專利名稱：不動桿菌auh-jlm455及其轉(zhuǎn)化制備s-雌馬酚的方法
不動桿菌AUH-幾M455及其轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚的方法 技術領域-
本發(fā)明涉及一種不動桿菌菌株及該菌株將大豆中富含的大豆素(daidzein)或大豆 苷(daidzin)直接轉(zhuǎn)化為高活性植物雌激素S-雌馬酚OS-equol)的方法，屬于生物化工領域。
背景技術：
1986年美國科學家首先發(fā)現(xiàn)大豆中的異黃酮(soybean isoflavones)具有抑制癌細 胞生長的功效。其后，大量研究表明，日常飲食中富含大豆及大豆制品的人群，其乳 腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、骨質(zhì)疏松癥及心血管發(fā)病率明顯低于較少攝入大豆及其制 品的人群。流行病學研究證實，亞洲女性乳腺癌及男性前列腺癌的發(fā)病率遠低于西方 亞洲人；移居美國并接受西方飲食方式的亞洲人，其乳腺癌和前列腺癌的發(fā)病率明顯 升高。對更年期婦女補充大豆異黃酮可明顯緩解如潮熱等更年期綜合癥。
大豆異黃酮是大豆等極少數(shù)豆科植物在其生長過程中形成的次生代謝產(chǎn)物，在大豆 的種皮、胚軸以及子葉中均有分布。天然大豆中的異黃酮大多以各種糖苷(glucosides) 形式存在，大豆苷是以糖苷形式存在的大豆異黃酮的主要成分。大豆苷在糖苷酶作用 下被水解為大豆素。攝入機體的大豆異黃酮糖苷在腸道和肝組織中存在的卩-葡糖糖苷 酶的作用下首先被水解為大豆素等苷元，大豆素再進一步被降解為二氫大豆素 (dihydrodaidzein，簡稱DHD)、四氫大豆素(tetrahydrodaidzein，簡稱THD)、雌馬酚等 代謝產(chǎn)物，其中雌馬酚是目前大豆異黃酮及其所有代謝產(chǎn)物中活性最高的成分。
早在20年前當雌馬酚首次從大豆食用者的尿液中被分離出來時，美國著名營養(yǎng)學家 Setchell就曾預言，雌馬酚可能在人類雌激素相關疾病的預防和治療中發(fā)揮重要作用。 雌馬酚除具有上述雌激素樣作用外，還表現(xiàn)了極強的抗氧化活性。雌馬酚的抗氧化活 性比其親本化合物大豆素高100倍。最新研究表明，雌馬酚能有效降低H202引起的DNA 鏈斷裂，作用效果優(yōu)于其前體大豆素和傳統(tǒng)的抗氧化維生素抗壞血酸及a-生育酚。在 疾病防治方面，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，雌馬酚具有抗腫瘤、緩解更年期綜合癥、預防骨 質(zhì)疏松和降低心血管發(fā)病率等功效。雌馬酚的抗癌作用研究目前多側(cè)重于前列腺癌和 乳腺癌等。雌馬酚對前列腺癌的抑制作用已得到流行病學和體外證實。此外，最新研 究表明，雌馬酚可以抑制腫瘤引發(fā)的生物標志物鳥氨酸脫羧酶活性升高，有劑量依賴 性，其抗癌活性可能與抗腫瘤啟動有關。對更年期婦女補充大豆異黃酮可明顯緩解更 年期綜合癥。更年期癥狀的改善與雌馬酚水平有關，血和尿中雌馬酚含量較低的受試 者癥狀改善更為明顯。最新研究結(jié)果表明，大豆異黃酮對心血管疾病的保護作用與雌 馬酚有密切關系。此外，動物實驗表明，去卵巢大鼠皮下注射雌馬船4周，腰椎、股骨 骨礦物質(zhì)密度(BMD)明顯改善。
雌馬酚屬于異黃酮類非類固醇雌激素，其化學名為7-羥基-3- (4'-羥苯基)-苯并二 氫吡喃。雌馬酚不屬天然產(chǎn)物，只能通過微生物代謝或化學方法進行合成。盡管許多 動物如小鼠、大鼠、猴子、羊等都能產(chǎn)生高水平雌馬酚，但并非所有攝取大豆異黃酮 的人群都能在體內(nèi)產(chǎn)生雌馬酚，人群中只有1/3 ~ 1/2的個體能將攝入體內(nèi)的大豆素或大 豆苷轉(zhuǎn)化為雌馬酚。大部分人自身不能在腸道微生物菌群作用下將攝入體內(nèi)的大豆異 黃酮轉(zhuǎn)化為雌馬酚，需要外界的供給。
