專利名稱：破骨細(xì)胞質(zhì)子泵亞基a3的RNA干擾靶點及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及破骨細(xì)胞質(zhì)子泵亞基 a3序列上用于RNA干擾的干擾耙點，以及針對這些耙點的以各種方式獲得的 小干擾RNA分子以及其在制備治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥是發(fā)病率高、死亡率高、保健費用消耗大的最常見的骨代謝疾 病。據(jù)估計，半數(shù)以上的婦女和大約三分之一的男性在其生存期內(nèi)會發(fā)生骨質(zhì) 疏松性骨折。骨折給人們的生活帶來極大的痛苦，輕者使人們生活質(zhì)量下降， 重者將導(dǎo)致癱瘓(如股骨骨折)并由此引發(fā)很多并發(fā)癥甚至導(dǎo)致死亡。這些疾 病的產(chǎn)生與破骨細(xì)胞(Osteoclast)的過度活躍有關(guān)。破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞 (Osteoblast)是骨中的兩類重要細(xì)胞，分別負(fù)責(zé)骨吸收與骨形成，兩者之間的平 衡保證了成年動物及人類骨量的恒定；然而在破骨細(xì)胞的活性大于成骨細(xì)胞活 性的時候，破骨細(xì)胞對骨的吸收大于成骨細(xì)胞的骨形成作用，導(dǎo)致骨密度下降 最終出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，對于這些疾病的治療必須抑制破骨細(xì)胞的活性。
破骨細(xì)胞V-ATP酶負(fù)責(zé)破骨細(xì)胞的細(xì)胞外酸化過程，使骨去礦化并為蛋 白酶降解骨有機成份提供酸性微環(huán)境。a3是破骨細(xì)胞V-ATP酶具有的特異亞 基，1996年該亞基被發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)并成功克隆，并于1999年發(fā)明人將a3 基因敲除，在小鼠中觀察了該基因在破骨細(xì)胞骨吸收中的作用。結(jié)果表明，所 有的a3突變純合體(-/-)小鼠生長遲緩，出現(xiàn)了長骨生長異常，骨建造及再 造缺失的骨質(zhì)硬化，牙齒解體，出生后大約4周齡死亡；&3-/-小鼠缺乏骨髓腔， 骨生長面擴大，轉(zhuǎn)化軟骨區(qū)域延伸；&3-/-型小鼠的破骨細(xì)胞附著在骨上且數(shù)目 正常，但是不能形成骨吸收陷窩。體外培養(yǎng)的a3-A小鼠破骨細(xì)胞缺乏細(xì)胞外 酸化功能，不能使骨去礦化。這些結(jié)果表明a3基因是破骨細(xì)胞特異質(zhì)子泵的 基本組成部分。因此，&3-/-小鼠出現(xiàn)的嚴(yán)重骨質(zhì)硬化是由于破骨細(xì)胞失去了細(xì)胞外酸化功能。a3僅在破骨細(xì)胞中表達(dá)，a3 -/-小鼠腎的質(zhì)子泵不受影響，說 明a3是破骨細(xì)胞專一表達(dá)的基因。因此，a3可以作為最有希望的藥物靶點特 異抑制破骨細(xì)胞的活性。本發(fā)明設(shè)計和體外慢病毒表達(dá)a3-shRNA用于抑制破 骨細(xì)胞的骨吸收活性，以達(dá)到治療骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供破骨細(xì)胞質(zhì)子泵亞基a3的mRNA干擾靶點， 針對該耙點設(shè)計人工序列，并將該序列在表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)獲得小干擾 RNA分子，并構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體。因此本發(fā)明的目的也在于提供針對 a3的小干擾RNA分子，包含該小干擾RN A分子的表達(dá)載體以及由其轉(zhuǎn)化的 慢病毒表達(dá)載體，此外，由表達(dá)載體表達(dá)產(chǎn)生的、作為小干擾RNA分子前體 的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA分子也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明的另一目的在于提供a3的RN A干擾靶點在制備治療骨質(zhì)疏松藥 物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，根據(jù)破骨細(xì)胞質(zhì)子泵亞基a3mRNA序列，體外合 成抑制a3基因表達(dá)的可表達(dá)雙鏈小干擾RNA (SiRNA)片段的DNA序列， 并克隆到短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA (ShRNA)的表達(dá)質(zhì)粒上，表達(dá)并篩選對破骨細(xì)胞 吸收抑制作用較強的a3-SiRNA ，確定RNA干擾靶點序列，SEQ ID NO. 1~3 為針對a3的RNA干擾耙點序列，優(yōu)選的RNA干擾耙點具有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列。SEQ ID NO. 4~5為針對干擾靶點序列1的設(shè)計的用于表 達(dá)SiRNA的DNA序列，SEQ ID NO. 6~7是針對干擾耙點序列2設(shè)計的用于 表達(dá)SiRNA的DNA序列，SEQ ID NO. 8 9是針對干擾耙點序列3設(shè)計的用 于表達(dá)SiRNA的DNA序列，每對序列均為互補序列。具體序列見表1和表 2.
