專利名稱：基于RNAi技術(shù)的多基因聯(lián)合基因治療的質(zhì)粒載體的制作方法
基于RNAi技術(shù)的多基因S^基因治療的質(zhì)粒載體
fe^領(lǐng)域l本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)與惡幽中瘤的基因治療技術(shù)領(lǐng)域。
背景S^惡倒中瘤本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，由于多數(shù)原癌基因和抑癌基因?qū)儆谛盘栟D(zhuǎn)
導(dǎo)通珞中的重要組分，通過撒活一種或多種原癌基因的,及抑癌基因的突變?nèi)盺;人而{動中瘤細(xì)
M3S了正常生長調(diào)控機(jī)制，自^^彌殖和侵襲、出現(xiàn)惡性表型。近乎所有棚中瘤的發(fā)病機(jī)理 均涉及了原癌基因的過皿和抑癌基因的突變等多環(huán)節(jié)、多通珞的異常(Mischel PS, et al. Brain Pathol,2003 ;13:52-61)。目前，有^M瘤的針病理學(xué)機(jī)制與惡腿展的研究中，以表皮生長因 子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)為代表的受體酪氨^"激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)^^^ 瘤的惡腿^31程中據(jù) 作用，已日益穀咲注。EGFR由3個 主要區(qū)域鄉(xiāng)賊 一個N端細(xì)鵬卜區(qū)域， 一個疏冰的跨膜區(qū)和一個C端細(xì)胞內(nèi)區(qū)敏細(xì)胞結(jié)構(gòu)域內(nèi) 包括酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)嫩卩ATP結(jié)合位點(diǎn)；細(xì)鵬卜結(jié)構(gòu)是多種多肽生長因子的配體結(jié)合點(diǎn)；其: 要的配體是表皮生長因子(EGF)和轉(zhuǎn)移生長因子a (TGFa) (Sasaki AT,et al. J Cell BioU004，167:505-518.)。針遺傳學(xué)研究表明EGFR的突變、擴(kuò)增與過敏題'I4I^瘤、尤 其是原發(fā)IWM母細(xì)M早期和主要M事件；細(xì)M卜配體結(jié)合區(qū)與EGF和TGFa結(jié)合形成同源 ^M二聚體，可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酪氨酸^ll被激活；或當(dāng)EGFRM卜區(qū)缺失突變、不需與配體結(jié) 合而^^活，貝雌內(nèi)區(qū)酪氨酸殘基自磷酸化轉(zhuǎn)為活,式導(dǎo)致激酶級聯(lián)反應(yīng)。i^ll^主要艦 下游的磷酸磷脂W3羥纖酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)鵬和Ras鵬^M 瘤的發(fā)生、^Mil程中，作用。
近年的研究發(fā)現(xiàn)， 一些小的雙鏈RNA (double-stranded RNA， dsRNA)可以高效、特異地促使體 內(nèi)特定基因mRNA降解，誘使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型，這種技術(shù)即RNA干擾(RNA interference, RNAi)。在RNAi作用的起始階段中夕卜源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA被Dicer酶切割為 19 21bp的小^T擾RNA片段(small interfering RNAs ， siRNAs);隨后siRNA與核酶復(fù)合 物結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)激(RNA induced silencing complex, RISC ); RISC激活后通 過MS配對定位到同源mRNA ,本上并切割mRNA，從而部分或完全抑制目的基因的皿
3(Zhang H, et al. EMBO J， 2002;21:5875-5885. Kawasaki & et al..Nucleic Acids Res, 2003;31:981-987.)。
另一方面，細(xì)胞在RNA,性RNA聚合Hf乍用下，可以siRNA為弓,、以mRNA為模板，合 成出mRNA的互補(bǔ)鏈，從而使mRNA也變成了 dsRNA，然后在Dicer酶的作用下再次被,成 siRNA。 S^f 生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通MS^^反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大 娥加，顯著增加了對基因敲的抑制。
從RNAi的作用機(jī)制中可見，這種基因毅調(diào)筋法屬于緑后的調(diào)節(jié)并具有明顯優(yōu)勢RNAi 基因抑制效果確切，細(xì)微量的siRNA即可使其編碼致病基因，的賴下降90。/。以上、甚至可 以達(dá)到基因敲除的效果；其次，RNAi抑制具有嚴(yán)格的序列特異性，治療的針對性強(qiáng)，因而細(xì)此 項(xiàng)技術(shù)f辦同,制同一基因的多個耙點(diǎn)或多個不同基因而頓相互干擾；同時，RNAi的作用 具有級^^大 她和高穿透性頓合惡倒中瘤的實(shí)驗(yàn)研究；此外，RNAi序列i鄉(xiāng)啲特異性即或 對由野生型點(diǎn)突變形成的癌基因也能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確有效的封閉效果而對野生型基因沒有影響 (Zhen，etal.IntJOncol.2007Nov;31(5):llll-7.)。