專利名稱：：擴(kuò)增核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增核酸的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種核酸的擴(kuò)增方法，其特征是，采用DNA聚合酶，通過對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行孵育，進(jìn)行聚合酶反應(yīng)。
背景技術(shù)：
：在分子生物學(xué)的研究中，一般來說，核酸的擴(kuò)增是通過利用DNA聚合酶采用酶學(xué)方法來進(jìn)行的。作為核酸的擴(kuò)增方法，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種公知的方法。為了對(duì)作為目標(biāo)的目標(biāo)核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR法由以下3個(gè)工序構(gòu)成將作為模板的雙鏈DNA變性為單鏈DNA的工序(變性工序)；將引物退火到單鏈DNA上的工序(退火工序)；以及，以引物作為起點(diǎn)使互補(bǔ)鏈延伸的工序(延伸工序)。在通常的PCR法中，在使用擴(kuò)增儀(ThermalCycler)時(shí)，變性工序、退火工序、延伸工序分別在不同的溫度下進(jìn)行。但是，在3種不同的溫度下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，溫度控制麻煩，并且還會(huì)造成這樣的問題消耗的時(shí)間會(huì)隨著循環(huán)次數(shù)的增加而成比例地增加。因此，人們開發(fā)了可以在恒溫狀態(tài)下實(shí)施的核酸擴(kuò)增方法。例如可以列舉，RCA(滾環(huán)擴(kuò)增，RollingCircleAmplification,參見Proc.麵.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995))、ICAN(恒溫禾口嵌合弓l物弓l發(fā)的核酸擴(kuò)增,IsothermalandChimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicacids)、LAMP(環(huán)介導(dǎo)的DNA恒溫?cái)U(kuò)增，Loop-MediatedIsothermalAmplificationofDNA，參見BioIndustry,第18巻、第2月(2001))、NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增方法，NucleicacidSequence-basedAmplificationmethod,參見Nature,350,91(1991》、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法，Transcriptionmediatedamplificationmethod,參見J.ClinMicrobiol.第31巻、3270(1993))等。SDA法(日本特開平5-130870號(hào)公報(bào))是采用外切核酸酶的循環(huán)分析法，其為利用聚合酶延伸反應(yīng)使靶核酸片段的目的部位擴(kuò)增的一種方法。該方法是這樣一種方法以特異性地雜合到靶核酸片段的目的部位上的引物作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶延伸反應(yīng)，同時(shí)使5'—3，外切核酸酶發(fā)生作用，從而將引物從相反方向降解。新的引物代替降解的引物進(jìn)行雜合，并再次通過DNA聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)。該通過DNA聚合酶進(jìn)行的延伸反應(yīng)與通過外切核酸酶(該外切核酸酶將之前己延伸的鏈除去)進(jìn)行的降解反應(yīng)依次地、周期性地反復(fù)進(jìn)行。這里，通過聚合酶進(jìn)行的延伸反應(yīng)與通過外切核酸酶進(jìn)行的降解反應(yīng)可以在恒溫條件下進(jìn)行。但是，該方法中除了聚合酶外，還必須使用外切核酸酶，這樣的話消耗成本，同時(shí)還必須花費(fèi)精力來設(shè)計(jì)引物。LAMP法是近年開發(fā)的對(duì)于靶核酸片段的目的部位進(jìn)行擴(kuò)增的方法。該方法中，通過使用至少4種引物(該至少4種引物互補(bǔ)地識(shí)別靶核酸片段的至少6個(gè)特定部位)和鏈置換型的BstDNA聚合酶(該聚合酶為在5'—3'方向上沒有核酸酶活性、而且邊使模板上的雙鏈DNA解離為單鏈DNA邊催化延伸反應(yīng)的聚合酶)，在恒溫條件下，將靶核酸片段的目的部位擴(kuò)增為特別結(jié)構(gòu)。不過，這種方法需要使用至少4種引物以識(shí)別6個(gè)特定部位，而引物的設(shè)計(jì)非常困難。ICAN法也是近年開發(fā)的對(duì)于耙核酸片段的目的部位進(jìn)行擴(kuò)增的方法。該方法為這樣一種方法采用RNA-DNA嵌合引物、具有鏈置換活性和模板交換活性的DNA聚合酶和RNaseH，進(jìn)行恒溫的基因擴(kuò)增。嵌合引物與模板結(jié)合后，通過DNA聚合酶可以合成互補(bǔ)鏈。之后，RNaseH將來源于嵌合引物的RNA部分切斷，從切斷的部分開始進(jìn)行延伸反應(yīng)，同時(shí)伴隨有鏈置換反應(yīng)和模板交換反應(yīng)，這樣的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，基因由此得以擴(kuò)增。不過，該方法也必須用到被稱作嵌合引物的特殊引物，而引物的設(shè)計(jì)非常困難。在日本特表平11-509406號(hào)公報(bào)中，記載了在具有鏈置換能力的DNA聚合酶存在下，采用至少1組寡核苷酸引物，將目的區(qū)域中的DNA在恒溫條件下反應(yīng)，由此擴(kuò)增的方法。不過，日本特表平11-509406號(hào)公報(bào)中記載的方法存在著需要比較長的反應(yīng)時(shí)間這樣的問題。總之，人們希望開發(fā)一種像PCR法那樣通過簡單的引物設(shè)計(jì)，就能夠在恒溫條件下簡便實(shí)施的核酸擴(kuò)增方法。proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)BioIndustry,第18巻，第2期(2001)Nature,350,91(1991)J.ClinMicrobiol.第31巻，3270(1993)日本特開平5-130870號(hào)公報(bào)日本特表平11-509406號(hào)公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種采用寡核苷酸引物和DNA聚合酶即可以實(shí)施的核酸擴(kuò)增方法。為了解決上述問題，本發(fā)明還提供一種能夠在短時(shí)間內(nèi)高效地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核酸序列、并且能夠特異性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核酸序列的核酸擴(kuò)增方法。解決問題所采用的手段為了解決上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物以滿足以下任意一種條件，就能夠高效地并且特異性地?cái)U(kuò)增核酸片段?；谝陨习l(fā)現(xiàn)完成本發(fā)明。(1)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物，而且，第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)。(2)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。(3)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上的連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3，側(cè)的序列X的3，側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。艮P，本發(fā)明提供一種擴(kuò)增核酸的方法，其包括將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應(yīng)溶液進(jìn)行孵育，由此以上述引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，從而將該核酸片段擴(kuò)增，其特征在于，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物，使得在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域或者該區(qū)域的一部分可以擴(kuò)增。優(yōu)選的是，本發(fā)明以以下任意一種情況為特征。(1)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)序列X的3'末端的堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物，而且，第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)。(2)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。(3)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3'側(cè)的序列X的3，側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。