SiRNA分子為雙鏈RNA分子， 一單鏈含有RNA耙點序列和在3'末端的 UU雙核苷酸尾(如SEQ ID NO. IO所示)，另一單鏈為互補鏈，雙核苷酸尾 UU同樣位于3'末端。SiRNA進(jìn)入細(xì)胞后直接干擾目標(biāo)基因的表達(dá)。
4表1 a3 RNAi耙點序列序列號靶序列 序列長度位置(bp)
15，-AGAUGAAGGCAGUGUACCU-3，191056-1074
25 ， -GUAUCCUC AUUCACUUCAU-3'191977-1995
35，-ACGGACUGCUCAUGUUUCU-3'191389-1407
表2合成用于表達(dá)siRNA的DNA序列序列號序列堿基數(shù) GC含量
5 ，-GATCCCCAGATGAAGGCAGTGTACCT
4TTCAAGAGAAGGTACACTGCCTTCATCT6443.8%
TTTTTGGAAA-3'
3 ，-GGGTCTACTTCCGTCACATGGAAAGT
TCTCTTCCATGTGACGGAAGTAGAAAAA6443.8%
ACCTTTTCGA-5'
5 ，-GATCCCCGTATCCTCATTCACTTCATTT
6CAAGAGAATGAAGTGAATGAGGATACTT6437.5%
TTTGGAAA-3，
3,-GGGCATAGGAGTAAGTGAAGTAAAGT
7TCTCTTACTTCACTTACTCCTATGAAAAA6437.5%
CCTTTTCGA-5'
5 ， -GATCCCC ACGGACTGCTC ATGTTTCTT
8TCAAGAGAAGAAACATGAGCAGTCCGT6443.8%
TTTTTGGAAA-3，
3 ，陽GGGTGCCTGACGAGTACAAAGAAAG
9TTCTCTTCTTTGTACTCGTCAGGCAAAA6443.8%
AACCTTTTCGA-5，本發(fā)明的RNA靶點序列SEQ ID NO.2為具有19nt長度，在形成SiRNA 分子后，3'端加上UU雙核苷酸尾構(gòu)成分別具有21bp的雙鏈RNA而發(fā)揮功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，增加或減少幾個堿基的SiRNA序列在基因沉 默中可以具有同樣的功能，例如21~23bp的SiRNA序列已被證明在其他基因 的沉默中具有同樣功能(Nature 2001， (411):24, 494-98)。同樣可以理解的是， 也可以設(shè)計更長的序列，通過在發(fā)揮功能時被剪切為短的RNA序列而發(fā)揮作 用。
體外合成的抑制a3基因表達(dá)的基因序列克隆到表達(dá)載體后，表達(dá)ShRNA， ShRNA含有干擾靶點序列、干擾靶點序列的反義序列、短發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列(序 列如SEQ ID NO. 11所示)。形成ShRNA序列的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列優(yōu)選采用九個 堿基的loop環(huán)序列UUCAAGAGA，也可以用TTCG tetraloop ( Leukemia Research 30 (2006) 1013-1017)。短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，通過表達(dá)載體表達(dá)產(chǎn)生， 發(fā)揮功能時需要細(xì)胞內(nèi)Dicer酶切成siRNA分子干擾基因的表達(dá)，圖1示出 了通過合成序列克隆到表達(dá)載體，產(chǎn)生ShRNA，再加工成具有功能的SiRNA 的過程。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供a3基因的RNA干擾耙點在制備骨質(zhì)疏松藥 物中的應(yīng)用，慢病毒介導(dǎo)的小干擾RNA分子可抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性， 用于治療骨質(zhì)疏松等骨相關(guān)疾病。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)手段為
第一，在體外合成抑制a3基因表達(dá)的雙鏈SiRNA的DNA序列，并克隆 到shRNA表達(dá)質(zhì)粒上；
第二，用細(xì)胞外酸化功能和骨片吸收功能的檢測方法篩選對破骨細(xì)胞骨吸 收抑制作用較強的a3-SiRNA。
第三，通過破骨細(xì)胞功能實驗闡明a3敲低后破骨細(xì)胞骨吸收能力缺陷的 機制。
(一)a3-SiRNA的合成 1. SiRNA設(shè)計