頓多種月中瘤細(xì)鵬實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)腫瘤細(xì)胞中均 ^^著RNAi的機(jī)制，化學(xué)合成、質(zhì)紛病毒或其他方式介導(dǎo)的RNAi可以有效地抑制內(nèi)源性RNA 的敏(Gondi CS,et al. Clin Cancer Res. 2007 Jul 15;13(14):4051-60. Gondi CS，,et al. Neuron Glia Biol. 2004May;l(2):165-176)。因此，RNAi技術(shù)御中瘤的基因治療上具有光明的應(yīng)用前景，并被認(rèn)為是 反義基因治療時代之后的又一個劃時代的進(jìn)步。由于RNAi的研究在近幾年出現(xiàn)了突破Sa展， 它纖三次被Science評為年度十大科學(xué)漲ltt一 (2001-2003 )。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是Jlf共一種基于RNAi技術(shù)的多基因K^基因治療質(zhì)粒載體。 本發(fā)明提供的體內(nèi)抑帝MM瘤生長的方^^基于RNAi技術(shù)的^基因治療質(zhì)粒載體，運(yùn)用該 方法可以在大鼠的實(shí)驗(yàn)割牛下抑制人激^M瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 1)本發(fā)明MI了四種用于產(chǎn)生siRNA的DNA序列 DNA序列1 SEQ IDNO.l
5'"GArCCAGGAAnAAGAGAAGCAACAl|3SC^SArGTTGCTrCTCnAAITCCl|TnTJX^SKA-3' SEQEDNO.2
3'"GTCCTTAAITCTCTrCGTrGTAMi6TJd^TACAACGAAGAGAArrAAGGA^5IIS^R3T[TCGA -5,DNA序列2 SEQ IDNO.3
5'"GATCCGCGTGArGAGTTGCACGGTGGAGGTGAGG^^^歡CTCACCTCCACCGTGCAACTCArCACGCi SEQ IDNO.4 AAAAAACTCGAGTTCGA-5'
DNA序列3 SEQ IDNa5
5'^GATCCGTGGAATGAACCACTGGAArn^ll^^AAAITCCAGTGGTrcArrCO5i]fiflHi0i:ClgiA-3， SEQ IDNO.6
3'^GCACCTTACITGGTGACCTrAA^^(:CTr(lrnAAGGTCACCAAGTAAGGTiJi^l^A0^TrCGA-5'
DNA序列4 SEQ IDNO.7
5'-GATCCAGGGACCAGTACATGAGGACI^;^ft離GTCCTCArGTACTGGTCCCnil]^^^lA-3' SEQ DDNO.8
3'<}TCCCTGGTCArGTACTCCTGA|C|||^l6crCAGGAGTACArGACCAGGGAAAAAAA#TCGAGTrCGA-5，
包含戰(zhàn)四組DNA序列的組合的質(zhì)粒為本發(fā)明的微范圍，具懶口下質(zhì)粒為DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/Pgenesil-l 。質(zhì)粒DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列 3、 DNA序列4/Pgenesil-1的通用結(jié)構(gòu)如圖2示。質(zhì)粒構(gòu)建方法為如下，最終在Pgenesil-l中形成 的酶切位點(diǎn)JI頃序?yàn)橐籋indlII""DNA序列HamHI~U6啟動^^coRHDNA序列2"^amHI""U6啟動子 ^coRHDNA序列3~^amHI~U6啟動^fix)RHDNA序列4~BamHI""U6啟動^BssHn"^XbaUotl
2))本發(fā)明在發(fā)明1的基礎(chǔ)上將DNA序列-1 、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/ Pgenesil-l 質(zhì)粒的EGFP切除，插入人源PTEN或者p53或者Cx43基因.(上^^種基因序列可以在公共 庫中Si旬，非本發(fā)明發(fā)現(xiàn))。包含戰(zhàn)四組DNA序歹啲樹可組合以及與人源PTEN或者p53赫 Cx43基因組合的質(zhì)粒為本發(fā)明的微范圍。具體質(zhì)粒為DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN或者p53或者Cx43基0/Pgenesil-l 。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極鄉(xiāng)
本發(fā)明與傳統(tǒng) 點(diǎn)和多靶點(diǎn)抑癌基因治療相比，基于RNAife^:、靶向EGFR信號通珞的 ^基因治療的質(zhì)粒在體外倉魄著的提高基因治療的效果。
圖l質(zhì)粒構(gòu)建圖譜，在Pgenesil-l中形成的酶切位點(diǎn)",為"Hindffl""DNA序列l(wèi)"BamHI"U6啟 動:^~EcoRI"^DNA靜!J2"^amH^"U6啟動:？^coRI~^DNA序列34amHI~U6啟動子^coRI"DNA序 列4^amHI"U6啟動T^ssHn—XbahHSfoth^stl。
圖2是酶切鑒定分析目的基因片段DNA序列1+2與目的基因片段DNA序列連接^C力。
圖3是酶切鑒定分析目的基因片段K^RNAi與Cx43 ^iiM禾iai接成功。
圖4是酶切鑒定分析目的基因片段g RNAi與PTEN ^iiM禾鏈接成功。
圖5是酶切鑒定分析目的基因片段K^RNAi與p53 ^iM豐i^接成功。
圖6 U251裸鼠皮下荷瘤模型組織病理分析結(jié)果。(1對照組；2:對照^粒組;3: - 8:不同組合
治療組)
具體m^;
實(shí)施例l針對癌基因的多基因RNAi質(zhì)粒載體的構(gòu)建構(gòu)建一鋪體編碼4條siRNA的質(zhì) 粒載體。
一. 實(shí)驗(yàn)材料
1.目的基因EGFR、 PDKpllO、 K-RAS。 DNA序列14。所用麟T4DNALigase 、 Sacl 、 Sail 、 EcoRI 、 Pstl、 Xbal、 Hindm、 Bamffl等(購自NEB公司)。 表l、設(shè)計(jì)用于RNAi的目的基因序列
序列編碼GenBankNO.
