專利名稱：：鑒別川牛膝道地藥材的核苷酸序列和方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于中藥材種質(zhì)資源的鑒定
技術領域：
，特別涉及一種鑒別川牛膝道地藥材的核苷酸序列和方法。
背景技術：
：川牛膝為覓科(Amaranthaceae)杯莧屬(CyathulaBlume)植物，別名甜膝，為多年生草本植物；為著名的川產(chǎn)地道中藥桐、極常用且是重要的出口品種。1977年以后各版《中國藥典》確定川牛膝植物來源為C.officinalisKuan.(即白牛膝)。川牛膝的主要成分為生物堿和甾醇類物質(zhì)，如杯莧甾酮(cyastelone)、頭花蒽草甾酮、促脫皮甾酮、紅甾酮等，另外還有阿魏酸；現(xiàn)代研究還從川牛膝根中提取出一種生物活性多糖一一牛膝多糖(AchyranthesbidentataPolysaec-charzdesABP)。川牛膝的主要藥理作用有活血通經(jīng)、祛風濕、通利關節(jié)、利尿通淋以及對治療高血壓性心臟病和痛經(jīng)作用等。川牛膝主要分布于四川、云南和貴州，野生或栽培，生長于海拔1500米以上的地區(qū)，以四川雅安的天全、寶興、漢源和樂山地區(qū)的金口河區(qū)產(chǎn)量最大，資源十分豐富。其中，又以天全川牛膝最為有名。平時醫(yī)藥方面在使用川牛膝時經(jīng)常與懷牛膝相混淆。唐代以前古籍本草中沒有川牛膝和懷牛膝之分，總稱為牛膝。懷牛膝(A.bidentataBL.)屬于莧科(Amaranthaceae)牛膝屬(AchyranthesL)，為莧科植物牛膝(AchyranthesbidentataBL.)的根。主產(chǎn)于河南，在我國北方較流行。除懷牛膝外與川牛膝易混淆的還有土牛膝、麻牛膝、牛蒡根等。牛膝為懷牛膝的正名，川牛膝的異名，土牛膝的植物名。在天全川牛膝的栽培中，民間將川牛膝Cyathulaofficinalis(習稱"白牛膝")和頭花杯莧Cyathulacapitata(習稱"紅牛膝")兩個品種統(tǒng)稱為川牛膝，均混作川牛膝栽種和使用。同時由于白牛膝和紅牛膝長期混種，造成了這兩種植物的雜交，近年來道地產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)了雜交品種，其新鮮的根和蘆頭的表皮均呈紅色，且雜交化程度不同根的紅色深淺也不相同，該類型品種產(chǎn)量高，根條粗短，易折段，斷面菊花心不明顯，味麻，常常被誤用做川牛膝。每年有大量的紅牛膝和雜交牛膝作為川牛膝流入IJJ場，造成川牛膝藥用品質(zhì)下降，產(chǎn)業(yè)前景堪憂。近年來，國內(nèi)外對川牛膝的需求量日益增大，而作為道地產(chǎn)地川牛膝品種雜交退化，致使品質(zhì)下降。川牛膝種源質(zhì)量已成為川牛膝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。有研究表明不同種群川牛膝在形態(tài)特征、內(nèi)在質(zhì)量、產(chǎn)量及抗病性等方面都有較大差異。目前在川牛膝遺傳分化和遺傳多樣性研究方面，除采用形態(tài)及解剖學、細胞學、花粉學和植物化學等目前主要研究方法外，在分子水平上系統(tǒng)地對川牛膝種群間的遺傳背景、親緣關系的研究報道較少。20肚紀80年代以來，分子生物學技術的快速發(fā)展為遺傳多樣性檢測提供了更直接、更精確的方法，即直接檢測DNA本身的序列變化。由于避免了根據(jù)表型性來推斷基因型時可能產(chǎn)生的各種問題，DNA分析方法成為目前為止最有效的遺傳分析方法。ITS序列是中度重復序列，廣泛分布于基因組并且是同步進化的，它的堿基序列同源性的程度決定生物之間的親源關系遠近，并以此作為分類依據(jù)來劃分物種。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是針對目前存在的川牛膝品種問題，提供一種鑒別川牛膝道地藥材的核苷酸序列，從DNA水平上分析川牛膝種質(zhì)資源的遺傳特征，為區(qū)分正品川牛膝、混雜川牛膝和懷牛膝提供有效的分子標記，為川牛膝道地藥材的品種真?zhèn)舞b定和質(zhì)量優(yōu)劣鑒定、及篩選優(yōu)良品種等奠定基礎。本發(fā)明還提供了一種利用上述核苷酸序列鑒別川牛膝道地藥材的方法。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是鑒別川牛膝道地藥材的核苷酸序列，該序列為來源于正品川牛膝(白牛膝)的rDNAITS序列，具體如SEQIDNO.1所述。利用上述核苷酸序列鑒別川牛膝道地藥材的方法，收集新鮮健康的樣品材料，按照下述主要步驟進行品種鑒定工作(1)、總DNA提取收集新鮮健康的川牛膝等樣品的幼嫩葉片，采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取總DNA。