gttcatget1008ValHisAla335ctgstcsec1056LeulieThr350gattgcggc1104AspCysGlytctgactgt1152SerAspCysagatggcga1200ArgTrpArg400gsteggttt1248AspArgPhe415gtagaggga1296ValGluGly4301320<210>2<211〉1320<212>DMA<213>人工糊<220〉<221>CDS<222>(1)...(1320)<221>突變(固tation)<222〉(1114)...(1115)<221>改變(MUTAGEN)<222>(372〉<400〉2gcctcssetetcAlaSerThrLeu1acttggggstgcThrTrpGlyCys20ascgtcsetgttAsnValThrVal35gggestgstgtsGlyHisAspVal50aasggtgatgatLysGlyAspAsp65getcasgg3tggAlaGinGlyTrpacsggctctgtcThrGlySerVal100gt3gaagaitgagValGluAspGlu115seagcagasgatThrAlaGluAsp130aactttccaggcAsnPheProGly145gttestgetcg3ValHisAlaArgcttggtgtcasaLeuGlyValLys180ctgatetttgsaLeuliePheGlu19533gg3gesc3g3LysGluHisArgsec5133caigtecThrLysGinSertc3actgccetcSerThrAlaLeuetcgstgtc33tLeuAspValAsn40aac33acttgetAsnLysLeuAla55gaagscteastcGluAspSerlie70etcescgsccctLeuHisAspPro85gtggetggcteaValAlaGlySerateggtgacgac工leGlyAspAsp120ttcagaaagaccPheA:i:gLysThr135tgg33gggctttTrpLysGlyPhe1503a3getstg33aLysAlaMetLys165ttcstcsetggcPhe工leThrGlygacggcgatgttAspGlyAspVal200gcggatcgaactAlaAspArgThrcaaattetcategttGinlieLeu工leVal10estetcgcccgteggHisLeuAlaArgArg25cgcateccgteaccgArglieProSerPro45ggccgactgtegactGlyArgLeuSerThr60tgg3a3gescttageTrpLysAlaLeuSer75gtcttccaaccattcValPheGinProPhe90acaccaaagtctateThrPro!LysSerlie1053tcgaccsgtat3c3工leAspGinTyrThr1253tgcctgsgggt3tcMetProGluGlylietacsagcccscgggtTyr!LysProThrGly155getgetttcg33gsgAlaAlaPheGluGlu170tctcccg33gg333gSerProGluGlyLys185cgaggtgccaagacgArgGlyAlaLysThr205attctttecgetggtlie!LeuSerAlaGlyggtggcgga48GlyGlyGly15ggttscacc96GlyTyrThr30atateagcc144工leSerAlagccgatage192AlaAspSertscgccgca240TyrAlaAla80tgcescaat288CysHisAsn9533gcsgctg336LysGinLeu110cctetc33c384ProLeuAsnctgacaggt432!LeuThrGlytctggttgg480SerGlyTrp160sgcg3g3gg528SerGluArg175gtggsgsgt576ValGluSer190gcagatggt624AlaAspGlygetteagca672AlaSerAla210gagttcttcetcgsttttGluPhePheLeuAspPhe225230ctgggccatstccsgstgLeuGlyHislieGinlie245ctgccacctcttttcascLeuProProLeuPheAsn260g3ggstcttestetcGluAspLeuHisGinLeu275aactgggttg3333gcctAsnTrpValGluLysPro290gessagestessgtgccsAlaLysHisGinValPro305310ctgaaagatatestgcctLeuLysAsplieMetPro325cgastctgctggtgcgetArg工leCysTrpCysAla340tatcatcctcgscatcccTyrHisProArgHisPro355aegggttacttgcatateThrGlyTyrTrpHis工le370stggagggtscgcttgsgMetGluGlyThrLeuGlu385390ccagagaagtttsecgsgProGluLysPheThrGlu405ggagetgacgat33g3tcGlyAlaAspAspLys工le420tgg33tstc33g33tTrpThrAsnlie!LysAsn435215220gsgaaccsgstcC3gcctGluAsnGin工leGinPro235ccsgsagsasec33gThrProGluGluThrLys250ateaaccaaggtttcttclieAsnGinGlyPhePhe26533g3tgtgcgstg33catLysMetCysAspGluHis280ggttcta3gtscccccsgGlySerLysTyrProGin295300secgsggetg33cgecgcThrGluAlaGluArgArg315csgcttgesgateggccgGinLeuAlaAspArgPro330gatacacaggatagaatgAspThrGinAspArgMet345tc3cttgtc3ttgetteaSerLeuVallieAlaSer360tea3ttggaa3gttcThrSer工leGlyLysPhe375380gssaggtttgecasgttcGluArgPheAlaLysTyr395ttctggggt3a3gatcctPheTrpGlyLysAspPro410atgg3tttgcccasgsgtMetAspLeuProLysSerAsp工le4403cggcgtggsec720ThrAlaTrpThr240ctgtacaagaac768LeuTyrLysAsn255atggaacctgat816MetGluProAsp270ccgggctsctgc864ProGlyTyrCys285tecatecccttc912Ser工leProPheatgaagcagttt960MetLysGinPhe320cttgttestget1008LeuValHisAla335ttcctgateacc1056PheLeulieThr350ggtgsttgcggc1104GlyAspCysGly3653tctctgsctgt1152lieSerAspCystggagatggcga1200TrpArgTrpArg400ctggateggttt1248LeuAspArgPhe415g3tgtagaggga1296AspValGluGly1320<210>3<211>1320<212>DNA<213>人工序歹1」<220><221>CDS<222>(1)...(1320)<221>突變(mutation)<222>(1115)<221>改變(mutagen)<222>(372)<，>3gcctcsactetcaccsascsgteccaaattetcategttggtggcgga48AlaSerThrLeuThrLysGinSerGinlieLeulieValGlyGlyGly151015acttggggatgcteaactgccetccatetcgcccgteggggttacacc96ThrTrpGlyCysSerThrAlaLeuHisLeuAlaArgArgGlyTyrThr202530aacgtcactgttetcgatgtcaatcgcateccgteaccgatateagcc144AsnValThrValLeuAspValAsnArglieProSerProlieSerAla354045gggcatgatgtaaacaascttgetggccgactgtegactgccgatage192GlyHisAspValAsnLysLeuAlaGlyArgLeuSerThrAlaAspSer505560aaaggtgatgstg33gacteaatetggaasgescttagetacgccgca240LysGlyAspAspGluAspSerlieTrpLysAlaLeuSerTyrAlaAla65707580getcaaggatggetccacgaccctgtcttccaaccattctgccacaat288AlaGinGlyTrpLeuHisAspProValPheGinProPheCysHisAsn859095acaggctctgtcgtggetggcteaacaccaaagtctateaagcagctg336ThrGlySerValValAlaGlySerThrPro!LysSer工le!LysGin!Leu100105110gtagaagatgagateggtgacgacategaccagtatacacctetcaac384ValGluAspGlulieGlyAspAsp工leAspGinTyrThrProLeuAsn115120125acagcagaagatttcagaaagaccatgcctgagggtatectgacaggt432ThrAlaGluAspPheArgLysThrMetProGluGlylieLeuThrGly130135140aactttccaggctggaagggcttttacaagcccacgggttctggttgg480AsnPheProGly145gttcatgetcgaValHisAlaArgcttggtgtc333LeuGlyValLys180ctg3tctttgaaLeu工lePheGlu195aaggagcacagaLysGluHisA;rg210gagttcttcetcGluPhePheLeu225ctgggccat3tcLeuGlyHis工lectgcc3cctctt〖'euProProLeu260gaggatcttcat〔；luAspLeuHis275a3Ctgggttg33AsnTrpValGlu290gC333gC3tC33AlaLysHisGin305ctgaaagstateLeuLysAspliecgaatetgctggArg工leCysTrp340tatcatcctcgaTyrHisProArg355acgggttacstgThrGlyTyrMet370TrpLysGlyPheTyr15033agetatgaasget!LysAlaMetLysAla165ttcstcactggctctPhelieThrGlySer185gscggcgstgttcgaAspGlyAspValArg200gcggatcgaactattAlaAspArgThrlie215gsttttgsg33cc3gAspPheGluAsnGin230cagatgacaccagaaGinlieThrProGlu245ttcaacatesaccsaPheAsn工