采用Dharmacon siDESIGN center (http:〃www.dharmacon.com)設(shè)計針對a3 mRNA的特異耙序列，選取特異性的靶序列3條，且靶序列與人的相應(yīng) 靶序列90%相似。2、 單鏈SiRNA合成和純化 由Invitrogen公司合成純化
3、 雙鏈SiRNA的制備和表達(dá)ShRNA克隆的構(gòu)建
兩條互補的單鏈SiRNA經(jīng)加熱后退火處理形成雙鏈SiRNA，并將雙鏈 siRNA克隆到表達(dá)ShRNA的質(zhì)粒上。
(二)用細(xì)胞外酸化功能和骨片吸收功能的檢測方法篩選對破骨細(xì)胞骨吸 收抑制作用較強的a3-SiRNA
體外篩選采用被廣泛使用的細(xì)胞外酸化功能和骨片吸收功能的檢測方法 正常的破骨細(xì)胞具有細(xì)胞外酸化和骨吸收功能，破骨細(xì)胞質(zhì)子泵將細(xì)胞外酸化 后吖啶橙染色呈橘紅色，被破骨細(xì)胞吸收后的骨片經(jīng)甲苯胺蘭染色后可以觀察 到大量深藍(lán)色的骨吸收陷窩。在原代培養(yǎng)的破骨細(xì)胞中分別加入各種表達(dá) a3-shRNA的慢病毒，3 — 5天后吖啶橙染色觀察細(xì)胞的細(xì)胞外酸化能力，及甲 苯胺蘭染色觀察骨片上的陷窩數(shù)目及形態(tài)；根據(jù)骨吸收陷窩數(shù)目和形態(tài)，選擇 骨吸收抑制效果較好的a3-SiRNA用于破骨細(xì)胞其它的功能實驗。
本發(fā)明所針對的藥物靶點a3是由申請人首先發(fā)現(xiàn)和克隆的，它是破骨細(xì) 胞骨吸收功能的必須基因。雖然a3被公認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松的很有前景的藥 物靶點，但是至今還沒有報道針對a3的破骨細(xì)胞抑制劑，所以本發(fā)明所選定 SiRNA靶序列的是新的針對a3的藥物耙點，且與人的相應(yīng)靶位置序列90%相
本發(fā)明利用的RNAi技術(shù)的出現(xiàn)已有近20年，但是利用RNAi技術(shù)得到 的實驗結(jié)果往往發(fā)表在影響力很高的期刊上；這也說明了 RNAi在基礎(chǔ)研究和 應(yīng)用上的重要性。隨著人們對RNAi原理的了解和其應(yīng)用范圍的擴大，這一技 術(shù)已經(jīng)突破了基礎(chǔ)研究的范圍，向著應(yīng)用邁進(jìn)。疾病治療領(lǐng)域的初期研究已經(jīng) 顯示，由病毒介導(dǎo)的ShRNA表達(dá)抑制致病基因的表達(dá)這一技術(shù)由于其自身的 優(yōu)勢必將成為藥物設(shè)計的新的增長點。而慢病毒表達(dá)ShRNA本身較腺病毒和 逆轉(zhuǎn)錄病毒有很多優(yōu)勢，慢病毒可感染分裂或非分裂細(xì)胞及終末分化細(xì)胞，而 逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂細(xì)胞，腺病毒可感染分裂或非分裂細(xì)胞。因此，相對 于傳統(tǒng)的新藥研制來說，慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)有很多優(yōu)點針對性強， 針對治病基因；特異性好；無需知道蛋白的三維結(jié)構(gòu)；無需篩選大量的候選化 合物；它是利用哺乳動物自身的防御系統(tǒng)治療疾病，至今沒有發(fā)現(xiàn)副作用；作
7用時間長，它通過整合到細(xì)胞基因組中表達(dá)發(fā)揮作用，且機體有RNAi放大的機制。
本發(fā)明開創(chuàng)性的用慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)抑制疾病基因的表達(dá)，可以說具有很強的前瞻性，表達(dá)特異a3 ShRNA的慢病毒感染骨髓細(xì)胞的技術(shù)可有望運用于研制慢病毒型生物制劑以治療骨質(zhì)疏松。同時，本發(fā)明將為制藥業(yè)提供全新的思路。


圖1為pSUPER-SiRNA質(zhì)粒的構(gòu)建；示出了針對耙序列2的SiRNA分子和S h RNA分子形成后的結(jié)構(gòu)圖2為PLB-SiRNA載體的構(gòu)建，將pSUPER-siRNA質(zhì)粒上的Hl-SiRNA序列克隆到pLB質(zhì)粒并取代U6啟動子；
圖3為含有SiRNA的表達(dá)載體PLB-SiRNA載體結(jié)構(gòu)圖4為逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝；
圖5為Wetem blotting檢測Lenti-a3敲低的效率；
圖6為檢測a3敲低后對破骨細(xì)胞的分化和成熟的影響；
圖7為檢測a3敲低后對破骨細(xì)胞細(xì)胞外酸化和骨吸收的影響；
圖8為檢測a3敲低后對絲狀肌動蛋白環(huán)形成的影響。
具體實施例方式