由于雌馬酚是手性分子(見圖l)，利用化學氫轉(zhuǎn)移法人工合成的雌馬酚為i -和S-兩種對映異構(gòu)體等量的混合物，即外消旋體雌馬酚(士equol)，而體內(nèi)代謝產(chǎn)生的雌馬 酚則全部為S-雌馬酚。研究結(jié)果表明，雌馬酚的兩種對映異構(gòu)體與雌激素受體ERa和 ERp的親和力不同。S-雌馬酚與ERp的親和力較強，而i -雌馬酚則與ERa的親和力較強。 有關研究表明，E&有利于DNA的轉(zhuǎn)錄翻譯，對細胞增殖起促進作用；而ERp則對 起抑制作用。因而，不難推測，當癌癥患者體內(nèi)攝入一定量的f雌馬酚時，i -雌馬酚 通過與人體雌激素受體ER^結(jié)合，對癌細胞本身的增殖也將起到促進作用。20世紀60 年代，非巴比妥類鎮(zhèn)靜藥沙利度安(又名反應停)曾被廣泛應用于妊娠反應，結(jié)果導 致46個國家8000多例海豹肢畸形胎兒的誕生。經(jīng)研究證實，鎮(zhèn)靜藥沙利度安為外消 旋體(土thalidomide)化合物，其中i -型沙利度安起強鎮(zhèn)定作用，而S-型則具有強致畸 作用。利用化學氫轉(zhuǎn)移法可人工合成為i -雌馬酚和S-雌馬酚兩種對映異構(gòu)體等量的混 合物，不僅需要價格昂貴的化學催化劑，而且進行7 -型和S-型對映異構(gòu)體的拆分同樣 需要很大的經(jīng)濟投入，因此采用微生物生物轉(zhuǎn)化的方法來生物合成單一異構(gòu)體S-雌馬 酚具有誘人的開發(fā)利用前景。
韓國專利PCT / KR2005 / 001285公開了 一種能將二氫大豆素轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的革 蘭氏陰性新奇微生物細菌菌株五ggew/zd/a Julong732，但該菌株卻不能直接將大豆素轉(zhuǎn) 化為S-雌馬酚。二氫大豆素是大豆素的加氫還原產(chǎn)物，目前雖然能以大豆素為原料通 過化學氫轉(zhuǎn)移法進行合成，但價格昂貴(LcLabs)。本發(fā)明人最近報道了從牛瘤胃分離 的能將大豆素轉(zhuǎn)化為二氫大豆素的革蘭氏陽性細菌菌株Niu-016 (J.Biotechno1.2005), 使二氫大豆素的微生物生物合成變?yōu)榭赡堋榱四軌蛑苯右粤畠r天然產(chǎn)物大豆素為原 料生產(chǎn)高活性植物雌激素S-雌馬酚，本發(fā)明人也曾嘗試過菌株的混合培養(yǎng)，即將特定 轉(zhuǎn)化大豆素為二氫大豆素的牛瘤胃分離菌株Niu-016與能將二氫大豆素轉(zhuǎn)化為S-雌馬 酚的人體腸道微生物菌株Julong732進行混合培養(yǎng)(Arch. Microbiol.， 2007)。通過混合 培養(yǎng)，確實能將加入到培養(yǎng)基中的大豆素直接轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚，但要求條件比較苛刻， 即必須保證生長勢相對較弱的、能將二氫大豆素轉(zhuǎn)化為雌馬酚的人體腸道細菌 Julong732在與能將大豆素轉(zhuǎn)化為二氫大豆素的牛瘤胃細菌混合后能正常生長，否則， 最終代謝產(chǎn)物中將只有二氫大豆素而無S-雌馬酚。因此，混合培養(yǎng)時，最初兩菌株生
長狀況及接種量十分關鍵，也很難把握，很難實現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是解決現(xiàn)有技術中存在的轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚實現(xiàn)難的問題，提供 一種能將潛手性化合物大豆素或大豆苷直接轉(zhuǎn)化為手性化合物S-雌馬酚的單一功能微 生物菌株及其制備方法。
為完成上述目的，本發(fā)明的技術解決方案是
一種不動桿菌v4c/"eto6a"w sp. AUH-JLM455菌株，保藏號為CGMCC No.2333。 上述不動桿菌^c/"eto^"w sp. AUH-JLM455菌株的制備方法如下
1、 樣品的采集
取ICR小鼠新鮮糞便，放入盛放在帶蓋試管中、上面覆蓋2 3毫米礦物油的2毫 升BHI新鮮液體培養(yǎng)基中，樣品采集后盡快置溫度為37°C的厭氧工作站內(nèi)；
2、 樣品的梯度稀釋與特定功能菌株的分離篩選
(1) 單一菌落式分離培養(yǎng) 用新鮮BHI液體培養(yǎng)基將事先在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)24小時的微生物菌群進行多級
稀釋，分別稀釋到10"、 10.2、 l(T3、 10—4、 IO-5、 l(T6、 IO'7、 IO-8倍，再分別將100微