SEQ IDNO.l畫"005228
SEQ IDNO.2畫都228
SEQ EDNO.3麗都228
SEQ IDNO.4NiVWX)5228
SEQ IDNO.5畫006219.1
SEQ IDNO.6畫006219.1
SEQ IDNO.7M54968
SEQ IDNO.8M54968
2.線性化的PEGFP6-1、 Pgenesil-l、 PEGFP6-3、 PEGFP64質(zhì)粒載體 ①PEGFP6-1的MCS如下
—Hindm—Insert DNA—BamHI—U6啟動^"EcoRI—Sac1—Kpnl—Sall—BssHH— XbaI~NotI—Psd—② Pgenesil-l的MCS如下
^indm—Insert DNA~^amHI~U6啟動^-^coRI—Sail—Xbal—
③ PEGFP6-3的MCS如下 ^indffl~~InsertDNA~BamHI~U6啟動^"BssHIF"Xbal"Notl"-Pstl—
PEGFP64的MCS如下
~ilindffl—Insert DNA~^amHI~U6啟動^^coRFHPst1— 用BamHI和Hindm雙酶切以上四種質(zhì)粒，1 % Agase 繊電泳回收大片段，即為線 性化質(zhì)粒載體；以上四種質(zhì)粒載體除MCS不同外，其余序列完t樣。 3.所用麟T4DNALigase 、 Sacl 、 Sail 、 EcoRI 、 Pstl、 Xbal、 Hin孤、BamHI等(購 自NEB公司)。 二.實(shí)驗(yàn)方法
1. 單鏈目的基因片段的退，接
各用50ul annealing buffer溶解戰(zhàn)合成20D單鏈目的基因片段。 各取2ul (即2ulDNA序列l(wèi)-l+2ulDNA序列l(wèi)隱2) +16ul畫alingbuffer混勻。 94。C水浴退火自然7鄉(xiāng)體溫。 各取lul退妒物9ul H20做100倍稀釋。
2. 稀釋退火片段分別與線性化PEGFP64、 Pgenesil-l、 PEGFP6-3、 PEGFP64質(zhì)粒載體的連接。
鵬連接反應(yīng)如下
DNA序列1稀Pii火片段與PEGFP6-1載體的連接 DNA序列2稀5^I火片段與Pgenesil-l載體的連接 DNA序列3稀釋退火片段分別與PEGFP6-1 、 PEGFP64載體的連接 DNA序列4 ^PM火片段與PEGFP6-3載體的連接 鵬連接反應(yīng)餅如下
稀糨火片段 M 7線性鵬立載體 lul
10 XLigase Buffer M
T4DNALigase M H20 6ul
22。C^JC浴反艦夜。
3. 各取5ul過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ，分別涂布a Kan^抗性(終濃度為 20ug/ml)的LB平肚，37。C恒溫節(jié)^l夜。
4. 從齡培養(yǎng)皿上^t兆取3個單克隆離接種于3ml含Kanar抗性(終濃度為20ug/ml)的 LB培養(yǎng)液中，37。C恒溫?fù)u床(250rpm)培養(yǎng)過夜。
5. 用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，M別l鵬切鑒定
①DNA序列1質(zhì)豐姻EcoRI做酶切鑒定
DNA 8.5ul 10 xH Buffer M EcoRI 0.5ul 37DjC浴反應(yīng)3h
1 %Agase MK電泳，電泳圖譜如下
經(jīng)酶切分析因?yàn)橘|(zhì)粒載體PEGFP6-1里面本來只有一個EcoRI的酶切位點(diǎn)，而DNA序
列1-2質(zhì)粒能被EcoRI酶切出一條約400bp的DNA條帶，說明目的基因片段已，入到
質(zhì)粒載體PEGFP6-1里。
②DNA序列2、 DNA序列4質(zhì)粒分別用Sacl做酶切鑒定
DNA 8.5ul 10XLBuffer lul Sacl 0.5ul 37。C^C浴鵬3h
1 %Agase ; 電泳，電泳圖i普如下
經(jīng)酶切分析因?yàn)橘|(zhì)粒載體Pgenesil-1和PEGFP6-3里面本來是沒有Sacl的酶切位點(diǎn)的，
而DNA序列2-6、 DNA序列4-14質(zhì)粒均育灘被Sacl所酶切，說明目的基因片段
已經(jīng)分別插入到戰(zhàn)兩個質(zhì)粒載體里。③DNA序列3質(zhì)粒分別用Sail做酶切鑒定 DNA 8.5ul 10 xH Buffer lul Sail 0.5ul 37。C^C浴反應(yīng)3h
1^AgaseM^電泳，電泳圖譜如下
6. 挑取克隆正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液DNA序列1-2、 DNA序列24、 DNA序列3-8、 DNA序列
4-14去測序。
經(jīng)測序結(jié)果分析均為插入正確的克隆質(zhì)粒，而皿ftfc^^設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。
7. 質(zhì)粒DNA序列l(wèi)-2、 DNA序列2"6的SacI+SalI雙酶切分別回收大片段和小片段
DNA 5ul
10 xL Buffer 2ul
Sacl lul
H20 12ul
各加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。
—70。C職方燈15 miiU5000rpm離心15mir^
70%酒精^^滌^^，然后用17ulH20充分溶解。
辦用Sal^酶切