leAsnGin265C33etc33g3tgtgcGinLeuLysMetCys280aagcctggttctaagLysProGlySerLys295gtgccaaccgaggetValProThrGluAla310atgcctcagcttgcaMetProGinLeuAla325tgcgetg3tseacsgCysAlaAspThrGinC3tccctcscttgtcHisProSerLeuVal360C3t3tC3C3tC33ttHislieThrSerlie375LysProThrGly155getttcgasgagAlaPheGluGlu170cccgsaggs33gProGluGlyLysggtgecasgscgGlyAlaLysThr205ctttecgetggtLeuSerAlaGly2203tccsgcctscg工leGinProThr235gassecsagctgGluThrLysLeu250ggtttcttcatgGlyPhePheMetgstgsaicatccgAspGluHisPro285t3ccccc3gtecTyrProGinSer300gsacgacgcatgGluArgArgMet315g3teggccgcttAspArgProLeu330gatagaatgttcAspArgMetPhe3ttgettcsggtlieAlaSerGly365ggs33gttcateGlyLysPhelie380SerGlyTrp160ageg3gsgg528SerGluArg175gtggagagt576ValGluSer190gcagatggt624AlaAspGlygetteagca672AlaSerAlagcgtggacc720AlaTrpThr240tacaagaac768TyrLysAsn255g33cctgst816GluProAsp270ggctaictgc864GlyTyrCysatecccttc912工leProPheasgcagttt960LysGinPhe320gttestget1008ValHisAla335ctg3tcsec1056Leu工leThr350gattgcggc1104AspCysGlytctgactgt1152SerAspCys<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>getcasggatggetccacAlaGinGlyTrpLeuHis85ac3ggctctgtcgtggetThrGlySerValValAla100gtsgssgstgagateggtValGluAspGlulieGly1153C3gesgaagatttcsgsThrAlaGluAspPheArg130aactttccaggctggaagAsnPheProGlyTrpLys145150g匕tcatgetcgaaaagetValHisAlaArgLysAla165cttggtgtcaaattcstcLeuGlyValLysPhelie180ctgstctttgasgscggcLeuliePheGluAspGly'195saggsgcacagagcggatLysGluHisArgAlaAsp210gagttcttcetcgattttGluPhePheLeuAspPhe225230ctgggcC3t3tccsg3tgLeuGlyHislieGinlie245ctgccacctcttttcaacLeuProProLeuPheAsngaggstcttcatcsaetcGluAsp!LeuHisGinL<eu275sactgggttgss33gcctAsnTrpValGluLysPro290gcaa3gestgtgccsAlaLysHisGinValProgaccctgtcttccaaccaAspProValPheGinPro90ggcteaacaccaaagtctGlySerThrPro!LysSer105gacgacategaccagtatAspAsplieAspGinTyr120asg3ccstgcctgsgggtLysThrMetProGluGly135140ggcttttacaagcccacgGlyPheTyrLysProThr155atgaasgetgetttcgaaMetLysAlaAlaPheGlu170actggctctcccg33gg3ThrGlySerProGluGly185gatgttcgaggtgecsagAspValArgGlyAlaLys200cgasetaittctttecgetArgThrlieLeuSerAla215220gagaaccagatecagcctGluAsnGin工leGinPro235acscc3g33gassec33gThrProGluGluThrLys250ate33ccaaggtttcttc工leAsnGinGlyPhePhe265aagatgtgcgatgaacatLysMetCysAspGluHis280ggttct33gt3CccccsgGlySer!LysTyrProGin2953003ccg3ggetgaacgacgcThrGluAlaGluArgArgttctgcesc33t288PheCysHisAsn95stcsagcsgctg336lieLysGinLeu110ac3cctetcaac384ThrProJLeuAsn1253tcctgggt432lieLeuThrGlyggttctggttgg480GlySerGlyTrp160gagagegagsgg528GluSerGluArg175aaggtggagagt576LysValGluSer190acggcagatggt624ThrAlaAspGly205ggtgetteagca672GlyAlaSerAlascggcgtggsec720ThrAlaTrpThr240ctgtacsagasc768!LeuTyrLysAsn2553tgg33cctgst816MetGluProAsp270ccgggctactgc864ProGlyTyrCys285tecatecccttc912SerlieProPhe3tgasgcagttt960MetLysGinPhe305ctgassLeuLysArgliet3testTyrHisacgThratgMet385Pt:oggtGly370GluGlu(，getGlyAlatggTrpThrg己t3tcAsp工letgctggCysTrp340cctcgsProArg355tacgtgTyrValggtscgGlyThraagtttLysPheAspAsp42033t3tCAsn工le435atgMet325tgcCysestHisHiscttLeu3CCThr405Lys33gLys310cctProgetAlacccProstcliegagGlu390gsgGlu3tClieAsncsgcttGinLeuAspThrteacttSerLeu360ThrSer375gaa3ggGluArgttctggPheTrpatggatMetAspgst3tcAsp工le440315gc3gsteggAlaAspArg330csggst3g3GinAspArggtc3ttgetVallieAlaattggaaaglieGlyLystttgecsagPheAlaLys395ggt33agstGlyLysAsp410ttgccc33gLeuProLys425ccgcttProLeustgttcMetPheAlaSerggtGly365ttC3tCPhelie380ttctggTyrTrpcctctgProLeuSerAsp320gttestgetValHis335ctg3tclieLeu350g3tAsp3CCThrtgcCysggcGlytctgactgtSerAspCysagatggcgsArgTrpArg權(quán)gateggtttAspArgPhe415gt3gsgggaValGluGly43010081056110411521200124812961320<210>5<211〉30<212>D3SJAl:序歹lj<220〉〈223〉PCR弓I物<400>5a3aacc3tggcctcssctctc3ccaa3cag30<210〉6<211>30<212>DNA<213>人工序歹廿<220>〈223〉PCR弓I物<400>6aaaasgsattcsgatatcattcttgatatt30<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>定點(diǎn)誘變引物<糊>7ggcacgggttacnnscatatcacatca2權(quán)利要求1、一種組合物，其用于通過蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶測(cè)定糖化清蛋白，并對(duì)清蛋白進(jìn)行單獨(dú)測(cè)定及確定清蛋白的糖化比率，其特征在于用于測(cè)定清蛋白的組合物含有蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物和溴甲酚紫。2、如權(quán)利要求1所述的組合物，其中蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物是2，2，-二硫代二安息香酸、4,4，-二硫代二嗎啉、2，2，-二羥基-6，6，-二萘二硫(DDD)、2，2，-二疏代吡啶(2-PDS)、4，4，-二硫代吡咬(4-PDS)、5，5，-二硫代二-(2-硝基安息香酸)(DTNB)或十二烷基硫酸鈉。3、如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中將選自二曱基亞砜、醇、水溶性鉤鹽、氯化鈉、季銨鹽和季銨鹽型陽離子表面活性劑的蛋白酶穩(wěn)定劑添加到蛋白酶中。4、用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物，其包含蛋白酶、至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶和選自二甲基亞砜、醇、氯化鈉、季銨鹽和季銨鹽型陽離子表面活性劑的蛋白酶穩(wěn)定劑。5、如權(quán)利要求l-4之任一項(xiàng)所述的組合物，其中將選自糖醇、蔗糖、水溶性鎂鹽、水溶性鈣鹽、硫酸銨、氨基酸和肌氨酸的用于至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定劑添加到所述至少與糖化氨基^應(yīng)的酶中。6、用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物，其包含蛋白酶、至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶和選自糖醇、蔗糖、水溶性鎂鹽、水溶性鈣鹽、硫酸銨、氨基酸和肌氨酸的用于至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶的穩(wěn)定劑。7、如權(quán)利要求l-6之任一項(xiàng)所述的組合物，其中蛋白酶來自芽孢桿菌屬(5fl"7/附)的微生物。8、如權(quán)利要求l-7之任一項(xiàng)所述的組合物，其中至少與糖化氨基M應(yīng)的酶是通過將序列表SEQIDNo.lM酸序列中的第372位賴氨酸替代為另一氨基酸而與糖化纈氨酸的反應(yīng)性顯著減小的突變果糖基氨基酸氧化9、如權(quán)利要求8所述的組合物，其中利用的是以色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸作為所述另一氨基酸進(jìn)行替代的突變果糖基氨基酸氧化酶。