升稀釋倍數(shù)分別為l(T5、 10—6、 10—7、 l(T8的微生物菌群稀釋液均勻涂布在預先備好的 BHI固體培養(yǎng)基上，將涂有微生物菌群稀釋液的BHI固體培養(yǎng)基置于厭氧工作站內(nèi)培 養(yǎng)18~24小時后，從BHI固體培養(yǎng)基上挑取全部單菌落分別劃線在BHI固體培養(yǎng)基上， 置于溫度為37。C的厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)24小時后，對劃線的單菌落進行隨機編號；
(2) 單菌落的混合培養(yǎng)及活性檢測
每10個已編號的單菌落分為一組，將每組的10個單菌落全部接種到盛有1毫升 BHI液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，再在每個試管分別加入0.1毫摩爾/升底物大豆素，共同培 養(yǎng)2 3天后，取200微升培養(yǎng)液并用1000微升乙酸乙酯進行萃取，再用高效液相色譜 儀檢測有無雌馬酚生成；
(3) 具有轉(zhuǎn)化功能的單菌落的篩選 一旦某一試管中被檢測出有雌馬酚的生成，立即將接種到該試管中的事先已編號
的IO個己培養(yǎng)在BHI固體培養(yǎng)基上的單菌落，重新分別接種到10個盛有1毫升BHI 液體培養(yǎng)基的不同小試管中，再分別加入O.l毫摩爾/升的底物大豆素，共同培養(yǎng)2~3 天，取200微升培養(yǎng)液加入1000微升乙酸乙酯進行提取，用高效液相色譜儀進行檢測， 檢測出有雌馬酚生成的試管內(nèi)接種的單菌落即為混合培養(yǎng)試管內(nèi)真正起轉(zhuǎn)化作用的功 能單菌落；
3、 單一功能微生物菌種的純化培養(yǎng)、菌種初步鑒定與保藏 (1)單菌落的純化培養(yǎng)
將篩選出的單一微生物菌落在BHI固體培養(yǎng)基上進行反復純化培養(yǎng)3次以上，確
保菌落形態(tài)一致，將純化的單一菌株接種到已滅菌的上面覆蓋2毫米厚金屬油的50% 的甘油水溶液中，將微生物純菌種保藏在-70'C的超低溫冰箱中并定期進行復壯培養(yǎng)和 轉(zhuǎn)化活性測定；
(2)對篩選出的單一功能微生物菌株進行菌種鑒定
根據(jù)菌落及菌體形態(tài)、革蘭氏染色、微生物耐氧性能、常規(guī)生化鑒定以及16SrDNA 基因序列等多項指標，將分離到的功能細菌菌株AUH-JLM455初步鑒定為不動桿菌屬 "c/we勵a"er sp.)菌株。
本發(fā)明的不動桿菌AUH-JLM455菌株已于2008年01月10日在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，保藏號為CGMCCNo.2333。 本發(fā)明的不動桿菌株""'/^/o6oc/wsp.) AUH-JLM455具有以下微生物學特性
1、 形態(tài)學特征
在顯微鏡下觀察在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株時，菌體呈球桿狀或類球狀，無鞭 毛，菌體長度為0.2pm~0.3 pm。
2、 培養(yǎng)學特性
在37。C下，在以下各種固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，本發(fā)明的菌株具有以下特性
(1) 在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落無色透明，菌落中央微凸稍發(fā)白。
(2) 在GAM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌落比在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)的稍大，無色透明，菌 落中央微凸。
(3) 在血平板上培養(yǎng)18-24h后，菌落直徑1.5~2mm、圓形、突起、濕潤、呈灰白色。
3、 生理特性
本發(fā)明的菌株是一種嚴格厭氧細菌，在35 37。C下顯示最佳生長能力，不具有淀粉 水解和凝膠液化能力。
本發(fā)明的不動桿菌菌株(Jd"eto6ac/"sp.) AUH-JLM455 (CGMCCNo.2333)與不 動桿菌的代表菌株鮑曼不動桿菌之間在形態(tài)學和生理學特性上異同見表l。
表1不動桿菌屬菌株AUH-JLM455與鮑曼不動桿菌形態(tài)學和生理學特性比較
特性
不動桿菌(v4"7 "o6a"er sp.)