上步反應(yīng)物 17ul
10 xH Buffer 2ul Sail M
37。C^浴反艇夜。
1^Agase凝膠電泳
用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回收DNA序列1-2大片段和DNA序列2>6小片段(U6啟
動子+DNA序列2約400bp)
8.質(zhì)粒DNA序列3-8、 DNA序列4~14的SacI+XbaH雙酶切分別回收大片段和小片段微用Sacl酶切
DNA 5ul
10 xL Buffer 2ul
Sacl lul H20 12ul
37。C水浴反艦夜。
加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。
—70。C職驢15 miiU5000rpm離心15我
70%酒精洗滌兩遍，然后用15ulH20充分溶解。
鵬用XbaI酶切
上步反應(yīng)物 15ul
10 xM Buffer 2ul
0.1%BSA 2ul Xbal M
37DJC浴反艦夜。
r^Agase凝膠電泳
用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回收DNA序列3-8大片段和DNA序列4-14小片段(U6啟 動子+DNA序列4約400bp)
9.回收小片段與回收大片段的連接-
① DNA序列1-2回收大片段與DNA序列2-6回收小片段的連接
② DNA序列3-8回收大片段與DNA序列114回收小片段的連接
連接反應(yīng)餅如下
回收小片段 4ul
回收大片段 4ul
10 x Ligase Buffer 1 ul
T4DNALigase lul
22。K浴反艦夜。10. 各取5ul過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ，分別涂布于含Kana'抗性(終濃度為 20ug/ml)的LB平feJ:， 37。C恒溫箱培養(yǎng)過夜。
11. 從齡i歸皿上^M取3個單克隆離接種于3ml含Kanar抗性(終濃度為20ug/ml)的
LB培養(yǎng)液中，37。C恒溫?fù)u床(250ipm)歸過夜。
12. 用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，并用BamHI做酶切鑒定
DNA 8.5ul 10 xK Buffer lul BamHI 0.5ul 37DjC浴鵬3h
13. 質(zhì)粒DNA序列1+2-1 、 DNA序列3+44的Sall+Pstl雙酶切分別回收大片段和小片段(約
800bp)
DNA 6ul
10 xH Buffer 2ul
Sail lul Pstl M H20 編
37。C水浴^^1夜。 lXAgaseMI^電泳
用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回收DNA序列1+2-1大片段和DNA序列3+44小片段 (DNA序列3+U6啟動子+DNA序列4+U6啟動子約800bp)
14. 質(zhì)粒DNA序列1+2-1 、 DNA序列3-10的Sall+Pstl雙H切分別回收大片段和小片段(約
400bp)
DNA 6ul
10 xH Buffer 2ul
Sail lul Psil lul H20 lOul
37。C^C浴反艦夜。 1^Agase繊電泳
15. 回收小片段與回收大片段的連接
1①DNA序列1+2-1回收大片段與DNA序列3+44回收小片段的連接
②DNA序列1+2-1回收大片段與DNA序列3-10回收小片段的連接
連接反應(yīng)餅如下
回收小片段 4ul
回收大片段 4ul
10 x Ligase Buffer ltd
T4DNALigase lul
22X^JC浴反艦夜。
16. 各取5ul過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ，分別涂布于含Kan^抗性(終濃度為 20ug/ml)的LB平肚，37。C恒溫箱培微夜。
17. 從^h培養(yǎng)皿上^t兆取3個單克隆離接種于3ml含Kan^抗性(終濃度為20ug/ml)的
LB培養(yǎng)液中，37。C恒溫?fù)u床(250ipm)歸過夜。
18. 用試劑盒小量提取質(zhì)粒(中鼎公司)，并用Hin孤+Pstl做酶切鑒定
DNA 7ul
10 xM Buffer 2ul
Hindffl 0.5ul
Pstl 0.5ul
H20 10ul
37。C水浴鵬3h
實(shí)施例2 DNA序列-1 、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN或者p53或者 Cx43基0/PgenesiM的構(gòu)建 1、合成PCR引物
P53-l: 5'- CTAGCTAGCTAGCCGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGAr-3' P53國2: 5'- GAAGATCTTCTTCAGTCTGAGTCAGGCCC^rcTGT陽3, CX43-1: 5'-CTAGCTAGCTAGCCACCATGGGTGACTGGAGCGCCTTAG-3' CX43-2: 5'陽CCGCTCGAGCTTCAGATCTCCAGGTCArCAGGCCGA-3' PTEN-1: 5'-GGGGTACCCGCCACCATGACAGCCATCATCAAAGAGAT-3'PTEN-2: 5'-CCGCTCGAGCGGTTCAGACTnTGTAAnTGTGTATG-3'
表2、設(shè)計(jì)用于PCR弓胸的基因序列
序列編碼GenBankNO.