以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例中所使用各種培養(yǎng)基和試劑如無特別說明均為市售購買。
實施例一原代破骨細(xì)胞培養(yǎng)
參照Yang，S. and Li,Y.P. (2007) J.Bone Miner.Res.， 22， 45-54原代培養(yǎng)骨髓單個核細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化為成熟破骨細(xì)胞。6-8周齡C57BL6小鼠，拉頸處死，常規(guī)消毒后，取其后肢股骨和脛骨放入冰預(yù)冷的含抗生素的RIMP-1640培液中。用剪刀和鑷子將骨表面的血管結(jié)締組織分離干凈，冰預(yù)冷的含抗生素的RIMP-1640培液沖洗。剪刀剪去股骨和脛骨兩端，用無菌注射器(lml)將骨髓細(xì)胞吹入冰預(yù)冷的含10%FBS的a-MEM培液中。注射器針頭反復(fù)吸沖成單細(xì)胞懸液。4°C離心(1100rpmx6min)，用含M-CSF (10ng/ml)禾卩RANKL(10ng/ml) (R&D sysyems)的a-MEM+10%FBS培液重懸細(xì)胞。細(xì)胞以l-2xl05/孔接種于24孔板，以lxl06/孔接種于6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)基為a-MEM+ 10% FBS + 10 ng/ml RANKL+10 ng/ml M-CSF。細(xì)胞在37。C、 5% C02條件下培養(yǎng)4—6天獲的成熟的破骨細(xì)胞。
實施例二抗體準(zhǔn)備
合成多肽a3 816CFYSGTGYKLSPFTFTVDSD 834偶聯(lián)到KLH，免疫雄性新西蘭大白兔獲得抗a3的多克隆抗體，抗GAPDH的單克隆抗體購自cellsignaling公司。
實施例三篩選有效的SiRNA序列
米用Dharmacon siDESIGN center (http:〃www.dharmacon.com)設(shè)計小干擾siRNA，選三條特異的針對Atp6v0a3 mRNA的耙序列
a3siRNAl: 5，-AGATGAAGGCAGTGTACCT畫3， (SEQ ID NO. 1);
a3siRNA2: 5，-CTCGGCGTTTCATCTGTGG-3， (SEQ ID NO. 2);
a3siRNA3: 5，-ACGGACTGCTCATGTTTCT-3' (SEQ ID NO. 3)。
陰性對照為特異針對LacZ基因mRNA的靶序列si-LacZ :5，-CTCGGCGTTTCATCTGTGG-3，?；瘜W(xué)合成的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的耙序列經(jīng)退火復(fù)性后連接到pSUPER載體(OligoEngine)上Bglll/Hindlll位點之間。短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA (shRNA)敲低a3表達(dá)的效率檢測是通過在人胚腎細(xì)胞系293T(HEK293T, ATCC No. CRL-11268 )中共表達(dá)質(zhì)粒pFlag-CMV-4-a3 (Flag-a3 )和質(zhì)粒pSUPER-siRNA完成的。艮口 用lipofectamine reagent (Invitrogen公司)將克隆有siRNA的shRNA表達(dá)質(zhì)粒與Flag-a3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞(裂解液50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 100 mMdithiothreitol, 2% SDS, 0.001% bromphenol blue, 10% glycerol),進(jìn)行蛋白印跡實驗(western blotting)。實施例四包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒
第一天(9-10am): 293T細(xì)胞接種，每10cm培養(yǎng)皿接種2-2.5xl06 293T細(xì)胞；第二天(9-10am):轉(zhuǎn)染，準(zhǔn)備鈣一磷酸沉淀(lml/10cm plate)Transfer vector (PLB， Addgene) - 20(igPackaging plasmid (dR8.2， Addgene) - 15|igEnvelope plasmid (vsvg， Addgene) - 6|ng力口2.5MCaCL2 50ul，力q ddH20到500jli1，混勻；加500jul2xHBS，吹打混勻；