AUH-JLM455 鮑曼不動桿菌株
血平板上經(jīng)37°C培養(yǎng)血平板上經(jīng)35°C培養(yǎng) 24h后，菌落直徑18-24h后，菌落直徑
形態(tài)學特征 1.5~2mm; 1.5~2.5mm;
菌落呈圓形突起，濕潤，菌落呈圓形突起，濕潤，
灰白色 灰白色乳酪樣 在光學顯微鏡下呈短桿 狀或類球狀
以球桿狀、類球狀或雙球 菌狀多見
生理學特征
革蘭氏染色呈陰性
革蘭氏染色呈陰性
革蘭氏染色時，菌體呈 "破魚網(wǎng)狀排列"
革蘭氏染色時，菌體呈 "破魚網(wǎng)狀排列"
氧化酶和過氧化氫酶均 陰性
氧化酶陰性，過氧化氫酶 陽性
半固狀培養(yǎng)基內(nèi)無動力 生化反應結(jié)果為硝酸鹽 還原、吲哚、明膠液化、 D-葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、 甘露糖等陰性
半固狀培養(yǎng)基內(nèi)無動力 硝酸鹽還原、吲哚、葡萄 糖酸化、尿素、明膠、(3-半乳糖苷酶、甘露糖、甘 露醇、麥芽糖等均陰性；
本發(fā)明的另一目的是提供一種不動桿菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化制備S-雌馬船的方法。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案達到的
一種不動桿菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化S-雌馬酚的方法，其歩驟如下
1、 細菌菌株AUH-JLM455的培養(yǎng)
將菌株AUH-JLM455活化，按1/10接種量接種在已滅菌的新鮮BHI液體培養(yǎng)基 內(nèi)，在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)1~2天；厭氧工作站溫度37。C,工作站以外源混合氣體保持 壓力，混合氣體比例為高純氮氣85%，氫氣10%, 二氧化碳5%;
2、 底物的加入與代謝產(chǎn)物的分離純化
(1) 底物的加入所采用的底物為大豆素或大豆苷
將0.5毫摩爾/升的底物加入已接種菌株AUH-JLM455并在厭氧工作站內(nèi)生長1~2 天的菌液中，在厭氧工作站內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 3天，即可將底物轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚；
(2) 代謝產(chǎn)物的分離純化
取上述培養(yǎng)的混合物，用等量的乙酸乙酯分別萃取三次，萃取液蒸干后，加入100% 甲醇，在制備型高效液相色譜儀上可分離得到S-雌馬酚。 3、代謝產(chǎn)物對映體過量率(e.e.%)檢測
將2 (2)中獲得的S-雌馬酚純品重新溶解在100%甲醇中，在手性柱上檢測出峰 情況，并根據(jù)峰面積計算對映體過量率。本發(fā)明中經(jīng)手性柱后僅出現(xiàn)一個物質(zhì)峰(圖4)， 表明本發(fā)明中合成雌馬酚的對映體過量率為100%e.e.，該峰的保留時間與標準品S-雌 馬酚相同，表明本發(fā)明中合成的雌馬酚確實為100%&雌馬酚。 有益效果 本發(fā)明提供的不動桿菌株AUH-JLM455能將潛手性化合物大豆素或大豆苷轉(zhuǎn)化為 手性化合物S-型雌馬酚。分離出的S-雌馬酚在濃度為20微摩爾/升時對肝癌細胞株 SMMC-7721即可產(chǎn)生明顯的體外抑制作用，流式細胞術結(jié)果顯示，該濃度可將細胞阻 滯在S期并誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡。
下面通過附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但并不意味著對本發(fā)明保護 范圍的限制。


圖1為本發(fā)明實施例之一 ICR小鼠腸道分離菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化大豆素或大 豆苷為雌馬酚的代謝過程圖2為本發(fā)明實施例之一 ICR小鼠腸道分離菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化大豆素的 HPLC圖譜；