P53畫000546.3
Cx43NP 000156.1
PTENNP 000305.3
2、 DNA質(zhì)粒Pcp53-SN3、 PbluescriptR《x43、 pGz21 &Xz-PTEN
3、 所用麟TaqHS、 Nhel、 Xhol、 BglH、 Kpnl
1 、用TP53基因分別^f^i^體里的EGFP基因
①PCR擴(kuò)增TP53基因分別以TP53-1、 TP53-2為上下游弓物，以質(zhì)粒Pcp53-SN3為禾鎌， 90°C 45s 58°C 45s 72°C 60s 30 cycles PCR擴(kuò)增TP53基因。
PCR反應(yīng)餅
10xPCR Buffer5ul
10mMdNTPMix2ul
10uMTP53-llul
10uMTP53-2lul
T叫HS0.5ul
Pcp53國SN30.5ul
mo40ul
PCR反應(yīng)結(jié)束后，1 % Agarose凝膠電泳回收目的TP53基因片段，用膠回收試劑盒回收， 用30ul鵬艦。
②質(zhì)粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA序列1+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4、基因
TP53的Nhel和BglH酶切
Q5fe用Nhel酶切
DNA 5ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel lul H20 12ul
37。C^浴S^1夜。 各加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。—70。C職體30 miiU5000ipm離心15min^
用70%酒精洗滌沉淀兩次，然后各用17ul H20充分溶解。
辦用BglH酶切
上步反應(yīng)物 17ul
10 xH Buffer 2ul BglH lul
37。C水浴反艦夜。
1 %Agarose 電泳，用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回M粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA 序列l(wèi)+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4、基因TP53 Nhel+BglH大片段。
③ 基因TP53分別與質(zhì)粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA序列l(wèi)+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序 列1+2+3+4
Nhel+BglH酶切回收大片段的連接
其連接反應(yīng)餅如下
回收TP53基因片段 4ul
回t&M申，切大片段 4ul
10 x Ligase Buffer lul T4DNALigase lul
22。C水浴反艦夜。
④ 各取5ul連接產(chǎn)鵬化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ，分別涂布矜Kanaf抗性的LB平敬匕37°C 恒溫培離咅養(yǎng)過夜。 ,
從齡培養(yǎng)皿上^t兆取3個單克隆m^種于3ml含Kanar抗性的LB培養(yǎng)液中，37t恒
齟娜t^夜。
⑥用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，并分另,Nhel+Bgffl做酶切鑒定 酶切反應(yīng)綠.
DNA 7ul 10 xM Buffer 2ul Nhel 0.5ulBglH 0.5ul H20 lOul
37。C水浴反應(yīng)3h. 2、用CX43基因分別割mii載體里的EGFP基因
① PCR擴(kuò)增CX43基因分別以CX43-1、 CX43-2為上下游引物，以質(zhì)粒PbluescriptR《x43 為豐鎌，90°C 45s 58°C 45s 72°C 60s 30 cycles PCR擴(kuò)增CX43基因。
10xPCR Buffer 5ul 10mMdNTPMix 2ul 1隨CX43隱1 lul l隨CX43-2 lul TaqHS 0.5ul PbluescriptR"Cx43 0.5ul H20 40ul
PCR反鵬束后，1 %Agarose ;繊電泳回收目的CX43基因片段，用膠回收試劑盒回收， 用30ulH20 i 。
② 質(zhì)粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA序列l(wèi)+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4、基因 CX43的Nhel和Xhol酶切
DNA 5ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel lul
H20 12ul
37。C^C浴反艦夜。
各加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。
—70。C》錄t^a 30 miiU5000rpm離心15min^
用70%酒精洗滌沉淀兩次，然后各用17ulH20充分溶解。
②再用XhoI酶切
上步破物 17ul
10 xH Buffer 2ul Xhol lul
1537。C^C浴反艦夜。
1 % Agarose凝膠電泳，用膠回收i式劑盒(中鼎公司)分別回收質(zhì)粒Pgenesil-1 、 HK+HK、 DNA 序列1+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列l(wèi)+2+3W、基因CX43 Nhel+Xho1酶切大片段。 ③基因CX43分別與質(zhì)粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA序列l(wèi)+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序 列1+2+3+4
Nhel+Xho1酶切回收大片段的連接
其連接反應(yīng)餅如下
回收CX43基因片段 4ul
回頓,切大片段 4ul
10 x Ligase Buffer lul
T4DNALigase M
22。C水浴反艦夜。
④ 各取5ul連接^轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ，分別涂布矜Kanar抗性的LB平feJ:， 37°C 恒溫培養(yǎng)箱培微夜。