10、如權(quán)利要求l-9之任一項(xiàng)所述的組合物，其是液體產(chǎn)品。11、如權(quán)利要求1-10之任一項(xiàng)所述的組合物，其中至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶包含在第一試劑中而蛋白酶包含在第二試劑中。12、如權(quán)利要求ll所述的組合物，其是液體產(chǎn)品。13、突變果糖基氨基酸氧化酶，其與糖化纈氨酸的反應(yīng)性通過用另一氨基酸替代序列表SEQIDNo.l氨基酸序列中的第372位賴氨酸而顯著減小。14、如權(quán)利要求13所述的突變果糖基氨基酸氧化酶，其中所述另一氨基酸是色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸。15、用于計(jì)算糖化清蛋白比率的方法，包括通過蛋白酶和樣品溶液反應(yīng)消化清蛋白，利用至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶測(cè)定糖化清蛋白，和以所測(cè)定的值除以用溴曱酚紫單獨(dú)測(cè)定的清蛋白量，其中所述溴甲酚紫測(cè)定包括用蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物預(yù)處理樣品并同時(shí)或隨后測(cè)定清蛋白。16、如權(quán)利要求15所述的方法，其中蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物是2，2，-二硫代二安息香酸、4，4，-二硫代二嗎啉、2，2，-二羥基-6，6，-二萘二硫(DDD)、2，2，-二硫代吡啶(2-PDS)、4，4，-二硫代吡啶(4-PDS)、5，5，-二硫代二-(2-硝基安息香酸)(DTNB)或十二烷基硫酸鈉。17、如權(quán)利要求16所述的方法，其中將選自二甲基亞砜、醇、氯化鈉、季銨鹽和季銨鹽型陽離子表面活性劑的蛋白酶穩(wěn)定劑添加到蛋白酶中。18、利用蛋白酶和至少與糖化氨基l應(yīng)的酶測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法，其特征在于將選自二甲基亞砜、醇、氯化鈉、季銨鹽和季銨鹽型陽離子表面活性劑的蛋白酶穩(wěn)定劑添加到蛋白酶中。19、如權(quán)利要求15-18之任一項(xiàng)所述的方法，其中將選自糖醇、蔗糖、水溶性鎂鹽、水溶性鈣鹽、硫酸銨、氨基酸和肌氨酸的穩(wěn)定劑添加到至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶中。20、利用蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法，其包括在至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶中加入選自糖醇、蔗糖、水溶性鎂鹽、水溶性鈣鹽、疏酸銨、氨基酸和肌氨酸的用于該酶的穩(wěn)定劑。21、如權(quán)利要求15-20之任一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白酶來自芽孢桿菌屬的微生物。22、如權(quán)利要求15-21之任一項(xiàng)所述的方法，其中至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶是突變果糖基氨基酸氧化酶，其通過用另一氨基酸替代序列表SEQIDNo.l氨基酸序列中的第372位賴氨酸而與糖化纈氨酸的反應(yīng)性顯著減小。23、如權(quán)利要求22所述的方法，其中突變果糖基氨基酸氧化酶中利用色氨酸、曱硫氨酸或纈氨酸作為所述另一氨基酸進(jìn)行替代。24、如權(quán)利要求15-23之任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括使樣品和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶進(jìn)行反應(yīng)，然后與蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)。25、利用蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的方法，其包括使樣品和至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶進(jìn)行反應(yīng)然后與蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明提供用于精確測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的組合物，該組合物可1)消除球蛋白和抗壞血酸組分的影響；2)使蛋白酶和能夠至少與糖化氨基酸反應(yīng)的酶保持穩(wěn)定；3)精確測(cè)定清蛋白；和4)測(cè)定糖化清蛋白并同時(shí)消除糖化血紅蛋白的影響，本發(fā)明還提供了測(cè)定方法。因此，能夠更精確地確定糖化蛋白質(zhì)和糖化清蛋白的含量。文檔編號(hào)C12N9/06GK101413027SQ20081014494公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2002年1月30日優(yōu)先權(quán)日2001年1月31日發(fā)明者今村茂行,炭谷順一,芳陵一生,荒井基夫,高妻卓司申請(qǐng)人:旭化成制藥株式會(huì)社