改良CTAB法提取總DNA是現(xiàn)有技術中DNA提取的常用方法，多有報道；在本發(fā)明中的具體方法可按如下步驟操作①取樣、研磨稱取23g的無病健康植物幼嫩葉片，剪碎后放入研缽中，倒入液氮速凍，迅速將葉片研磨成粉末；②水浴溫浴在化凍之前將葉片粉末轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入650uL經(jīng)65'C水浴預熱的2%CTAB提取緩沖液(100腿ol/LTris-HC1，PH8.0，10mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，2%CTAB，2。/。PVP(聚乙烯吡咯垸酮)，2%f3-疏基乙醇v/v)，混勻(可猛搖幾下，使葉片粉末在緩沖液中散開)；將盛有葉片粉末混合物的1.5mL離心管在65。C水浴下溫浴12h，其間每隔10分鐘輕輕倒轉(zhuǎn)混勻，每次持續(xù)lmin左右，溫浴結束后，取出離心管冷卻至室溫；③離心、抽提在冷卻至室溫的離心管中加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1，體積比，下同)溶液，不停地倒轉(zhuǎn)混勻1015min，獲得乳濁液，6000rpm離心15min，取上清液；對上清液重復抽提l次；沉淀DNA:取上清夜轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，加入0.7倍或等體積的預冷的異丙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻，于-2(TC冷凍沉淀DNA;◎清洗DNA:挑出DNA，加入2mL75%乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，加入2mL無水乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，晾干后加入200uLTE緩沖液溶解；⑥除去RNA:加入5uLRNA酶(10tig/iiL)，37。C溫育lh;加入等體積酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)，12000rpm離心10min，取上清液，對上清液重復抽提1次，取上清液；⑦純化DNA:加入相當于上清液1/10體積NaAc(3mol/L，PH5.2)，輕輕搖勻，加入相當于上清液2倍體積的冷凍的無水乙醇，于-2(TC冷凍20-30分鐘，5000rpm離心5min，加入2mL75%乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，加入2mL無水乙醇清洗，5000rpm離心5min,倒掉溶液，晾干至無乙醇氣味，即得樣品的總DNA;加入200uLTE緩沖液充分溶解DNA，備用。TE緩沖液是指Tris-EDTAbuffer(10mMTris，lmMEDTA，pH7.4，pH7.6，pH8.0)，為常用分子生物學試劑，用于DNA的溶解等；可從市場購買。(2)PCR擴增通過大量文獻分析及試驗研究，設計出本發(fā)明中川牛膝ITS的PCR擴增引物正向引物P1、反向引物P2分別如下Pl:5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3'，位于18S上；P2:5'-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3，，位于26S上；以上述(1)步提取的總DNA為模板，進行PCR擴增反應；ITS的PCR反應體系為，每25uL中含有Mg2+25腿ol/L1.7uL，10XBuffer2.5tiL，dNTP0.2mmol/L0.2mM，模版DNA50ng/uL2ng/uL，Taq酶5U0.25liL，正反引物1Opmol/L各1uL;PCR擴增反應程序為:95。C預變性4min，95。C變性40s，52。C復性40s，72'C延伸2min，30個循環(huán)，最后72""C延伸7min，4'C保存。(3)PCR產(chǎn)物純化可采用常用的PCR產(chǎn)物純化方法進行純化；(4)DNA序列測定:對純化后的PCR產(chǎn)物直接測序，確立rDNAITS區(qū)，包括18S、5.8S和26SrDNA區(qū)的全序列。(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析運川ClustalX程序?qū)ι鲜鰷y定的rDNAITS序列進行對位排列，并輔以人工校對，以盡量減少排列所需缺失的數(shù)目，比對得到的序列用分析軟件MEGAVersion1.02進行聚類分析；與前述正品川牛膝的rDNAITS序列進行比對分析，采用比對后序列進行聚類分析，從而區(qū)分其種質(zhì)資源，達到鑒別川牛膝道地藥材的目的；為川牛膝藥材的品種鑒定和質(zhì)量優(yōu)劣鑒定、及篩選優(yōu)良品種等奠定良好的基礎。為了使測定結果盡可能準確可靠，每一個樣品可從提取總DNA、PCR擴增、產(chǎn)物純化、到測序、分析等重復進行多次。