⑤ 從^H錄皿上^t兆取3個單克隆^^種于3ml含Kanar抗性的LBi咅鎌中，37'C恒 溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。
⑥ 用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，將別用Nhel+XhoI做酶切鑒定
酶切反應(yīng)餅
DNA 7ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel 0.5ul Xhol 0.5ul H20 編
37。C^C浴反應(yīng)3h 3、用PTEN基因分別替f^^體里的EGFP基因
①合成DNA引物片段tdEGFP-l、 tdEGFP-2的退火
分別用50ul annealing buffer溶解20D的tdEGFP-l 、 tdEGFP-2 DNA弓|物對應(yīng)各取2ul (即2ul tdEGFP-l+2ul tdEGFP-2) +16ul annealing buffer混勻 94。C退火自然7細(xì)輕溫。 取M退^物+99ul H20做100倍##
② 質(zhì)粒PgenesiM、 HK+HK、 DNA序列1+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4的NheI 和XhoI酶切
微用NheI酶切
DNA 5ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel lul H20 12ul
37。C^C浴反磁夜。
各加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。
—70。C職方燈30 miiU5000ipm離心15min^
用70%酒精洗滌沉淀兩次，然后各用17ul H20充分溶解。
鵬用XhoI酶切
上步鵬物 17ul
10 xH Buffer 2ul Xhol lul
37T^JC浴反磁夜。
1 % Agarose ; 電泳，用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回iW粒Pgenesil-l 、 HK+HK、 DNA 序列l(wèi)+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4 Nhel+Xhol酶切大片段。
③ 稀糊^tl tdEGFP分別與賺Pgenesil-l 、 HK+HK、 DNA序列1+2、 DNA序列1+2+3 、 DNA序列1+2+3+4 Nhel+Xhol酶切回收大片段的連接
其連接反應(yīng)餅如下
^ii^tl tdEGFP 4ul 回M^K切大片段 4ul10 xLigase Buffer lul T4DNALigase M
22。C7條反艦夜。
④各取5ul連接產(chǎn)鵬化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ,分別涂布矜Kanar抗性的LB平fei:， 37°C 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
從^t培養(yǎng)JULh^t兆取3個單克隆離接種于3ml含Kanar抗性的LB培鎌中，37'C恒
溫?fù)u形歸過夜。
◎用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，并分別用NM+XhoI做酶切鑒定 酶切反應(yīng)餅
DNA 7ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel 0.5ul Xhol 0.5ul H20 編
37X^浴反應(yīng)3h..
其亞克隆成功的質(zhì)粒分別命名為質(zhì)粒tdPgenesil-l、 tdHK+HK、 tdDNA序列l(wèi)+2、 tdDNA 序列1+2+3、 tdDNA序列l(wèi)+2+3M ⑦PCR擴(kuò)增PTEN基因分別以PTEN-1 、 PTEN-2為上下游弓l物，以質(zhì)粒pGz21 &Xz-PTEN 為賺，90°C 45s 55°C 45s 72°C 60s 30cycles PCR擴(kuò)增PTEN基因。 PCR反應(yīng)餅
PCR Buffer 5ul lOmMdNTPMix 2ul
l隨PTEN-l lul
10uMPTEN匿2 lul
TaqHS 0.5ul
pGz21&Xz-PTEN 0.5ul
H20 40ul
PCRfe!^束后，1 % Agarose ;繊電泳回收目的PTEN基因片段，用膠回收試劑盒回收， 用30ulH20 。
⑧質(zhì)粒tdPgenesil-1 、 tdHK+HK、 tdDNA序列1+2、 tdDNA序列1+2+3、 tdDNA序列1+2+3+4、基因PTEN的Kpnl和Xhol酶切:
DNA 5ul
10xLBuffer 2ul
Kpnl lul
H20 12ul
37X^K浴SiSai夜。
各加入2ul5MNacl，混勻，再加入5M酒精，混勻。
—70。C職方燈30 miiU5000rpm離心15mii^
用70%酒精洗滌沉淀兩次，然后各用17ul H20充分溶解。
辦用XhoI酶切
上步反應(yīng)物 17ul
10 xH Buffer 2ul Xhol M
37。C水浴反艇夜。
lXAgaroseMK電泳，用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回TO粒tdPgenesil-l、 tdHK+HK、 tdDNA序列1+2、 tdDNA序列1+2+3、 tdDNA序列1+2+3+4、基因PTEN Kpnl+Xho1
大片段。
⑨基因PTEN分別與質(zhì)粒tdPgenesil-l、 tdHK+HK、 1dDNA序列l(wèi)+2、 tdDNA序列1+2+3、 tdDNA序列l(wèi)+2+3W Kpnl+Xho1酶切回收大片段的連接
其連接反應(yīng)餅如下
回收PTEN基因片段 4ul
回M粒酶切大片段 4ul
10 x Ligase Buffer lul
T4DNALigase M
22。C7K浴反腿夜。
⑩各取5ul連接J^^化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，分別涂布矜Kanar抗性的LB平社，37°C
19恒溫i^fl培養(yǎng)過夜。
從^^培養(yǎng)皿上^t兆取3個單克隆離接種于3ml含Kanar抗性的LB培鎌中，37'C恒 溫?fù)u鵬養(yǎng)過夜。
用試劑盒小量提頓粒(中鼎公司)，將另偶Kpnl+XhoI做酶切鑒定 酶切反應(yīng)餅
DNA 7ul
10 xM Buffer 2ul