在本發(fā)明中，針對(duì)某區(qū)域A來設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，是指設(shè)計(jì)與區(qū)域A具有基本上相同的序列的寡核苷酸。換句話說，所謂"針對(duì)某區(qū)域A來設(shè)計(jì)寡核苷酸引物"，是指設(shè)計(jì)一個(gè)能夠與區(qū)域A的互補(bǔ)鏈退火的寡核苷酸引物，也就是說，該引物與區(qū)域A的互補(bǔ)鏈基本上互補(bǔ)。在本發(fā)明中，"序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域"，是指與序列X的5'側(cè)相距1個(gè)堿基的核苷酸所在的位置、與序列X的5'側(cè)相距100個(gè)堿基的核苷酸所在的位置、以及夾在這兩個(gè)位置之間的區(qū)域。同樣，在本發(fā)明中，"序列X的3'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域"，是指與序列X的3'側(cè)相距1個(gè)堿基的核苷酸所在的位置、與序列X的3'側(cè)相距100個(gè)堿基的核苷酸所在的位置、以及夾在這兩個(gè)位置之間的區(qū)域。優(yōu)選的是，序列X和與序列X互補(bǔ)的序列Xc為由5個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列。優(yōu)選的是，序列X和與序列X互補(bǔ)的序列Xc為由7個(gè)以上連續(xù)的堿基構(gòu)成的序列。優(yōu)選的是，所述反應(yīng)溶液中還含有至少0.05%以上的表面活性劑。優(yōu)選的是，所述表面活性劑為非離子型表面活性劑。優(yōu)選的是，所述非離子型表面活性劑的特征在于選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯類、聚氧乙烯垸基酚醚類、聚氧乙烯烷基醚類表面活性劑。優(yōu)選的是，所述反應(yīng)溶液中還含有二價(jià)陽離子。優(yōu)選的是，所述二價(jià)陽離子為鎂離子。優(yōu)選的是，所述反應(yīng)溶液中還含有解鏈溫度調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選的是，所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑為二甲基亞砜、甜菜堿、甲酰胺或甘油、或者它們中的兩種以上的混合物。優(yōu)選的是，所述反應(yīng)溶液中含有的每一種脫氧核苷三磷酸的濃度均在1.0mM以上100mM以下。優(yōu)選的是，所述反應(yīng)溶液中含有的每一種寡核苷酸引物的濃度均在lpM以上lOOpM以下。優(yōu)選的是，所述寡核苷酸引物與所述模板核酸片段的一部分基本上互補(bǔ)。優(yōu)選的是，所述寡核苷酸引物只有3'末端區(qū)域與所述模板核酸片段基本上互補(bǔ)。優(yōu)選的是，所述寡核苷酸引物只與所述模板核酸片段的一處的連續(xù)核苷酸基本上互補(bǔ)。優(yōu)選的是，所述至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶為選自來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的5'—3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、來源于熱堅(jiān)芽孢桿菌的5'—3'外切核酸酶缺失的BcaDNA聚合酶、及來源于Thermococcuslitoralis的5'—3'外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶中的聚合酶。優(yōu)選的是，核酸的擴(kuò)增工序在基本上恒溫的條件下進(jìn)行。優(yōu)選的是，核酸的擴(kuò)增工序在室溫以上且IO(TC以下的條件下進(jìn)行。發(fā)明效果通過本發(fā)明，可以不斷地將擴(kuò)增產(chǎn)物延伸，所以能夠以非常高的擴(kuò)增效率擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列。圖1顯示的是實(shí)施例中所用的引物相對(duì)于p-肌動(dòng)蛋白基因的位置關(guān)系的詳細(xì)情況。圖2顯示的是通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測結(jié)果。圖3顯示的是通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，①為50bpladder,②⑦為樣品。圖4顯示的是實(shí)施例中所用的引物相對(duì)于P3AR基因的位置關(guān)系的詳細(xì)情況。圖5顯示的是通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測結(jié)果。圖6顯示的是通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，①為50bpladder,②(D為樣品。圖7顯示的是實(shí)施例中所用的引物相對(duì)于7號(hào)染色體的位置關(guān)系的詳細(xì)情況。圖8顯示的是通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測結(jié)果。圖9顯示的是通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，①為50bpladder,②為樣品1，③為樣品2。圖10顯示的是實(shí)施例中所用的引物相對(duì)于7號(hào)染色體的位置關(guān)系的詳細(xì)情況。圖ll顯示的是通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測結(jié)果。圖12顯示的是通過本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。其中，①為50bpladder,②為樣品1，③為樣品2。圖13顯示的是本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的第一種實(shí)施方案的概括(前半部分)。圖14顯示的是本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的第一種實(shí)施方案的概括(后半部分)。圖15顯示的是本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的第二種實(shí)施方案的概括(前半部分)。圖16顯示的是本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的第二種實(shí)施方案的概括(后半部分)。圖17顯示的是本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的第三種實(shí)施方案的概括(前半部分)。圖18顯示的是本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的第三種實(shí)施方案的概括(后半部分)。具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法為這樣一種核酸擴(kuò)增方法，其包括將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種DNA聚合酶、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應(yīng)溶液進(jìn)行孵育，由此以上述引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，從而將該核酸片段擴(kuò)增，其特征在于，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物，使得在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域或者該區(qū)域的一部分能夠擴(kuò)增。更具體地說，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，以滿足以下的任意一種條件。(1)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物，而且，第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)(參照?qǐng)D13)。(2)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物(參照?qǐng)D15)。(3)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3'側(cè)的序列X的3，側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物(參照?qǐng)D17)。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，以滿足以下的任意一種條件。(1)對(duì)于在100個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和37側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3，側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物，而且，第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)。(2)對(duì)于在100個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。