室溫孵育20分鐘，將沉淀逐滴加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，混勻；轉(zhuǎn)染后6—8小時，換新鮮培液，6ml/plate;第四天(9-10am):收集病毒收集培養(yǎng)上清3000rpm/5min/RT離心
上清0.45pm過濾，分裝，直接感染細(xì)胞或凍存于一8(TC實施例五逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測定
第1天(9-12am):在24孔板每個孔接種3x104 293T細(xì)胞，lml培液培養(yǎng)；第2天(4-6pm):計數(shù)一個孔的細(xì)胞(應(yīng)該6 — 8x104)， 4一6倍系列稀釋的病毒感染細(xì)胞，加4ing/nlpolybrene。第3天(9畫12am):加lml培液;第5天觀察細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)，并用FACS分析表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞比例，并計算滴度。
實施例六逆轉(zhuǎn)錄病毒感染破骨細(xì)胞
骨髓單個核細(xì)胞在M-CSF (10ng/ml)和RANKL (10ng/ml)的存在下誘導(dǎo)48小時，然后在polybrene (4|ig/ml)的存在下用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染8小時。換新鮮培液a-MEM+10% FBS+10 ng/ml RANKL +10 ng/ml M-CSF繼續(xù)培養(yǎng)4一6天。收集破骨細(xì)胞蛋白(裂解液50 mM Tris-HCl， pH 6.8, 100mM dithiothreitol, 2% SDS， 0.001% bromphenol blue, 10% glycerol),進(jìn)行蛋白印跡實驗(western blotting)用于檢測a3敲低的效率。
被病毒感染的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，病毒感染后2天在熒光顯微鏡下觀察發(fā)熒光的細(xì)胞，結(jié)果顯示病毒感染后幾乎所有細(xì)胞均發(fā)綠色熒光(圖5)。
10Western-blotting蛋白印跡試驗結(jié)果顯示，與lenti-LacZ感染的破骨細(xì)胞的a3表達(dá)水平相比，Lenti-a3 (靶序列為a3siRNA2)感染破骨細(xì)胞后a3的表達(dá)顯著降低86% (圖5)。說明表達(dá)特異針對a3的shRNA的慢病毒感染破骨細(xì)胞后能顯著抑制a3的蛋白表達(dá)水平。
實施例七TRAP染色
固定破骨細(xì)胞后用Sigma的TRAP活性染色試劑盒染色，前體破骨細(xì)胞盒成熟的破骨細(xì)胞(多于三個核)呈現(xiàn)深紅色，并在光鏡下計數(shù)。每組十個視野被計數(shù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=10)。
TRAP染色的結(jié)果顯示與lenti-LacZ處理后的細(xì)胞相似，Lenti-a3處理后的細(xì)胞也能分化成熟為多核破骨細(xì)胞，且二者顯示相似的多核破骨細(xì)胞數(shù)目和形成百分比(圖6)。說明a3敲低后并不影響骨髓單個核細(xì)胞分化成熟為多個核的破骨細(xì)胞。
實施例八吖啶橙染色
骨髓單個核細(xì)胞被接種在24孔板，在M-CSF (10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下誘導(dǎo)48小時，然后在polybrene (4略/ml)的存在下用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染8小時，換新鮮培液a-MEM+10% FBS + 10 ng/mlRANKL +10 ng/ml M-CSF繼續(xù)培養(yǎng)4天。破骨細(xì)胞在含5嗎/m 1吖啶橙的a-MEM中37°C孵育15分鐘，用a-MEM洗10 minutes,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞(激發(fā)光490nm和吸收光525 nm)。
吖啶橙染色結(jié)果顯示與lenti-LacZ感染的破骨細(xì)胞相比，Lenti-a3感染的多核破骨細(xì)胞細(xì)胞橘紅色染色明顯減少，細(xì)胞外酸化明顯受抑制(圖7)。說明a3敲低后破骨細(xì)胞的細(xì)胞外酸化功能明顯下降。
實施例九破骨細(xì)胞骨吸收功能分析