圖3為本發(fā)明實施例之一ICR小鼠腸道分離菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化大豆素代謝產(chǎn) 物的質(zhì)譜圖4為本發(fā)明實施例之一代謝產(chǎn)物雌馬酚在手性柱中的高效液相色譜圖； 圖5為本發(fā)明實施例之一ICR小鼠腸道分離菌株AUH-JLM455對底物大豆素的轉(zhuǎn) 化動態(tài)圖。
具體實施例方式
實施例II
1、 樣品的采集
取ICR小鼠新鮮糞便，放入盛放在帶蓋試管中、上面覆蓋2 3毫米礦物油的2毫 升BHI新鮮液體培養(yǎng)基中，樣品采集后盡快置溫度為37°C的厭氧工作站內(nèi)；
2、 樣品的梯度稀釋與特定功能菌株的分離篩選
(1) 單一菌落式分離培養(yǎng)
用新鮮BHI液體培養(yǎng)基將事先在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)24小時的微生物菌群進行多級 稀釋，分別稀釋到10"、 l(T2、 l(T3、 l(T4、 l(T5、 l(T6、 l(T7、 10-8倍，再分別將100微 升稀釋倍數(shù)分別為10'5、 10—6、 10—7、 10'8的微生物菌群稀釋液均勻涂布在預先備好的 BHI固體培養(yǎng)基上，將涂有微生物菌群稀釋液的BHI固體培養(yǎng)基置于厭氧工作站內(nèi)培 養(yǎng)18~24小時后，從BHI固體培養(yǎng)基上挑取全部單菌落分別劃線在BHI固體培養(yǎng)基上， 置于厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)24小時后，對劃線的單菌落進行隨機編號；
(2) 單菌落的混合培養(yǎng)及活性檢測
每10個已編號的單菌落分為一組，將每組的10個單菌落全部接種到盛有1毫升 BHI液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，再在每個試管內(nèi)分別加入0.1毫摩爾/升底物大豆素，共同 培養(yǎng)2 3天后，取200微升培養(yǎng)液并用1000微升乙酸乙酯進行萃取，再用高效液相色 譜儀檢測有無雌馬酚生成；
(3)具有轉(zhuǎn)化功能的單菌落的篩選 一旦某一試管中被檢測出有雌馬酚的生成，立即將接種到該試管中的事先己編號 的10個已培養(yǎng)在BHI固體培養(yǎng)基上的單菌落，重新分別接種到10個盛有1毫升BHI 液體培養(yǎng)基的不同小試管中，再分別加入O.l毫摩爾/升的底物大豆素，共同培養(yǎng)2~3 天，取200微升培養(yǎng)液加入1000微升乙酸乙酯進行提取，用高效液相色譜儀進行檢測， 檢測出有雌馬酚生成的試管內(nèi)接種的單菌落即為混合培養(yǎng)試管內(nèi)真正起轉(zhuǎn)化作用的功 能單菌落；
3、單一功能微生物菌種的純化培養(yǎng)、菌種初步鑒定與保藏
(1) 單菌落的純化培養(yǎng)
將篩選出的單一微生物菌落在BHI固體培養(yǎng)基上進行反復純化培養(yǎng)3次以上，確 保菌落形態(tài)一致，將純化的單一菌株接種到已滅菌的上面覆蓋2毫米厚金屬油的50 %的甘油水溶液中，將微生物純菌種保藏在-7(TC的超低溫冰箱中并定期進行復壯培 養(yǎng)和轉(zhuǎn)化活性測定。
(2) 對篩選出的單一功能微生物菌株進行菌種鑒定
根據(jù)菌落及菌體形態(tài)、革蘭氏染色、微生物耐氧性能、常規(guī)生化鑒定以及16S rDNA 基因序列等多項指標，將分離到的功能細菌菌株AUH-JLM455初步鑒定為不動桿菌屬 (爿c/weto6a"er sp.)菌株。
本發(fā)明的不動桿菌AUH-幾M455菌株已于2008年01月10日在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，保藏號為CGMCCNo.2333。
普通培養(yǎng)法用1(4妾種環(huán)將3~5環(huán)不動桿屬菌株Jc/加to6acfeA" sp. AUH-JLM455 (CGMCCNo.2333)接種在5毫升新鮮BHI (或GAM)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時 后轉(zhuǎn)接到盛有100毫升BHI(或GAM)液體培養(yǎng)基的250毫升三角瓶內(nèi)，靜置培養(yǎng)1 2 天后加入40毫摩爾/升的底物大豆素1.25毫升(大豆素凈含量12.7毫克)。厭氧培養(yǎng) 2~3天后用等體積乙酸乙酯萃取三角瓶內(nèi)的發(fā)酵液，萃取三次后，將萃取液乙酸乙酯用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。
