專利名稱：多環(huán)芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種多環(huán)芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上苯環(huán)連在一起構(gòu)成的烴類化合物，是一類具有致癌、致畸、致突變作用的有機物，在環(huán)境中分布廣泛且具有生物難降解性因而引起人們的廣泛關(guān)注。由于PAHs分子中存在共軛大n鍵電子體系，因此具有較高的穩(wěn)定性，通常情況下很難被微生物降解。為了提高PAHs的生物降解速率，馴化篩選出高效降解菌群是非常重要的一個方面。PAHs的好氧生物降解比厭氧生物降解的速率要快很多倍，因此在PAHs污染土壤的異位修復(fù)及水污染治理中常用好氧生物處理技術(shù)。然而由于缺少高效的多環(huán)芳烴降解菌，制約了多環(huán)芳烴污染土壤生物修復(fù)技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用。因此，需要從污染的環(huán)境中馴化篩選出降解速率較快的土著微生物菌群，然后再把它們應(yīng)用于實際PAHs污染環(huán)境的生物治理，這對于治理和修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤有重要的意義。
由于PAHs是疏水性有機物，大多數(shù)多環(huán)芳烴化合物難溶于水，其可溶性隨苯環(huán)數(shù)量的增多而減少。多環(huán)芳烴特別是高于四環(huán)的稠環(huán)芳烴，水溶解性很低且對微生物有較高的毒性作用，這使得常規(guī)馴化與篩選微生物菌群的技術(shù)無法適用于對降解多環(huán)芳烴微生物群的馴化與篩選。而且馴化的環(huán)境條件，馴化周期，及馴化的過程參數(shù)選定等都對馴化出菌群的降解效能有密切的關(guān)系，這些都需要經(jīng)過一系列的試驗研究后才能確定出最佳范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種多環(huán)芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應(yīng)用。其具體步驟如下-
(1) 選取受石油污染的土壤，將其通過直徑為2mm的網(wǎng)篩后立即放置于4'C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> (2) 向體積為1000mL的開口玻璃瓶中加入25 30mL濃度為1 g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為200:10:1:1，為除去丙酮將玻璃瓶開口放置2天。
(3) 向步驟(2)中開口玻璃瓶中加入500 600mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下攪拌40 50min后加入步驟(1)中的土壤250g;然后置于溫度為25~30°C的環(huán)境中在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下攪拌富集馴化培養(yǎng)30d，在培養(yǎng)期間定期向玻璃瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基以維持玻璃瓶中泥漿系統(tǒng)的水土比例保持不變；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為NH4Cl:1.5g丄"，KH2P04: 1.5g.L"， MgCl2: 0.25 gl/'， CaClr2H20: 0.10 gl/'。
(4) 向體積為100 200mL的錐形瓶中加入10mL濃度為1 g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為200:10:1:1，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。
(5) 按水與高分子樹脂吸附劑的質(zhì)量比為5:1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質(zhì)量比為3:1的比例用99%的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在溫度為60'C的烘箱中放置2天。
(6) 向步驟(4)中的錐形瓶中入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.5mL微量金屬液和0.1 mL維生素c溶液；其中微量金屬液的組成為CoCh^HzOJSmg'L-1, CuCl2: 0.20 mg.1/1， H3B03: 6.0mg.1/1， MnCl24H20:25mg.L"， Na2Mo04'2H20: 3.0 mg-L" ， NiClr 2H20: 2.0 mgl/1， ZnCl2:2.5mg.1/1。
(7) 向步驟(6)中的錐形瓶內(nèi)加入步驟(5)處理后的吸附劑0.35g，將其密封后放置在轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中平衡2天。
(8) 向步驟(7)中的錐形瓶內(nèi)接入步驟(3)馴化的土壤0.25g，然后置于溫度為25~30°C轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天，每天打開瓶口一次以恢復(fù)錐形瓶內(nèi)的溶解氧；按接種體積比為200 250:1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(4)至(7)處理后的錐形瓶內(nèi)，當(dāng)轉(zhuǎn)接次數(shù)大于8之后即可獲得高效去除多環(huán)芳烴的好氧降解菌群。
所述吸附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
本發(fā)明的有益效果是所述的方法能夠富集與馴化篩選到對多環(huán)芳烴具有好氧降解性能好的微生物菌群，對萘、菲、笏和芘的好氧降解速率分別為5.46mg丄+d"; 0.48mg丄"，d";0.05 mg.L".d"及0.06 mgL"cT1。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種多環(huán)芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應(yīng)用。向加入多環(huán)芳烴和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的開口玻璃瓶內(nèi)加入受石油污染的土壤進行多環(huán)芳烴好氧降解微生物的富集與馴化，30d后向加入多環(huán)芳烴、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶內(nèi)接入富集馴化的土壤。在溫度為25 3(TC、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5 7天后，進行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到高效去除多環(huán)芳烴的好氧降解菌群。
下面是以運用馴化的菌群進行了多環(huán)芳烴的好氧降解試驗，進一步說明本發(fā)明。
實施例 '