(3)對(duì)于在100個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3'側(cè)的序列X的3，側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，以滿足以下的任意一種條件。(1)對(duì)于在60個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物，而且，第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)。(2)對(duì)于在60個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列x的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。(3)對(duì)于在60個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3'側(cè)的序列X的3'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。圖13及圖14示出了對(duì)本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法的上述(l)的概括。將第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物退火到作為模板的核酸片段上，以該寡核苷酸引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)。此時(shí)，作為以第一寡核苷酸引物為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，得到了在3'末端含有序列X的擴(kuò)增核酸片段(將其作為核酸片段A)。同樣，作為以第二寡核苷酸引物為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，得到了在3'末端含有與序列X互補(bǔ)的序列Xc的擴(kuò)增核酸片段(將其作為核酸片段B)。接下來，上述得到的擴(kuò)增核酸片段A與擴(kuò)增核酸片段B形成雜合，并開始延伸。由此，可以合成得到高分子的擴(kuò)增核酸片段?；蛘?，上述得到的擴(kuò)增核酸片段A與作為模板的核酸片段通過序列X(序列Xc)形成雜合，并開始延伸，從而也可以合成得到高分子的擴(kuò)增核酸片段?；蛘撸鲜龅玫降臄U(kuò)增核酸片段B與作為模板的核酸片段通過序列X(序列Xc)形成雜合，并開始延伸，從而也可以合成得到高分子的擴(kuò)增核酸片段。將第一寡核苷酸引物或者第二寡核苷酸引物或該兩者，與核酸片段A、核酸片段B、及高分子的擴(kuò)增核酸片段進(jìn)行退火，以所述引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，由此可連續(xù)地進(jìn)行核酸片段的復(fù)制反應(yīng)。結(jié)果，作為模板的核酸片段擴(kuò)增到能夠被檢測到的水平。圖15及16示出了對(duì)本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法的上述(2)的概括。將第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物退火到作為模板的核酸片段上，以該寡核苷酸引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)。此時(shí)，作為以第一寡核苷酸引物為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，得到了在3'末端至少兩處含有序列X的擴(kuò)增核酸片段(將其作為核酸片段A)。同樣，作為以第二寡核苷酸引物為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，得到了在3'末端含有與序列X互補(bǔ)的序列Xc的擴(kuò)增核酸片段(將其作為核酸片段B)。接下來，上述得到的擴(kuò)增核酸片段A與擴(kuò)增核酸片段B形成雜合，并開始延伸。由此，可以合成得到高分子的擴(kuò)增核酸片段?；蛘撸鲜龅玫降臄U(kuò)增核酸片段A與作為模板的核酸片段通過序列X(序列Xc)形成雜合，并開始延伸，從而也可以合成得到高分子的擴(kuò)增核酸片段。將第一寡核苷酸引物或者第二寡核苷酸引物或該兩者，與核酸片段A、核酸片段B、及高分子的擴(kuò)增核酸片段進(jìn)行退火，以所述引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，由此可連續(xù)地進(jìn)行核酸片段的復(fù)制反應(yīng)。結(jié)果，使作為模板的核酸片段擴(kuò)增到能夠被檢測到的水平。圖17及18示出了對(duì)本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法的上述(3)的概括。將第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物退火到作為模板的核酸片段上，以該寡核苷酸引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)。此時(shí)，作為以第一寡核苷酸引物為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，得到了在3'末端至少兩處含有序列X的擴(kuò)增核酸片段(將其作為核酸片段A)。同樣，作為以第二寡核苷酸引物為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，得到了在3，末端至少兩處含有與序列X互補(bǔ)的序列Xc的擴(kuò)增核酸片段(將其作為核酸片段B)。接下來，上述得到的擴(kuò)增核酸片段A與擴(kuò)增核酸片段B形成雜合，并開始延伸。由此，可以合成得到高分子的擴(kuò)增核酸片段?；蛘?，上述得到的擴(kuò)增核酸片段A與作為模板的核酸片段通過序列X(序列Xc)形成雜合，并開始延伸，從而也可以合成得到高分子的擴(kuò)增核酸片段?；蛘?，上述得到的擴(kuò)增核酸片段B與作為模板的核酸片段通過序列X(序列Xc)形成雜合，并開始延伸，從而也可以合成得到高分子的擴(kuò)增核酸片段。將第一寡核苷酸引物或者第二寡核苷酸引物或該兩者，與核酸片段A、核酸片段B、及高分子的擴(kuò)增核酸片段進(jìn)行退火，以所述引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，由此可連續(xù)地進(jìn)行核酸片段的復(fù)制反應(yīng)。結(jié)果，使作為模板的核酸片段擴(kuò)增到能夠被檢測到的水平。以下對(duì)本發(fā)明中所采用的成分進(jìn)行說明。(1)脫氧核苷三磷酸采用脫氧核苷三磷酸作為延伸反應(yīng)的底物。具體地說，優(yōu)選使用dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物。作為脫氧核苷三磷酸，也可以含有dNTP的類似物(例如，7-脫氮-dGTP等)。此外，脫氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物)的最終濃度均在0.1mM100mM的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.75mM3.0mM的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在1.0mM2.0mM的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選在1.0mM1.5mM的范圍內(nèi)。(2)DNA聚合酶在本發(fā)明中，采用DNA聚合酶。作為DNA聚合酶，優(yōu)選使用具有鏈置換能力的聚合酶。在本說明書中，所謂"鏈置換能力"是指具有這樣的活性在根據(jù)作為模板的核酸序列進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，通過置換DNA鏈來進(jìn)行鏈置換，以使退火到模板鏈上的互補(bǔ)鏈解離，艮P，具有能夠進(jìn)行鏈置換(stranddisplacement)的活性。作為具有鏈置換能力的聚合酶的具體例子，可以列舉來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(BacilIusstearothermophilus)的5'—3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、來源于熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)的5'—3'外切核酸酶缺失的BcaDNA聚合酶、及來源于Thermococcuslitoralis的5'—3'外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶等，但并不局限于此。具有鏈置換能力的聚合酶，既可以是來源于天然的，也可以是通過基因工程制造的重組蛋白質(zhì)。(3)二價(jià)陽離子在本發(fā)明中，根據(jù)所使甩的酶的金屬需求性等，使用二價(jià)陽離子。作為所述二價(jià)陽離子，可以使用鎂鹽和其他的金屬鹽，例如，可以使用氯化鎂、醋酸鎂、硫酸鎂等。所述二價(jià)陽離子的最終濃度優(yōu)選在lmM20mM的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在2mM10mM的范圍內(nèi)。(4)表面活性劑在本發(fā)明中，也可以向反應(yīng)溶液中添加表面活性劑。通過使用表面活性劑，可以達(dá)到防止發(fā)生非特異性的核酸擴(kuò)增這樣的有利效果。對(duì)于本發(fā)明中可以使用的表面活性劑的種類沒有特別的限定，例如可以使用垸基苯磺酸鈉、十二垸基硫酸鈉(SDS)、磺基琥珀酸辛酯鹽、硬脂酸皂類等陰離子(anion)型表面活性劑；蔗糖脂肪酸酯失水山梨醇脂肪酸酯、POE失水山梨醇脂肪酸酯(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)、脂肪酸烷醇酰胺、POE烷基醚(Brij35、Brij58等)、POE烷基苯基醚(TritonX-IOO、TritonX-l14、NonidetP40等)、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、POE垸基胺、POE脂肪酸雙苯基醚等非離子(nonkm)型表面活性劑；氯化十六烷基吡啶鑰、十二垸基二甲基芐基氯化銨、硬脂基三甲基氯化銨等陽離子(cation)型表面活性劑等。對(duì)于表面活性劑的用量沒有特別的限定，只要能夠達(dá)到本發(fā)明的效果即可，但是優(yōu)選為0.01%以上，更優(yōu)選為0.05%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1%以上。對(duì)表面活性劑的用量的上限沒有特別的限定，通常在10%以下，優(yōu)選在5%以下，更優(yōu)選在1%以下。在表面活性劑中，特別優(yōu)選使用非離子型表面活性劑。在非離子型表面活性劑中，優(yōu)選親水性較強(qiáng)的表面活性劑，用HLB值表示的話，優(yōu)選HLB值在12以上。更優(yōu)選HLB值在14以上，優(yōu)選HLB值的上限為20。另外，優(yōu)選HLB值在17以下，更優(yōu)選HLB值為14以上17以下。從結(jié)構(gòu)上來說，所述表面活性劑優(yōu)選選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯類、聚氧乙烯烷基醚類。還有，在聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中，優(yōu)選的化合物是聚氧乙烯失水山梨醇單脂肪酸酯。例如，可以用以下的結(jié)構(gòu)式來表示。式1]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(式中，x+y+z+w=20。并且，R表示碳原子數(shù)為1218的烷基。)對(duì)于烷基的位置沒有特別的限定，但是可以優(yōu)選使用以下的結(jié)構(gòu)式所表示的化合物。[式2]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>x+y+z+w=20R表示碳原子數(shù)為1218的烷基作為此類表面活性劑，就物質(zhì)名稱而言，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯類非離子型表面活性劑可以列舉聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇單油酸酯等?？梢粤信e商品名分別為Tween20、Tween40、Tween60禾QTween80等的表面活性劑。此外，對(duì)于表面活性劑的用量也沒有特別的限定，但是優(yōu)選為0.01%以上，更優(yōu)選為0.05%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1%以上。(5)寡核苷酸引物在本發(fā)明中使用的寡核苷酸引物具有與模板DNA基本上互補(bǔ)的堿基序列，并且從該引物的3'末端可以進(jìn)行DNA鏈的延伸。由于寡核苷酸引物具有與模板DNA基本上互補(bǔ)的堿基序列，所以可以將其退火到作為模板的DNA上。作為本發(fā)明使用的寡核苷酸引物，可以使用由脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸構(gòu)成的物質(zhì)，也可以是含有修飾的核糖核苷酸或修飾的脫氧核糖核苷酸的物質(zhì)。此外，上述寡核苷酸引物無需具有以往的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中所用的那樣的復(fù)雜設(shè)計(jì)。本發(fā)明的最大特征在于，采用通常的PCR反應(yīng)中所使用的至少一組以上的引物就可以進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。具體地說，這些引物不必具有在LAMP法等中所采用的那樣的5'末端與從3，末端延伸出來的部分互補(bǔ)而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)那樣的結(jié)構(gòu)。即，引物的3'末端的連續(xù)區(qū)域與模板核酸是互補(bǔ)的。還有，本發(fā)明的寡核苷酸引物也不具有在SDA法和ICAN法中所采用的那樣復(fù)雜結(jié)構(gòu)，該復(fù)雜結(jié)構(gòu)為在反應(yīng)過程中引物被切斷，被切斷后的3'末端成為新的合成起點(diǎn)。設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，以滿足以下的任意一種條件。(1)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列x的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物，而且，第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)。(2)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。(3)對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3'側(cè)的序列X的3'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。優(yōu)選的是，設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，以滿足以下的任意一種條件。(1)對(duì)于在IOO個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物，而且，第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)。(2)對(duì)于在IOO個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5，側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。(3)對(duì)于在100個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3'側(cè)的序列X的3，側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。優(yōu)選的是，設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，以滿足以下的任意一種條件。(1)對(duì)于在60個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物，而且，第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)。(2)對(duì)于在60個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5，側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。(3)對(duì)于在60個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3，側(cè)的序列X的3，側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)第二寡核苷酸引物。優(yōu)選的是，序列X和序列Xc為由5個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列。優(yōu)選的是，序列X和序列Xc為由7個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列。兩個(gè)由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X中的堿基可以不必完全一致。例如，5個(gè)堿基中有4個(gè)以上堿基、6個(gè)堿基中有5個(gè)以上堿基、7個(gè)堿基中有5個(gè)以上堿基、8個(gè)堿基中有6個(gè)以上堿基、9個(gè)堿基中有7個(gè)以上堿基、10個(gè)堿基中有7個(gè)以上堿基一致的話，就可以與兩個(gè)X序列中的堿基完全一致的情形下的擴(kuò)增機(jī)理相同的機(jī)理進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)于寡核苷酸引物的長度沒有特別的限定，但是一般來說，為10100個(gè)左右核苷酸的長度，優(yōu)選為1550個(gè)左右核苷酸的長度，更優(yōu)選為1540個(gè)左右核苷酸的長度?？梢允褂檬惺鄣腄NA合成機(jī)(例如，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystemInc.)制造的DNA合成儀-394型等)，根據(jù)亞磷酰胺法來合成所述寡核苷酸引物。在反應(yīng)溶液中，寡核苷酸引物的用量優(yōu)選為O.l^M以上，更優(yōu)選為1^M以上，特別優(yōu)選為L5pM以上。(6)作為模板的核酸片段在本發(fā)明中，作為模板的核酸(DNA或RNA)可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA、mRNA、總RNA中的任意一種。既可以使用從有可能含有作為模板的核酸的試樣中所制備的核酸，也可以直接使用有可能含有作為模板的核酸的試樣。