Kpnl 0.5ul Xhol 0.5ul H20 編
370K浴反應(yīng)3h
實(shí)施例3 、 DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN或者p53或 者Cx43基g/Pgenesil-l質(zhì)粒的療效實(shí)驗(yàn)
材料施
一、 材料
1. Alif臓母細(xì)鵬細(xì)胞腦。
2. 轉(zhuǎn)染齊偽Lipofectamine2亂
3. BALB/c-nu (SPF)雌性裸小鼠，4^6周齡，體重15-18克，期0只，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)物研娜實(shí)驗(yàn)t/mW場。飼養(yǎng)餅SPF級無菌層鵬中，恒溫(22°C-25°C)、 恒濕(55±5%)飼養(yǎng)，所用食物和7娥滅菌處理。
二、 方法
1. 細(xì)胞培養(yǎng)
細(xì)胞基及培養(yǎng)斜牛含10T。FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的總體積約為i歸瓶容積的1/10， 培#^牛為37°C， 5%C02翻閏線。
2. 瘤細(xì)脫懸液擬中
對數(shù)生長期的U251 ，母細(xì)M細(xì),0.125Q/。^l^削七，1000rpmX10 ^H中常溫離心去上 清，以PBS離心洗滌2次;計(jì)算細(xì)鵬，調(diào)整細(xì)胞濃輕5 X 107/ml，將細(xì)脫懸浮于 清DMEM培鎌中，第iJ鵬脫懸液。然后用帶6甜頭的注射翻取細(xì)胞懸液200m1，接種于裸鼠雙側(cè)腋 部、鼠鼷部皮下。該組接種裸鼠3只，為第一代荷瘤裸鼠，用于再進(jìn)行裸鼠腫瘤異條植。
3. 瘤組織鵬種
經(jīng)細(xì)胞接種成功的移禾離(直徑約7mm)，進(jìn)行裸鼠腫瘤異儲植。斷5^b死荷瘤裸鼠，在 無菌割牛下，解剖切鵬當(dāng)大小棚中瘤組織，立即方M^JflL清DMEM中，修剪腫瘤組織，去除 月旨肪和柳中瘤組織，并用^ifDMEM洗滌，將其剪成lmm3大小的瘤組織塊#^種用。接 種前，用碘ST和75%乙醇消毒接種部位的艦，先用消毒的剪刀在要接種的裸鼠左側(cè)鼠鼷部艦 處剪一小口，而后用無菌鑷夾取一小瘤±央，沿^JK破口，入皮下接種。最后，75%乙醇消毒皮 膚破口。
4. 動物鄉(xiāng)
第一代荷瘤裸鼠的腫瘤鄉(xiāng)紐異條植，倉g在裸鼠中形成生^M穩(wěn)定的腫瘤。本研^ffl穩(wěn) 定鵬的第八代荷瘤裸鼠的皮下腫瘤作為瘤源。64只動物隨機(jī)分為8組，每組8只，分別是U251 對照組、空itM粒治療組(1)、單EGFR靶點(diǎn)的RNAi治療組(2)、 EGFR聯(lián)合PDGCB的RNAi 治療組(3)、 EGFR、 PDGCB和K-RAS^RNAi治療組(4)、 EGFR、 PK3CB和KRAS^ RNAi與Cx43聯(lián)合治療組(5)、 EGFR、 PK3CB和KRAS ^ RNAi與p53聯(lián)合治療組(6)、 EGFR、 PK3CB和KRASi^RNAi與PTEN^治療組(7)。
5. 療效i離
1)治療時機(jī)的選銀
瘤組織i^^種約兩周后，待皮下腫瘤^f只長至5(M00mm3時，即腫瘤直徑在5mm左右時， 原位ait質(zhì)粒-Lipofectamine2000混，，進(jìn)行腫瘤的治療實(shí)驗(yàn)。
2)治;l ^法，時間間隔及劑量M—次治療開始，每四^it行一次治療，連續(xù)3次。具體 方法如下(1)濃度為2|ig^l的質(zhì)粒5^1和10pl Lipofectamine2000混勻后，室^J文置30min。 (2) 裸鼠皮下腫瘤1~1.5011范圍內(nèi)局部^|^鵬、酒精消毒。(3)無菌微量湖器吸取，g朗中瘤5證 左右m，皮下潛行到中瘤，多點(diǎn)緩慢激，每只裸鼠每次激總量為15^質(zhì)粒-Lipofectamine2000 混恤6. 腫瘤生長情ME察瘤組織±^^種約一周后，可看到裸鼠皮下成瘤，每隔3天用游l^尺測
量一瀏中瘤的長徑(a)及寬徑(b)，腫瘤^R計(jì)算公式如下V氣ab2y2
7. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)鞭點(diǎn)和多靶點(diǎn)抑癌基因治療相比，基于RNAi技術(shù)、靶向EGFR信 號通珞的 ^基因治療的質(zhì)粒在體外會濕著的提高基因治療的效果。
表3、不同治療會朋中瘤^f只增^dim平均值(mm3沃)
4天6天8天10天12天14天16天18天20天
第一組33.372745.39767 73795.6731113.1197131.1238257.0371346.6458462.(5841
第二組35 408242.119151.920257.891264.225892.7096134.1889173.439241.8206
第HM33.262539.160850.967666.441779.747(5105.3349137.3S25164.1943199.9723
第四組17.105218.124720.154421.985923.733230.143544.5卯170.6204103.0814
第五組27.972330.179134.31237 1(57841.482553.833581.255103.(5201141 3729
第六組12.955413.833415.582116 233216.750221.20429.743646.627562.3419
第七組10.750812.515912.783215.392515.3(54419.905328.24444.817467.0014
第一組Pgenesil-l對照質(zhì)粒治療組
第Z^a:質(zhì)粒DNA序列-1 、 DNA j^!j 2/ Pgenesil-l質(zhì)粒治療組
第蓬質(zhì)粒DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3 Pgenesil-l質(zhì)粒治療組
第四組質(zhì)粒DNA序列-1、 DNA靜U2、 DNA序列3、 DNA序列4/Pgenesil-1質(zhì)粒治療組
第5M:質(zhì)粒DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源Cx43基H/PgenesiM質(zhì)粒治療組
第六組質(zhì)粒DNA序列-1 、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN Pgenesil-l質(zhì)粒治療組