A. 代謝產(chǎn)物的制備
蒸干后的粗提品溶解在100%甲醇中，過0.45)am膜后，在高效液相色譜儀上進行 分離，最終可得到7.5毫克的S-雌馬酚純品(純度>99%)。制備率為62%。本發(fā)明中使 用Watersl525型高效液相色譜儀，檢測器為2487紫外檢測器，所用制備柱型號為 Kromasil 5|am Qs色譜柱(250x8mm)。選用乙腈和水作流動相，HPLC檢測時，A液 由90%水10%乙腈組成B液由10%水90%乙腈組成。流動相以1.0毫升/分的流 速通過色譜柱，檢測器波長在270納米。
B. 代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 (l)根據(jù)代謝產(chǎn)物的紫外吸收圖譜與高效液相色譜儀上的保留時間初步確定代謝產(chǎn)物為雌馬酚。
如圖1所示，其為ICR小鼠腸道分離菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化大豆素或大豆苷的過 程圖。大豆素被轉(zhuǎn)化成雌馬酚前首先被轉(zhuǎn)化為中間代謝產(chǎn)物二氫大豆素，二氫大豆素 再繼續(xù)被轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚。
如圖2所示，其為ICR小鼠腸道分離菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化大豆素的HPLC圖 譜。向細菌菌株AUH-JLM455培養(yǎng)液中加入底物大豆素，首先在保留時間9.3分處出 現(xiàn)中間代謝產(chǎn)物峰二氫大豆素；繼續(xù)培養(yǎng)后，在保留時間為17.2分處出現(xiàn)代謝產(chǎn)物峰。 根據(jù)代謝產(chǎn)物的最大紫外吸收圖譜和保留時間，將代謝產(chǎn)物初步確定為雌馬酚。如果 所加入底物為大豆苷，則大豆苷在細菌產(chǎn)生的糖苷酶的作用下首先水解為大豆素，大 豆素再被進一歩轉(zhuǎn)化為雌馬酚。
(2) 代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜測定(ESI-MS)
如圖3所示，菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化大豆素的代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜表明，該代謝產(chǎn)物 的分子離子峰為w/z243 (100)[M+H]+，這與雌馬酚的分子量(C15H1403)相一致。
(3) 代謝產(chǎn)物的核磁共振圖譜('HNMR禾tl 13CNMR) ICR小鼠腸道分離菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化大豆素的代謝產(chǎn)物的核磁共振氫譜和碳
譜與以往報道的雌馬酚的氫譜和碳譜完全一致，具體結(jié)果如下
'H-NMR ((CD3)2CO, 400 MHz): 2.9l(m， 2H， H-4)， 3.06 (m， 1H, H-3), 3.92 (m， 1H, H-2)， 4.17 (m， 1H， H-2)， 6.28 (d, 1H， J=2.4 Hz， H-8), 6.36 (dd， H-3'), 7.15 (d， 2H， J=8.5 Hz， H陽6'), 8.17 (s, 1H, OH)， 8.27 (s, 1H， OH)。
13C_NMR ((CD3)2CO， 100M Hz): 32.18 (C-4), 38.31 (C-3), 71.09 (C-2)， 103.17 (C-8), 108.36 (C-6)， 113.58 (C-4a)， 115.79 (C-3',5')， 128.74 (C-2'，6'), 130.52 (C-5)， 132.95 (C-l'), 155.49 (C-8a), 156.70 (C-7)， 157.08 (C-4')。
C. 代謝產(chǎn)物雌馬酚手征性測定
(1) 對映體過量率(e.e.%)測定