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的來源于正品川牛膝(白牛膝)的rDNAITS序列，可用于對照鑒別川牛膝道地藥材；通過從DNA水平上分析川牛膝種質(zhì)資源的遺傳特征，為區(qū)分正品川牛膝、混雜川牛膝和懷牛膝等提供了有效的分子標記，為川牛膝道地藥材的品種真?zhèn)舞b定和質(zhì)量優(yōu)劣鑒定、以及篩選優(yōu)良品種等奠定了基礎。同吋，本發(fā)明提供的利用上述核苷酸序列鑒別川牛膝道地藥材的方法，操作簡單易行，可達到方便、快速、客觀、準確區(qū)分川牛膝道地藥材與其它牛膝類藥材等目的。圖1為19個樣品材料DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。圖1中M為DNAmarkerDL2000,1、2、3、4、6、8、9、10、11、13是白牛膝樣品，7、12、14、15、16、19是紅牛膝樣品，5是雜交牛膝樣品，17、18是懷牛膝樣品。圖2為不同材料ITS序列聚類分析結果圖。圖2中1、2、3、4、6、8、9、10、11、13等白牛膝樣品聚為一類，7、12、14、15、16、19等紅牛膝樣品聚為一類，雜交牛膝樣品5單獨聚為一類，917、18兩個懷牛膝樣品聚為一類。具體實施例方式下面結合具體實施方式對木發(fā)明作進一歩的詳細描述。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。實施例本實施例測定了來自不同地區(qū)的19份川牛膝種質(zhì)資源(包括IO份白牛膝、6份紅牛膝、l份雜交牛膝及2份懷牛膝)的核糖休DNAITS序列，采用的方法包括如下具體步驟(1)、總DNA提取收集新鮮健康的川牛膝等樣品的幼嫩葉片，采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取總DNA，具體方法按如下歩驟操作①取樣、研磨稱取2g左右的無病健康植物幼嫩葉片，剪碎后放入研缽中，倒入液氮速凍，迅速將葉片研磨成粉末；②水浴溫浴在化凍之前將葉片粉末轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入650yL經(jīng)65。C水浴預熱的2%CTAB提取緩沖液(100咖ol/LTris-HCl，PH8.0，10咖ol/LEDTA，2%CTAB，2%PVP，2%0-疏基乙醇v/v)，混勻(猛搖幾下，使葉片粉末在緩沖液中散開)；將盛有葉片粉末混合物的1.5niL離心管在65。C水浴下溫浴12h，其間每隔10分鐘輕輕倒轉(zhuǎn)混勻，每次持續(xù)lmin左右，溫浴結束后，取出離心管冷卻至室溫；③離心、抽提在冷卻至室溫的離心管中加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)溶液，不停地倒轉(zhuǎn)混勻1015min，獲得乳濁液，6000rpm離心15min，取上清液；對上清液重復抽提1次；沉淀DNA:取上清夜轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，加入0.7倍或等體積的預冷的異丙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻，于-2(TC冷凍沉淀DNA;⑤清洗DNA:挑出DNA，加入2mL75%乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，加入2mL無水乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，晾干后加入適量TE溶解；⑥除去RNA:加入5uLRNA酶(10mg/mL=10ug/uL)，37。C溫育lh;加入等體積酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)，12000rpm離心10min，取上清液，對上清液重復抽提1次；⑦純化DNA:加入l/10體積NaAc(3mol/L，PH5.2)，輕輕搖勻，加入2倍體積冷凍的無水乙醇，于-2(TC冷凍2030分鐘，5000rpm離心5min，加入2mL75%乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，加入2mL無水乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，晾干至無乙醇氣味，即得樣品的總DNA;加入適量TE緩沖液充分溶解DNA，備用。取適量的總DNA溶液，用0.8%的加有Goldview的瓊脂糖電泳，在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)下檢測DNA的濃度和降解情況；用核酸-蛋白儀檢測DNA的濃度和純度(結果見下述表l)。將樣品稀釋為50ng/"l，用于PCR擴增。