對(duì)于含有作為模板的核酸的試樣的種類沒有特別的限定，可以列舉例如體液(例如，全血、血清、尿、腦脊髓液、精液、唾液等)，組織(例如，癌組織等)，來源于細(xì)胞培養(yǎng)物之類的生物體的試樣，諸如病毒、細(xì)菌、真菌、酵母菌、植物和動(dòng)物之類的含有核酸的試樣，有可能混入有微生物的試樣(例如，食品等)，或諸如土壤、廢水之類的環(huán)境中的試樣。在從上述試樣中制備核酸時(shí)，對(duì)于制備方法沒有特別的限定，例如，可以采用表面活性劑處理、超音波處理、用玻璃珠進(jìn)行精制等本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法。對(duì)于從試樣中精制核酸，可以采用苯酚法提取法、色譜法、凝膠電泳法或密度梯度離心分離等方法進(jìn)行。當(dāng)對(duì)具有來源于RNA的序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，以該RNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成得到cDNA，以該cDNA作為模板來實(shí)施本發(fā)明的方法。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的引物，可以是具有與特定的模板RNA互補(bǔ)的堿基序列的引物，也可以是寡聚dT引物或具有隨機(jī)序列的引物。用于逆轉(zhuǎn)錄的引物的長度優(yōu)選是6100個(gè)左右核苷酸的長度，更優(yōu)選是950個(gè)左右核苷酸的長度。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的酶沒有特別的限定，只要其具有以RNA作為模板來合成cDNA的活性即可，例如可以使用源自禽類骨髓細(xì)胞瘤病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(AMVRTase)、源自Molony鼠白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLVRTase)及Rous相關(guān)病毒-2的逆轉(zhuǎn)錄酶(RAV-2RTase)等。此外，也可使用同時(shí)具有逆轉(zhuǎn)錄活性的鏈置換型DNA聚合酶。在本發(fā)明中，基因組DNA或核酸擴(kuò)增片段之類的雙鏈DNA、以及利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由RNA制備得到的cDNA之類的單鏈DNA可用作模板DNA。上述的雙鏈DNA，既可以在變性為單鏈DNA后用于本發(fā)明的方法中，也可以不進(jìn)行這樣的變性而用于本發(fā)明的方法中。(7)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑在本發(fā)明的反應(yīng)溶液中，可以添加解鏈溫度調(diào)節(jié)劑。作為解鏈溫度調(diào)節(jié)劑的具體例子，可以列舉二甲基亞砜(DMSO)、甜菜堿、甲酰胺或甘油、四垸基銨鹽或它們中的2種以上的混合物。對(duì)于解鏈溫度調(diào)節(jié)劑的用量沒有特別的限定，然而，在DMSO或甲酰胺、甘油的情況中，通常在反應(yīng)溶液中的含量為10%以下。甜菜堿或四烷基銨鹽的添加量為0.2M3.0M，優(yōu)選為0.5M1.5M左右。(8)緩沖成分在本發(fā)明的反應(yīng)溶液中，可以含有緩沖成分。對(duì)于緩沖成分沒有特別的限定，可以使用例如N,N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、三羥甲基氨基甲垸和磷酸鹽(磷酸鈉、磷酸鉀等)等。緩沖成分的最終濃度在5mM100mM的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選在10mM50mM的范圍內(nèi)，此外，pH是對(duì)于擴(kuò)增反應(yīng)中使用的酶的最佳pH，一般來說為6.09.0，特別優(yōu)選使用pH7.09.0的緩沖成分。(9)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法以下對(duì)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行說明。在本發(fā)明中，將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種DNA聚合酶、二價(jià)陽離子、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應(yīng)溶液進(jìn)行孵育。由此，以上述引物的3'末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，從而可以將該核酸片段擴(kuò)增。本發(fā)明中，優(yōu)選在基本上恒溫的條件下進(jìn)行核酸的擴(kuò)增工序。孵育反應(yīng)溶液時(shí)的溫度優(yōu)選在室溫以上，更優(yōu)選為50。C以上，進(jìn)一步優(yōu)選為55'C以上，例如，可以在6CTC左右進(jìn)行孵育。優(yōu)選的溫度范圍例如為從大約5(TC到大約7(TC，更優(yōu)選為從大約55'C到大約65'C。這種情況下，引物的非特異性退火被抑制，DNA擴(kuò)增的特異性提高，而且，由于模板DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)被解除，所以DNA聚合酶的延伸活性也得以提高。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法可以在基本上恒溫的條件下實(shí)施。在本發(fā)明中，所謂"恒溫"是指各工序的反應(yīng)溫度沒有很大的變化，各工序在基本上一定的溫度下進(jìn)行。在本發(fā)明中，對(duì)于將反應(yīng)溶液在基本上恒溫的條件下進(jìn)行孵育的時(shí)間沒有特別的限定，只要能夠?qū)⒛繕?biāo)核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增即可。孵育時(shí)間例如可以為5分鐘以上12小時(shí)以內(nèi)。孵育時(shí)間優(yōu)選為5分鐘以上2小時(shí)以內(nèi)，更優(yōu)選為5分鐘以上60分鐘以內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選為5分鐘以上30分鐘以內(nèi)，也可以為5分鐘以上15分鐘以內(nèi)。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，在基本上恒溫的條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，不必使溫度升高或降低。在傳統(tǒng)的PCR法中需要使溫度升高或降低，并且例如需要使用擴(kuò)增儀(ThermalCycler)之類的反應(yīng)裝置，而在基本上恒溫的條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，僅僅使用可使溫度保持一定的裝置就可以實(shí)施擴(kuò)增。(10)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的應(yīng)用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法能夠用于核酸的檢測、標(biāo)記、堿基序列的確定、堿基變異的檢測(包括單堿基多型態(tài)的檢測等)等。在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中，不必使用能夠進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)的反應(yīng)裝置，所以可以使用大量的反應(yīng)液來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。由本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以采用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法來進(jìn)行檢測。例如，采用凝膠電泳法，通過用溴化乙錠進(jìn)行凝膠染色，可以檢測特定尺寸的反應(yīng)產(chǎn)物。用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測體系，可以使用熒光偏振法、免疫檢測法、熒光能量轉(zhuǎn)移法、酶標(biāo)記法(例如，過氧化酶、堿性磷酸酶等)、熒光標(biāo)記法(例如，熒光素、羅丹明等)、化學(xué)發(fā)光法或生物發(fā)光法等。通過使用用生物素標(biāo)記的標(biāo)記核苷酸也可以檢測擴(kuò)增物。在這種情況中，可以采用熒光標(biāo)記親合素或酶標(biāo)記親合素等來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的生物素。通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)朋進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例<實(shí)施例1>核酸的擴(kuò)增反應(yīng)(1)含有耙核酸片段的核酸試樣溶液的配制將3.0ng的HumanGenomicDNA(Clontech公司制造)在98。C下加熱3分鐘，使之成為單鏈后，采用以下的條件對(duì)(3-肌動(dòng)蛋白基因中的序列進(jìn)行擴(kuò)增。<引物〉使用P-肌動(dòng)蛋白基因作為目標(biāo)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。各引物的序列如下所示。引物(l)(正向引物)5，隱GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3'(序列編號(hào)1)引物(2)(反向引物)5'-CCTCGTCGCCCACATAG-3，(序列編號(hào)2)上述引物相對(duì)于P-肌動(dòng)蛋白基因的位置關(guān)系具體如圖1所示。