如圖4所示，分離純化后的雌馬酚在Sumi Chiral OA-7000手性柱(5nm， 4.6x250mm: Osaka, Japan)上僅在保留時間15.5分處呈現(xiàn)單一物質(zhì)峰，且峰面積與配制雌馬酚濃度 相符，表明大豆素經(jīng)細菌菌株AUH-JLM455轉(zhuǎn)化生成的手性化合物具有100%的對映 體選擇性，即代謝產(chǎn)物為100%的單一對映異構(gòu)體。
(2) 旋光度[d]D的測定
經(jīng)分離純化后的雌馬酚溶解在乙醇中，用旋光儀測定其旋光度為-22.6°。根據(jù)以 往報道，當雌馬酚的旋光度值為負值時，其絕對立體構(gòu)型應為S-型。因此，本發(fā)明提 供的革蘭氏陰性細菌菌株能將大豆素或大豆苷轉(zhuǎn)化為100%5-型雌馬船。
D. ICR小鼠菌株對底物大豆素的轉(zhuǎn)化動態(tài)
如圖5所示，將本發(fā)明提供的能將大豆素轉(zhuǎn)化為雌馬船的細菌菌株^c/""oZ^"^
sp. AUH-JLM455接種在盛有100毫升BHI液體培養(yǎng)基的250毫升三角瓶內(nèi)，培養(yǎng)1~2 天后，加入40毫摩爾/升的底物大豆素1.25毫升，(即所加底物的濃度為0.5毫摩爾/ 升)。底物加入1天后即有一定量雌馬酚被生成，繼續(xù)培養(yǎng)2 3天后，所加入的底物大 豆素幾乎全部被轉(zhuǎn)化為雌馬酚，轉(zhuǎn)化率62%。
本發(fā)明還將上述發(fā)酵液體積加大到500毫升，其轉(zhuǎn)化動態(tài)與在100毫升發(fā)酵液中相 似，轉(zhuǎn)化率為54%。經(jīng)過上述各項試驗證明，本發(fā)明提供的不動桿菌株AUH-JLM455 能將潛手性化合物大豆素或大豆苷轉(zhuǎn)化為手性化合物S-型雌馬酚。分離出的S-雌馬酚 在濃度為20微摩爾/升時對肝癌細胞株SMMC-7721即可產(chǎn)生明顯的體外抑制作用，能 誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡。 [實施例2
不動桿菌^c/"eto6ac^ sp. AUH-JLM455菌株的分離方法如實施例1 。 混合培養(yǎng)法用lp接種環(huán)將2~3環(huán)不動桿屬菌株爿c/""o6"c妙sp. AUH-JLM455 (CGMCCNo.2333)接種在2毫升新鮮BHI (或GAM)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時 后，繼續(xù)接入100微升處于對數(shù)增長期的牛瘤胃分離菌株Niu-O16，該菌株已分別被保 藏在韓國國家微生物培養(yǎng)中心(菌種保藏號KCCM-10491)和中國中科院微生物普通 菌種保藏中心(菌種保藏號CGMCC 1.3710)。共同培養(yǎng)l天后，加入40毫摩爾/升的 底物大豆素1.25毫升(大豆素凈含量12.7毫克)。厭氧培養(yǎng)2~3天后用等體積乙酸乙 酯萃取三角瓶內(nèi)的發(fā)酵液，萃取三次后，將萃取液乙酸乙酯在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸干。蒸 干后的粗提品溶解在100%甲醇中，過0.45nm膜后，在高效液相色色譜儀上進行分離， 最終得到7.1毫克的雌馬酚純品，轉(zhuǎn)化率為59% 。
權(quán)利要求
1、一種不動桿菌Acinetobacter sp.AUH-JLM455菌株，保藏號為CGMCC No.2333。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的不動桿菌^c/"eto6a"er sp.AUH-JLM455菌株，其特征 是所述AUH-JLM455菌株為嚴格厭氧細菌。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的不動桿菌Jc/"e/o6a"w sp. AUH-JLM455菌株，其特征 是所述AUH-JLM455菌株所述AUH-幾M455菌株的細胞為短桿狀或橢圓狀。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的不動桿菌爿c/"Wo^c/w sp. AUH-JLM455菌株，其特征 是所述AUH-JLM455菌株的培養(yǎng)是在厭氧工作站內(nèi)在溫度37°C， pH值4.5~10.5下進 行。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的不動桿菌A7'weto6a"w sp.AUH-幾M455菌株，其特征 是所述AUH-JLM455菌株的革蘭氏染色呈陰性。