表1總DNA的紫外分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(2)PCR擴增通過大量文獻分析及試驗研究，設計出本發(fā)明中川牛膝ITS的PCR擴增引物P1、P2分別如下PI:5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3'，位于18S上；P2:5'-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3'，位于26S上；由上海英駿生物技術有限公司合成。用ddH20配成10pmol/L溶液待用；以上述(1)步提取的總DNA為模板，進行PCR擴增反應；ITS的PCR反應體系為，每25yL中含有Mg2+25翻1/L1.7uL，10XBuffer2.5yL，dNTP0.2mm。l/L0.2mM，模版DNA50ng/uL2ng/uL，Taq酶5U0.25yL，正反引物10pmol/L各:UL;PCR擴增反應程序為:95。C預變性4min，95。C變性40s，52。C復性40s，72。C延伸2min，30個循環(huán)，最后72。C延伸7min，4。C保存。(3)PCR產(chǎn)物純化用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，電壓為80-IOOV，時間1小時30分鐘左右，用DL2000作Marker.預期結果出現(xiàn)一條約650bp的清晰條帶；電泳完后，用小刀片把目標片段輕輕切下來(切膠的時候不能在紫外燈下照射太久，防止DNA降解)，放入干凈的EP管中；PCR產(chǎn)物純化參照TIANGEN公司的"小量膠回收試劑盒"說明書進行；具體步驟如下①小心切下電泳后瓊脂糖凝膠上的DNA目的條帶，并稱膠重；避免切下多余凝膠；放進干凈的1.5ml離心管；②加入3倍體積的溶膠液PN，5(TC水浴鍋加熱10min;如果膠塊沒有完全溶解，可適量加入溶膠液PN，直至膠完全溶解；③加入500ml平衡液(BL)到吸附柱CA2中，12000rpm，離心lmin;④當上述步驟②的溶膠液冷卻至室溫，加入經(jīng)上述步驟③處理過的吸附柱CA2中，12000rpm，離心30-60sec;⑤倒掉廢液，加入700ml漂洗液PW(使用前確認已加60ml無水乙醇)，2min⑥倒掉廢液，加入500ml漂洗液PW，12000rpm，離心30-60sec;倒掉廢液，12OOOrpm，離心2min;⑦幾分鐘后，加入一定體積的洗脫緩沖液EB(休積大于30ml)，2min后，12OOOrpm，離心2min;⑧為了提高回收的效率，重復步驟⑦；⑨電泳檢測回收的DNA(用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果，回收回來的DNA通過電泳，都應該發(fā)現(xiàn)只有一條帶)。對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測的結果在500-650bp之間，出現(xiàn)單一條帶且條帶清晰，表明樣品PCR擴增特異性較高，其電泳圖譜如圖l所示。(4)DNA序列測定:對純化后的PCR產(chǎn)物直接測序，確立rDNAITS區(qū)，包括18S、5.8S和26SrDNA區(qū)的全序列。PCR產(chǎn)物純化回收與序列測定均由深圳華大基因科技股份有限公司完成。(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析運用ClustalX程序?qū)ι鲜鰷y定的rDNAITS序列進行對位排列，并輔以人工校對，以盡量減少排列所需缺失的數(shù)目，得到的序列用分析軟件MEGA(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis)Version1.02進行聚類分析，聚類分析結果如圖2所示；為了使測定結果盡可能準確可靠，每一個樣品均從提取總DNA、PCR擴增、產(chǎn)物純化、到測序、分析等重復進行5次以上，獲得結論一致。所得白牛膝、紅牛膝、雜交牛膝和懷牛膝的rDNAITS序列分別如SEQIDNO.14所述。通過與前述正品川牛膝的rDNAITS序列進行比對分析和聚類分析，根據(jù)序列比對和聚類結果區(qū)分不同的種質(zhì)資源，達到鑒別川牛膝道地藥材品種真?zhèn)蔚饶康?。本實施例中用到的TE緩沖液(PH8.0)、溶膠液PN、平衡液(BL)、漂洗液PW、緩沖液EB等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。