破骨細(xì)胞骨吸收活性的分析通過分析吸收陷窩的形成來完成。骨髓單個核細(xì)胞被接種在放置于96孔板孔里的象牙骨片上，在M-CSF (10ng/ml)和RANKL (10ng/ml)的存在下誘導(dǎo)48小時，然后在polybrene (4(ig/ml)的存在下用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染8小時，換新鮮培液a-MEM+10% FBS+10ng/ml RANKL +10 ng/ml M-CSF繼續(xù)培養(yǎng)6天。6天后骨片在1 M NH40H的溶液里超聲出去細(xì)胞。無細(xì)胞的骨片經(jīng)1% toluidine blue ( 1% sodium borate)染色1分鐘。吸收陷窩呈深藍(lán)色，并在光鏡下觀察，計數(shù)隨機視野下吸收面積占總視野面積的百分比，每組計數(shù)三個視野，數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示(n二3)。骨吸收實驗結(jié)果顯示與lenti-LacZ感染的破骨細(xì)胞形成骨吸收陷窩(陷窩為深藍(lán)色)面積占隨機觀察視野面積的百分?jǐn)?shù)相比，Lenti-a3感染的多核破骨細(xì)胞在象牙骨片上形成的吸收陷窩面積占隨機觀察視野面積的百分?jǐn)?shù)明顯減少(*P<0.05,n=3)，且Lenti-a3感染的多核破骨細(xì)胞在象牙骨片上形成的吸收陷窩更淺(圖8)。說明a3敲低后破骨細(xì)胞骨吸收功能明顯下降。
實施例十細(xì)胞絲狀肌動蛋白環(huán)染色
骨髓單個核細(xì)胞被接種在24孔板，在M-CSF (10ng/ml)禾Q RANKL(10ng/ml)的存在下誘導(dǎo)48小時，然后在polybrene (4|ag/ml)的存在下用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染8小時，換新鮮培液a-MEM+10% FBS + 10 ng/mlRANKL +10 ng/ml M-CSF繼續(xù)培養(yǎng)4天。細(xì)胞在3.7%多聚甲醛中固定10分鐘；0.2% Triton X-100透膜處理10分鐘；用1%山羊血清和3% BSA室溫下封閉1小時；用2 U/ml rhodamine phalloidin (Molecular Probes)室溫下孵育30分鐘；1 pg/mlDAPI(Sigma)染核呈藍(lán)色；細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察。
細(xì)胞絲狀肌動蛋白環(huán)染色結(jié)果顯示與表達(dá)特異LacZ siRNA的成熟破骨細(xì)胞形成絲狀肌動蛋白環(huán)相似，表達(dá)特異a3 siRNA的成熟破骨細(xì)胞也能形成規(guī)則的絲狀肌動蛋白環(huán)。表明a3敲低不影響成熟破骨細(xì)胞骨絲狀肌動蛋白環(huán)的形成。SEQUENCE LISTING <110>浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司 <120>破骨細(xì)胞質(zhì)子泵亞基a3的RNA千擾靶點及其應(yīng)用
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<210> 1
〈211〉 19
<212> 腿
〈213〉 Artificial
<400> 1
agaugaaggc aguguaccu 19
〈210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213〉 Artificial
〈220>
<221> misc_RNA
<222> (1)..(19)
<223>破骨細(xì)胞質(zhì)子泵亞基a3的RNA干擾靶點
<400> 2
guauccucau ucacuucau 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
〈213〉 Artificial
<400> 3
acggacugcu cauguuucu 19<210> 4 <211〉 64 <212〉 DNA
<213> Artificial
<400〉 4
gatccccaga tgaaggcagt gtacctttca agagaaggta cactgccttc atcttttttg 60
g333 64
<210〉 5
<211> 64
<212> 隨
〈213〉 Artificial
<400> 5
agcttttcca aaaaagatga aggcagtgta ccttctcttg aaaggtacac tgccttcatc 60 tggg 64
<210〉 6
<211> 64
<212〉 廳
〈213〉 Artificial
<400> 6
gatccccgta tcctcattca cttcatttca agagaatgaa gtgaatgagg atactttttg 60 gaaa 64