運用本發(fā)明方法馴化的菌群進行了多環(huán)芳烴的好氧降解試驗，結(jié)果表明菌群能夠?qū)?、菲、藥和芘進行有效的好氧降解；當(dāng)萘的初始濃度為27.4mg/L時，5天后能降解到0.01mg/L以下，當(dāng)菲的初始濃度為1.01mg/L時，2天后能降解到0.05mg/L以下，當(dāng)笏的初始濃度為O.llmg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下，當(dāng)芘的初始濃度為0.12 mg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、芴和芘的好氧降解速率分別為(菌體濃度為5xlO"個/mL) : 5.46mg.L".d"; 0.48mgL"d"; 0.05 mgL"d"及0.06 mgL十d.1。
權(quán)利要求
1.一種多環(huán)芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下(1)選取受石油污染的土壤，將其通過直徑為2mm的網(wǎng)篩后立即放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)向體積為1000mL的開口玻璃瓶中加入25～30mL濃度為1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為200∶10∶1∶1，為除去丙酮將玻璃瓶開口放置2天。(3)向步驟(2)中開口玻璃瓶中加入500～600mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下攪拌40～50min后加入步驟(1)中的土壤250g；然后置于溫度為25～30℃的環(huán)境中在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下攪拌富集馴化培養(yǎng)30d，在培養(yǎng)期間定期向玻璃瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基以維持玻璃瓶中泥漿系統(tǒng)的水土比例保持不變；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為NH4Cl1.5g·L-1，KH2PO41.5g·L-1，MgCl20.25g·L-1，CaCl2·2H2O0.10g·L-1。(4)向體積為100～200mL的錐形瓶中加入10mL濃度為1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮混合溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例為200∶10∶1∶1，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天。(5)按水與高分子樹脂吸附劑的質(zhì)量比為5∶1的比例用去離子水將吸附劑清洗5次，然后按乙醇與吸附劑的質(zhì)量比為3∶1的比例用99％的乙醇將吸附劑清洗3次，為徹底除去吸附劑中的乙醇將清洗后的吸附劑在溫度為60℃的烘箱中放置2天。(6)向步驟(4)中的錐形瓶中入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.5mL微量金屬液和0.1mL維生素c溶液；其中微量金屬液的組成為CoCl2·6H2O35mg·L-1，CuCl20.20mg·L-1，H3BO36.0mg·L-1，MnCl2·4H2O25mg·L-1，Na2MoO4·2H2O3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O2.0mg·L-1，ZnCl22.5mg·L-1。(7)向步驟(6)中的錐形瓶內(nèi)加入步驟(5)處理后的吸附劑0.35g，將其密封后放置在轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中平衡2天。(8)向步驟(7)中的錐形瓶內(nèi)接入步驟(3)馴化的土壤0.25g，然后置于溫度為25～30℃轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5～7天，每天打開瓶口一次以恢復(fù)錐形瓶內(nèi)的溶解氧；按接種體積比為200～250∶1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(4)至(7)處理后的錐形瓶內(nèi)，當(dāng)轉(zhuǎn)接次數(shù)大于8之后即可獲得高效去除多環(huán)芳烴的好氧降解菌群。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述多環(huán)芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選技術(shù)，其特征在于，所 述吸附劑為高分子樹脂XAD-2或XAD-7。
3. —種權(quán)利要求1所述多環(huán)芳烴好氧降解菌群的應(yīng)用，其特征在于，運用馴化的菌群進行 ,了多環(huán)芳烴的好氧降解試驗，結(jié)果表明菌群能夠?qū)?、菲、芴和芘進行有效的好氧降解；當(dāng) 萘的初始濃度為27.4mg/L時，5天后能降解到0.01mg/L以下，當(dāng)菲的初始濃度為l.Ol mg/L時，2天后能降解到0.05mg/L以下，當(dāng)芴的初始濃度為O.ll mg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下， 當(dāng)芘的初始濃度為0.12mg/L時，2天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、笏和芘的好氧降解速 率分別為(菌體濃度為5xl()7個/mL) : 5.46mgL"d"; 0.48 mgL"d"; 0.05 mg'L"d"及0.06 mg,L"-cT1。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一種多環(huán)芳烴好氧降解菌群的富集與馴化篩選方法及應(yīng)用。向加入多環(huán)芳烴和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的開口玻璃瓶內(nèi)加入受石油污染的土壤進行多環(huán)芳烴好氧降解微生物的富集與馴化，30d后向加入多環(huán)芳烴、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶內(nèi)接入富集馴化的土壤。在溫度為25～30℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5～7天后，進行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到高效去除多環(huán)芳烴的好氧降解菌群。本方法能夠富集與馴化篩選到對多環(huán)芳烴具有好氧降解性能好的微生物菌群，對萘、菲、芴和芘的好氧降解速率分別為5.46mg·L^-1·d^-1；0.48mg·L^-1·d^-1；0.05mg·L^-1·d^-1及0.06mg·L^-1·d^-1。
文檔編號C12N1/00GK101654657SQ20081014711
公開日2010年2月24日 申請日期2008年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日
發(fā)明者丁愛中, 豆俊峰 申請人:北京師范大學(xué)