這里，序列X為5，-CCCAG-3，，兩處序列X間相距54個(gè)堿基。針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)引物(l);針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)引物(2)。(2)核酸擴(kuò)增反應(yīng)采用具有如下所示組成的反應(yīng)液，在6(TC下反應(yīng)60分鐘，以實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。酶使用的是NEB公司的Bst.DNAPolymerase。<反應(yīng)液的組成〉10xBst緩沖液(不含洗滌劑)l單100mMMgS040.6^10%(v/v)Tween20O單100%DMSO25mMdNTP，每種0.56|iLSYBRGreenI(稀釋2000倍)0.2^50|iM引物(l)0.64pL50|nM引物(2)0.64)iLBst.Polymerase0.4|aL上述(l)所得到的核酸片段試樣溶液(3.0ng)精制水4.96uLlO.O^L(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測采用實(shí)時(shí)熒光檢測裝置(Mx3000p，Stratagene公司制造)對(duì)上述(2)中的擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行熒光檢測。結(jié)果如圖2所示。采用Mx3000p分析軟件，計(jì)算在上述的圖中熒光量達(dá)到250時(shí)所需要的時(shí)間(Ct值)。Ct值為37.6±1.1分鐘。_Ct(250)[分鐘]38.837.338.237.235.738.1<實(shí)施例2>擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳使用3重量％的瓊脂糖凝膠、0.5xTBE緩沖液(50mMTris,45mM硼酸、0.5mMEDTA,pH8.4)，在100V下進(jìn)行60分鐘的電泳。結(jié)果如圖3所示。6個(gè)樣品的電泳圖譜大體上相同，由此可以看出擴(kuò)增產(chǎn)物是根據(jù)相同的反應(yīng)機(jī)理而得到的。<實(shí)施例3〉擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆實(shí)施電泳之后，將200bp以下區(qū)域的凝膠切取出來，使用QIAEXII(Qiagen公司制造)來回收凝膠中的DNA。使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)將回收的DNA重組到載體中，用該載體對(duì)大腸菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸菌在添加有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。利用QIAprepMiniprep(Qiagen公司制造)，從培養(yǎng)后的大腸菌中回收質(zhì)粒DNA。對(duì)回收的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序，以確定堿基序列。使用M13反向引物(M13ReversePrimer),作為引物。M13反向引物5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，(序列編號(hào)3)由測序的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)存在以下3種擴(kuò)增產(chǎn)物。(1)5，-GGGCATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTGGGCGACGAGG-3'3'-CCCGTACCCAGTCTTCCTAAGGATACACCCGCTGCTCC-5'38個(gè)堿基對(duì)(序列編號(hào)4)(2)3'陽ACCACCCGTACCCAGTCTTCGTAAGGATACACCCGCTGCTCC-5，92個(gè)堿基對(duì)(序列編號(hào)5)(3)5'-GTGATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTGGGCGACGAGG-3'3'-CACTACCACCCGTACCCAGTCTTCCTAAGGATACACCCGCTGCTCC-5'146個(gè)堿基對(duì)(序列編號(hào)6)通過測序所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長，與圖2的電泳結(jié)果一致。(1)的擴(kuò)增產(chǎn)物為夾在2個(gè)引物之間的區(qū)域。(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物為由每個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增后所得到的產(chǎn)物通過序列X(CCCAG)及序列Xc(CTGGG)而結(jié)合起來，并進(jìn)一步擴(kuò)增而得到的產(chǎn)物。(3)的擴(kuò)增產(chǎn)物為(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物與由2個(gè)引物中的任何一個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增后所得到的產(chǎn)物通過序列X(CCCAG)及序列Xc(CTGGG)而結(jié)合起來，并進(jìn)一步擴(kuò)增而得到的產(chǎn)物。<實(shí)施例4>核酸的擴(kuò)增反應(yīng)(1)含有靶核酸片段的核酸試樣溶液的配制將3.0ng的HumanGenomicDNA(Clontech公司制造)在98。C下加熱3分鐘，使之成為單鏈后，采用以下的條件對(duì)(33AR基因中的序列進(jìn)行擴(kuò)增。<引物〉使用p3AR基因作為目標(biāo)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。各引物的序列如下所示。引物(l)(正向引物)5，-ATCGTGGCCATCGCCT匿3'(序歹U編號(hào)7)引物(2)(反向引物)5'-CCAGCGAAGTCACGAAC-3，(序列編號(hào)8)上述引物相對(duì)于p3AR基因的位置關(guān)系具體如圖4所示。這里，序列X為5'-GCTGGCC-3'，兩處序列X間相距90個(gè)堿基。針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)引物(l);針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)引物(2)。(2)核酸擴(kuò)增反應(yīng)采用具有如下所示組成的反應(yīng)液，在6(TC下反應(yīng)60分鐘，以實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。酶使用的是NEB公司的Bst.DNAPolymerase。<反應(yīng)液的組成〉10xBst緩沖液(不含洗滌劑)l都L100mMMgS04O勿L10%(v/v)Tween200.1iiL100%DMSO0.5nL25mMdNTP，每種0.56^SYBRGreenI(稀釋2000倍)50pM引物(l)0.64^50nM引物(2)0.64nLBst.Polymerase上述(l)所得到的核酸片段試樣溶液(3.0ng)0.4^L精制水4.96uLlO.OpL(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測采用實(shí)時(shí)熒光檢測裝置(Mx3000p，Stratagene公司制造)對(duì)上述(2)中的擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行熒光檢測。結(jié)果如圖5所示。采用Mx3000p分析軟件，計(jì)算在上述的圖中熒光量達(dá)到250時(shí)所需要的時(shí)間(Ct值)。該Ct值為41.2±0.5分鐘。_<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><實(shí)施例5〉擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳使用3重量％的瓊脂糖凝膠、0.5xTBE緩沖液(50mMTris,45mM硼酸、0.5mMEDTA,pH8.4)，在100V下進(jìn)行60分鐘的電泳。結(jié)果如圖6所示。4個(gè)樣品的電泳圖譜大體上相同，可以看出擴(kuò)增產(chǎn)物是根據(jù)相同的反應(yīng)機(jī)理而得到的。<實(shí)施例6>擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆實(shí)施電泳之后，將200bp以下區(qū)域的凝膠切取出來，使用QIAEXII(Qiagen公司制造)回收凝膠中的DNA。使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)將回收的DNA重組到載體中，用該載體對(duì)大腸菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸菌在添加有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。利用QIAprepMiniprep(Qiagen公司制造)從培養(yǎng)后的大腸菌中回收質(zhì)粒DNA。對(duì)于回收的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序，以確定堿基序列。