<210> 7
<211> 64
<212〉 陽
<213> Artificial
<400> 7
agcttttcca aaaagtatcc tcattcactt cattctcttg aaatgaagtg aatgaggata 60 cggg 64
<210> 8
<211〉 64
<212> DNA
<213〉 Artificial
14<400〉 8
gatccccacg gactgctcat gtttctttca agagaagaaa catgagcagt ccgttttttg 60 gaaa 64
<210〉 9
〈211> 64
〈212〉 DNA
<213> Artificial
<400> 9
agcttttcca aaaaacggac tgctcatgtt tcttctcttg aaagaaacat gagcagtccg 60
tggg
<210> <211〉 <212〉 <213〉
〈220〉 <221> <222〉 〈223〉
64
10 21 RNA
Artificial
misc一RNA (l).. (21) SiRNA單鏈
<400> 10
guauccucau ucacuucauu u 21
<210〉 <211> <212〉 〈213〉
<220> <221> 〈222〉 <223>
11
49 RNA
Artificial
misc—RNA (l).. (49) ShRNA
<400〉 11
guauccucau ucacuucauu ucaagagaau gaagugaaug aggauacuu 49
權(quán)利要求
1、一種破骨細(xì)胞質(zhì)子泵亞基a3的RNA干擾靶點，其特征在于其具有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
2、 一種小干擾RNA分子，其為雙鏈分子，其中一單鏈含有權(quán)利要求l所示 RNA靶點序列和在3'末端的UU雙核苷酸尾，另一單鏈為互補鏈。
3、 一種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求2的小干擾RNA分子。
4、 權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于其具有圖3所示結(jié)構(gòu)。
5、 一種重組慢病毒載體，含有權(quán)利要求2的小干擾RNA分子。
6、 權(quán)利要求5所述的重組慢病毒載體，其特征在于所述慢病毒載體用權(quán)利 要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
7、 權(quán)利要求l所述的破骨細(xì)胞質(zhì)子泵亞基a3的RNA干擾革E點在制備治療骨 質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。
8、 權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于以權(quán)利要求5所述的慢病毒載體作 為破骨細(xì)胞吸收抑制劑。
9、 一種短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA分子，其至少含有權(quán)利要求1所述的RNA干擾耙點 序列、短發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列以及RNA干擾靶點序列的反義序列。
10、 權(quán)利要求9所述的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA分子，其特征在于進(jìn)一步在3'末端 具有UU雙核苷酸尾。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及a3序列上用于RNA干擾的靶點，以及針對該靶點的以各種方式獲得的siRNA用于制備治療骨質(zhì)疏松的新藥物。本發(fā)明通過慢病毒感染破骨細(xì)胞并表達(dá)shRNA及體外基因敲低后破骨細(xì)胞功能檢測的方法篩選了a3基因上3個RNA干擾的靶點，其中優(yōu)選的一個靶點為2號靶點。針對2號靶點的siRNA能夠明顯抑制a3蛋白質(zhì)的表達(dá)，并能穩(wěn)定抑制破骨細(xì)胞的細(xì)胞外酸化和骨吸收的能力，但不影響成熟破骨細(xì)胞絲狀肌動蛋白環(huán)的形成。依據(jù)這個靶序列可以制備生物藥品以治療骨質(zhì)疏松。
文檔編號C12N15/11GK101638653SQ200810145869
公開日2010年2月3日 申請日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者李亦平 申請人:浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司