第憤賺DNA序列-1、 DNA劍2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源p53/Pgenesil-1質(zhì)粒治療組序列表
〈110〉天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
〈120〉基于RNAi技術(shù)的多基因g基因治療的質(zhì)粒載體
<腸8
〈210> 1
〈211〉 68
〈212〉 DNA
〈213〉 AX序列
<■> 1
gatccaggaa ttaagagaag caacatttca agacgatgtt gcttctctta attccttttt 60 tgaattca 68
<210> 2 <211> 69 〈212〉薩 <213> AX序列 <■> 2
gtccttaatt ctcttcgttg taaagttctg ctacaacgaa gagaattaag gaaaaaaact 60
taagttcga 69
<210> 3
〈211〉85
<212〉 DNA
23<213> AX序列 〈 3
gatccgcgtg atgagttgca cggtggaggt gaggttcaag acgcctcacc tccaccgtgc 60 aactcatcac gcttttttga gctca 85
〈210>4 <211〉 85 〈212〉 DNA 〈213〉 AX序列 <400>4
gcgcactact caacgtgcca cctccactcc aagttctgcg gagtggaggt ggcacgttga 60
gtagtgcgaa aaaactcgag ttcga 85
<210> 5
〈211〉 70
〈212〉 DNA
〈213〉 AX序列
<400> 5
gatccgtgga atgaaccact ggaatttcta tggaacaaat tccagtggtt cattccattt 60 tttgtcgaca 70
<210> 6 <211> 70〈212> DNA <213> AX序列 〈400〉 6
gcaccttact tggtgacctt aaagatacct tgtttaaggt caccaagtaa ggtaaaaaac 60 agctgttcga 70
〈210〉 7 <211> 69 <212> DNA <213〉 AX序列 〈400〉 7
gatccaggga ccagtacatg aggactttca agacgagtcc tcatgtactg gtcccttttt 60 ttgagctca 69
<210〉 8 〈211> 69 〈212> DNA 〈213〉 ADW 〈400> 8
gtccctggtc atgtactcct gaaagttctg ctcaggagta catgaccagg gaaaaaaact 60 cgagttcga 69
權(quán)利要求
1、一種基于RNAi技術(shù)的多基因聯(lián)合基因治療質(zhì)粒載體，其特征是聯(lián)合應(yīng)用2個以上RNAi序列，采用基因重組技術(shù)構(gòu)建siRNA質(zhì)粒載體為下述情況之一1)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈；2)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈；3)序列表中的SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈；4)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈；5)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.7為正義鏈、SEQ ID NO.8為反義鏈；6)序列表中的SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈，SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.7為正義鏈、SEQ ID NO.8為反義鏈；7)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈，SEQ IDNO.7/SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.7為正義鏈、SEQ ID NO.8為反義鏈。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，，征在于J^^《iM—種質(zhì)粒載,切除EGFR后置 換成為PTEN、 p53赫Cx43。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2戶腿的質(zhì)粒載體，，征在于具有圖1戶標(biāo)的物理圖譜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于RNAi技術(shù)的聯(lián)合基因治療質(zhì)粒載體。目的是通過該質(zhì)粒載體同時抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞EGFR、PI3K p110亞基和Kras等三種癌基因表達(dá)，同時恢復(fù)抑癌基因(如PTEN，或者Cx43，或者p53)的表達(dá)。具體應(yīng)用方法是應(yīng)用RNAi技術(shù)阻斷上述三種癌基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，并恢復(fù)抑癌基因(如PTEN，或者Cx43，或者p53)的表達(dá)。本發(fā)明提供了四組siRNA序列，并提供基于RNAi技術(shù)的聯(lián)合基因治療siRNA質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本方法將癌基因的RNAi治療與抑癌基因的過表達(dá)治療聯(lián)合應(yīng)用，將可以通過埋植、立體定位注射、靜脈注射和頸動脈注射等方法，實(shí)現(xiàn)抑制實(shí)人膠質(zhì)瘤生長的效果。
文檔編號C12N15/63GK101492690SQ20081014569
公開日2009年7月29日 申請日期2008年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日
發(fā)明者康春生, 張安玲, 浦佩玉, 王廣秀, 賈志凡, 強(qiáng) 黃 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院