使用M13反向引物，作為引物。M13反向引物5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3，(序列編號(hào)3)根據(jù)測序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在以下2種擴(kuò)增產(chǎn)物。(1)5'-CGTGACTTCGCTGG-3'3'-GCACTGAAGCGACC-5'64個(gè)堿基對(duì)(序列編號(hào)9)(2)153個(gè)堿基對(duì)(序列編號(hào)10)通過測序所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈長，與圖6的電泳結(jié)果一致。(1)的擴(kuò)增產(chǎn)物為夾在2個(gè)引物之間的區(qū)域。(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物為由每個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增而得到的產(chǎn)物通過序列X(GCTGGCC)及序歹UXc(GGCCAGC)而結(jié)合起來，并進(jìn)一步擴(kuò)增而得到的產(chǎn)物。<實(shí)施例7>核酸的擴(kuò)增反應(yīng)(1)含有靶核酸片段的核酸試樣溶液的配制將3.0ng的HumanGenomicDNA(Clontech公司制造)在98。C下加熱3分鐘，使之成為單鏈后，采用以下的條件對(duì)7號(hào)染色體中的序列進(jìn)行擴(kuò)增。<引物〉使用7號(hào)染色體中的序列作為目標(biāo)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。各引物的序列如下所示。引物(5)(正向引物)5，-CATTGCTCAGGGGTCTTC-3，(序列編號(hào)11)引物(6)(反向引物)5'-ATTTCGGCTCCCTTGG-3，(序列編號(hào)12)上述引物相對(duì)于7號(hào)染色體中的序列的位置關(guān)系具體如圖7所示。這里，序列X為5'-GCCGGG-3'，兩處序列X間相距32個(gè)堿基。針對(duì)5'側(cè)的序列X的5，側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)引物(5);針對(duì)與夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域互補(bǔ)的鏈來設(shè)計(jì)引物(6)。(2)核酸擴(kuò)增反應(yīng)采用具有如下所示組成的反應(yīng)液，在6(TC下反應(yīng)60分鐘，以實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。酶使用的是NEB公司的Bst.DNAPolymerase。<反應(yīng)液的組成>10xBst緩沖液(不含洗滌劑)1都L100mMMgS0410%(v/v)Tween200.1100%DMSO0.5^25mMdNTP，每種0.56nLSYBRGreenI(稀釋2000倍)0.2nL50|iM引物(5)0.64&50pM引物(6)0.6化LBst.Polymerase0.4nL上述(l)所得到的核酸片段試樣溶液(3.0ng)0.4|iL精制水4.96uLlO.O^L(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測采用實(shí)時(shí)熒光檢測裝置(Mx3000p，Stratagene公司制造)對(duì)上述(2)中的擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行熒光檢測。結(jié)果如圖8所示。采用Mx3000p分析軟件，計(jì)算在上述的圖中熒光量達(dá)到250時(shí)所需要的時(shí)間(Ct值)。該Ct值為50.1±0.4分鐘。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><實(shí)施例8>擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳使用3重量％的瓊脂糖凝膠、0.5xTBE緩沖液(50mMTris,45mM硼酸、0.5mMEDTA,pH8.4)，在100V下進(jìn)行60分鐘的電泳。結(jié)果如圖9所示。兩個(gè)樣品的電泳圖譜大體上相同，可以看出擴(kuò)增產(chǎn)物是根據(jù)相同的反應(yīng)機(jī)理而得到的。<實(shí)施例9>核酸的擴(kuò)增反應(yīng)(1)含有靶核酸片段的核酸試樣溶液的配制將3.0ng的HumanGenomicDNA(Clontech公司制造)在98。C下加熱3分鐘，使之成為單鏈后，采用以下的條件對(duì)7號(hào)染色體中的序列進(jìn)行擴(kuò)增。<引物>使用7號(hào)染色體中的序列作為目標(biāo)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。各引物的序列如下所示。引物(5)(正向引物)5'-CATTGCTCAGGGGTCTTC-3,(序列編號(hào)11)引物(7)(反向引物)5'-GGGCTCATAAGGTGCGTG-3，(序列編號(hào)13)上述引物相對(duì)于7號(hào)染色體中的序列的位置關(guān)系具體如圖10所示。這里，序列X為5，-GCCGGG-3，，兩處序列X間相距32個(gè)堿基。針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)引物(5);針對(duì)3'側(cè)的序列X的3'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)(2)核酸擴(kuò)增反應(yīng)采用具有如下所示組成的反應(yīng)液，在60'C下反應(yīng)60分鐘，以實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。酶使用的是NEB公司的Bst.DNAPolymerase。<反應(yīng)液的組成>10xBst緩沖液(不含洗滌劑)100mMMgS040.6^10%(v/v)Tween200.1iiL100%DMSO25mMdNTP，每種SYBRGreenIC稀釋2000倍)0.2(iL50pM引物(5)0.64^50nM引物(7)0.64)liLBst.Polymerase0.4|iL上述(l)所得到的核酸片段試樣溶液(3.0ng)O.化L精制水_4-96^iLIO單(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測采用實(shí)時(shí)熒光檢測裝置(Mx3000p，Stratagene公司制造)對(duì)上述(2)中的擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行熒光檢測。結(jié)果如圖ll所示。采用Mx3000p分析軟件，計(jì)算在上述的圖中熒光量達(dá)到250時(shí)所需要的時(shí)間(Ct值)。該Ct值為49.0±5.0分鐘。Ct(250)[分鐘]52.545.5<實(shí)施例10>擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳使用3重量％的瓊脂糖凝膠、0.5xTBE緩沖液(50mMTris，45mM硼酸、0.5mMEDTA,pH8.4)，在100V下進(jìn)行60分鐘的電泳。結(jié)果如圖12所示。由電泳圖譜可以看出，兩個(gè)樣品得到了大體上相同的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物是根據(jù)相同的反應(yīng)機(jī)理而得到的。序列表<110>富士膠片株式會(huì)社〈120>核酸的擴(kuò)增方法<130>F卜081121-59:56<150>JPNo.2007-211633〈151>2007-08-15〈160〉13<170〉PatentInversion3.3<210>1〈211>20<212>DNA〈213>人工序列〈220><223>人工序列的描述合成DNA〈400>1gggcatgggtcagaaggatt20〈210>2<211〉17<212〉DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>2cctcgtcgcccacatag17<210>3<211>17〈212>DNA〈213>人工序列<220>〈223>人工序列的描述合成DNA<400〉3caggaaacagctatgac17<210>4〈211〉38〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述PCR產(chǎn)物<400>4gggcatgggtcagaaggattcctatgtgggcgacgagg38<210〉5〈211〉92<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>人工序列的描述PCR產(chǎn)物<400>5gggcatgggtcagaaggattcctatgtgggcgacgaggcccagggcgtgatggtgggcat60gggtcagaaggattcctatgtgggcgacgagg92〈210〉6<211>146〈212>DNA〈213>人工序列<220><223>人工序列的描述PGR產(chǎn)物<400〉6gggcatgggtcagaaggattcctatgtgggcgacgaggcccagggcgtgatggtgggcat60gggtcagaaggattcctatgtgggcgacgaggaccagggcgtgatggtgggcatgggtca120gaaggattcctatgtgggcgacgagg146〈210>7<211>16〈212〉DNA〈213〉人工合成<220〉<223>人工序列的描述合成DNA<400>7atcgtggccatcgcct16<