6、 一種權(quán)利要求l一5中任一項所述的不動桿菌爿c/股/oZja"wsp. AUH-JLM455菌株轉(zhuǎn)化S-雌馬酚的方法，其包括以下歩驟 [l]、細菌菌株AUH-JLM455的培養(yǎng)將菌株AUH-JLM455活化，按1/10接種量接種在已滅菌的新鮮BHI液體培養(yǎng)基 內(nèi)，在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)1~2天；厭氧工作站溫度37。C，工作站以外源混合氣體保持 壓力，混合氣體比例為高純氮氣85%，氫氣10%， 二氧化碳5%;2、底物的加入與代謝產(chǎn)物的分離純化(1) 底物的加入所采用的底物為大豆素或大豆苷將0.5毫摩爾/升的底物加入已接種菌株AUH-JLM455并在厭氧工作站內(nèi)生長1~2 天的菌液中，在厭氧工作站內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 3天，即可將底物轉(zhuǎn)化為S-雌馬船；(2) 代謝產(chǎn)物的分離純化取上述培養(yǎng)的混合物，用等量的乙酸乙酯分別萃取三次，萃取液蒸干后，加入100% 甲醇，在制備型高效液相色譜儀上可分離得到S-雌馬酚。
7、 一種權(quán)利要求l一5中任一項所述的不動桿菌爿c/"e,ok/"ersp. AUH-JLM455菌 株轉(zhuǎn)化S-雌馬酚的方法，其包括以下歩驟用ljx接種環(huán)將2~3環(huán)不動桿屬菌株爿c/"e o/ja"w sp.AUH-JLM455 (CGMCC No.2333)接種在2毫升新鮮BHI或GAM液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時后，繼續(xù)接入 100微升處于對數(shù)增長期的牛瘤胃分離菌株Niu-O16;共同培養(yǎng)l天后，加入40毫摩 爾/升的底物大豆素1.25毫升，其中大豆素凈含量12.7毫克；厭氧培養(yǎng)2~3天后用等 體積乙酸乙酯萃取三角瓶內(nèi)的發(fā)酵液，萃取三次后，將萃取液乙酸乙酯在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 內(nèi)蒸干；粗提品溶解在100%甲醇中，過0.45pm膜后，在高效液相色色譜儀上進行分 離，最終得到S-雌馬船。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不動桿菌AUH-JLM455及其轉(zhuǎn)化制備S-雌馬酚的方法。不動桿菌Acinetobacter sp.AUH-JLM455菌株，保藏號為CGMCC No.2333。將該菌株接種在BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)，在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)1～2天后，加入底物大豆素或大豆苷，在厭氧工作站內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2～3天后，用等量的乙酸乙酯分別萃取三次，萃取液蒸干后，加入100％甲醇，在制備型高效液相色譜儀上可分離得到S-雌馬酚。本發(fā)明提供的不動桿菌株AUH-JLM455能將潛手性化合物大豆素或大豆苷轉(zhuǎn)化為手性化合物S-型雌馬酚。分離出的S-雌馬酚在濃度為20微摩爾/升時對肝癌細胞株SMMC-7721即可產(chǎn)生明顯的體外抑制作用，該濃度可將細胞阻滯在S期并誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡。
文檔編號C12N1/20GK101338294SQ20081014731
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者飛 于, 琪 張, 李朝東, 王世英, 王秀伶, 邵建柱 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學