210>8<211>17<212>瞧<213>人工合成<220><223>人工序列的描述合成DNA〈400>8ccagcgasgtC3cg33c17<210>9〈211>64<212>■<213>人工合成<220><223>人工序列的描述PCR產(chǎn)物<400>9atcgtggccatcgcctggactccgagacaccagaccatgaccaacgtgttcgtgacttcg60ctgg64<210>10<211>153<212>,<213>人工合成〈220><223>人工序列的描述PCR產(chǎn)物<400>10atcgtggccatcgcctggactccgagacaccagaccatgaccaacgtgttcgtgacttcg60ctgggcaccgtgggaggcaacctgctggtcatcgtggccatcgcctggactccgagacac120cagaccatgaccaacgtgttcgtgacttcgctg153<210>11<211>18<212>DNA〈213>人工合成<220><223>人工序列的描述合成DNA<400〉11cattgctcaggggtcttc18<210>12<211〉16<212〉DNA<213〉人工合成<220>〈223>人工序列的描述合成DNA〈400〉12atttcggctcccttgg16<210>13<211>18〈212〉DNA<213>人工合成<220>〈223〉人工序列的描述合成DNA<400>13gggctcataaggtgcgtg18權(quán)利要求1.一種擴(kuò)增核酸的方法，其包括通過將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應(yīng)溶液進(jìn)行孵育，以上述引物的3’末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，從而將所述核酸片段擴(kuò)增，其特征在于，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物，使得在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域或者該區(qū)域的一部分能夠擴(kuò)增。2.權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增核酸的方法，其特征在于，對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物，其中，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域來設(shè)計(jì)所述第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)所述第二寡核苷酸引物，而且，所述第二寡核苷酸引物設(shè)計(jì)在與所述第一寡核苷酸引物互補(bǔ)的序列的5'側(cè)。3.權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增核酸的方法，其特征在于，對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物，其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的IOO個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)所述第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)夾在5'側(cè)的序列X的5'末端堿基和3'側(cè)的序列X的3'末端堿基之間的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)所述第二寡核苷酸引物。4.權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增核酸的方法，其特征在于，對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物，其中，針對(duì)5'側(cè)的序列X的5'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域來設(shè)計(jì)所述第一寡核苷酸引物；并且，針對(duì)3'側(cè)的序列X的3'側(cè)的100個(gè)堿基以內(nèi)的區(qū)域的互補(bǔ)鏈來設(shè)計(jì)所述第二寡核苷酸引物。5.權(quán)利要求14中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述序列X以及與序列X互補(bǔ)的序列Xc為由5個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列。6.權(quán)利要求15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述序列X以及與序列X互補(bǔ)的序列Xc為由7個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列。7.權(quán)利要求16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述反應(yīng)溶液中含有至少0.05%以上的表面活性劑。8.權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述表面活性劑為非離子型表面活性劑。9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述非離子型表面活性劑選自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯類、聚氧乙烯烷基酚醚類、聚氧乙烯垸基醚類。10.權(quán)利要求19中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述反應(yīng)溶液中至少含有二價(jià)陽離子。11.權(quán)利要求110中任意一項(xiàng)所述的擴(kuò)增核酸的方法，其中，所述反應(yīng)溶液中還含有解鏈溫度調(diào)節(jié)劑。12.權(quán)利要求11所述的擴(kuò)增核酸的方法，其中，所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑為二甲基亞砜、甜菜堿、甲酰胺或甘油、或者它們中的兩種以上的混合物。13.權(quán)利要求112中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述反應(yīng)溶液中所含有的每種脫氧核苷三磷酸的濃度均為l.OmM以上且lOOmM以下。14.權(quán)利要求113中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述反應(yīng)溶液中所含有的每一種寡核苷酸引物的濃度均為lpM以上且100pM以下。15.權(quán)利要求114中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物與所述模板核酸片段的一部分基本上互補(bǔ)。16.權(quán)利要求114中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物只有3'末端區(qū)域與所述模板核酸片段基本上互補(bǔ)。17.權(quán)利要求116中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物只與所述模板核酸片段的一處的連續(xù)核苷酸基本上互補(bǔ)。18.權(quán)利要求117中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述至少一種的具有鏈置換能力的DNA聚合酶為選自來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的5'—3'外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、來源于熱堅(jiān)芽孢桿菌的5'—3，外切核酸酶缺失的BcaDNA聚合酶、及來源于Thermococcuslitoralis的5'—3'外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶中的聚合酶。19.權(quán)利要求118中任意一項(xiàng)所述的擴(kuò)增核酸的方法，其中，核酸的擴(kuò)增工序在室溫以上且IO(TC以下的基本上恒溫的條件下進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明提供一種使用寡核苷酸引物和DNA聚合酶能夠進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法。本發(fā)明提供一種核酸的擴(kuò)增方法，其包括將含有至少一種脫氧核苷三磷酸、至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶、至少兩種寡核苷酸引物、以及作為模板的核酸片段的反應(yīng)溶液進(jìn)行孵育，以上述引物的3′末端作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)，從而將該核酸片段擴(kuò)增，其特征在于，對(duì)于在200個(gè)堿基以內(nèi)存在有兩處以上的由4個(gè)以上連續(xù)堿基構(gòu)成的序列X的區(qū)域，設(shè)計(jì)第一寡核苷酸引物及第二寡核苷酸引物。文檔編號(hào)C12P19/34GK101368197SQ20081014598公開日2009年2月18日申請(qǐng)日期2008年8月15日優(yōu)先權(quán)日2007年8月15日發(fā)明者三好隼人,巖木義英,森壽弘申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社