13序歹u表〈iio〉邪:安三九中藥材科技產(chǎn)業(yè)化有限公司〈120〉鑒別川牛膝道地藥材的核苷酸序列和方法〈160〉4<210>1<211>590<212>腿<213〉白牛膝(0^f力"7a0//7c^7sh's)〈400〉1tcgaaacctgcctagcagaatgaccagcgaacatgtttgtaccatggattggg&gggggt60gctggattgcccagtccctccctaatgccgaggggtacccccttgtttgggggtgctgct120tggcacaacaacgaaccccggcgtgttaagcgccaaggaaagtgtgctta180ttttctgctcggattttccgcgteitggatgtttgcacccaatat肪gtcatt肌atgact240ctcggcaacggatatctcggctctcgcatcgatg朋g肌cgtagcgaaatgcgatacttg300gtgtgaMtgcagaatcccgtgaaccatcgagtttttgaacgcaagttgcgcctgaagcc360ttttggccaaggcacgtctgcctgggcgtcacgcstsgcgtctttcctcaccccaagtgt420gtggtggggaaaggatgatggcctcccatatctcaccgggtgtggatggcttei肌t肌gg480agccttgggttgcaagatgccgcggcgattggtggtggtEltaatacatggccttaccttg540cgtcgtgcatcatgtagccctggtgggctcgtaggacccttg3aaacctt590〈210>2〈211〉590<212>DNA《213〉紅牛膝(6y3f力"hcspj'fafs)〈400〉2tcgaaacctgcctELgcagaaitgaccagcgaacatgtttataccaitggattggg鄉(xiāng)gggt60gct,ggattgcccagtccctccctaatgctgaggggtaccccct.tgtttgggggtgctgct120tggcacaacaacgaaccccggcgtgtt肌gcgcc肌gg犯agtgtgctta180ttttttgctcggatttccggcgcatggatgtttgcacccaataitaagtcattaaatgact240ctcggcaacggatatctcggctctcgcatcgatg肌gaacgtagcgaaat:gcgatacttg300gtgtgMt,tgcagaatcccgtg犯CC3tCgagtttttgaacgcaagttgcgcctg犯gcc360ttttggccaaggcacgtct.gcctgggcgtcacgcatagcgtctt1:cc"tcaccccaagtgt.420gtggtggggaEtEtggatgatggcctcccatatctcaccgggtgtggatggctt肌at肌gg■agccttgggttgC￡L￡lg￡ltgCcgcggcg已ttggtggtgg"Utaa^tac已"tggccttaccttg540cgtcg"tgcatcatgtagccctggt.gggctcgtaggacccttggi肌acctt590〈210〉3〈211>590〈212>腿〈213>雜交牛膝(cyw力"h)〈400〉3tcg肌acctgcctagcagaatg8CCagCg3acatgttt已taccatggattggg鄉(xiāng)gggt60gctggsttgcccagtccctccctaatgccgaggggtacccccttgtttgggggtgctgct120tggcac肌c3acgaaccccggcgtgt他gcgccaaggaacat3cac犯gagtgtgctta180ttttctgctcggattttcggcgcatggatgtttgcacccattaaatgact240ctcggcaaicggatatctxggctctcgcatcgatgaeigaacgtagcgaaatgcgatacttggtgtg肌ttgcagaatcccgtgaaccatcgagtttttgaacgc犯gttgcgcctgaagcc360ttttggccaaggcacgtctgcctgggcgtcacgcatagcgtctttcctcaccccaagtgt420gtggtgggga卿gatgatggcctcccatatctcaccgggtgtggatggcttaa^itaagg■agccttgggttgcaagatgccgcggcgaUggtggtggtatsata^catggccttaccttg540cgtcgtgcatcatgtagccctggtgggctcgtaggacccttg肌肌cctt590〈210〉4〈211〉586<212>DNA〈213〉懷牛膝(Jc力7ra/^/MA^rafs&)<400〉4tcgaaacctgcctagcagaatgaccagcgaacatgtttacatattgcatgggg郷gggt60actggcttgtccagtccctccctaatgttggggagttcccacttgattggtggtgctgcc120caacacaataacgaaccccggcgtg^Utgcgccaaggaa恥tgtgctta180tccctactcggaU1xcgggtggggatgttggcacccaatct肌gtcattaaatgactct240cggc肌cggat已tctcggctctcgcatcgatg￡t￡Lg￡l￡lCgtdgcgaa3tgcgatacttgg"t300gtg肌ttgcagaatcccgtg肌ccatcgagtttttg肌cgcaagttgcgcctgaagcctt360ttggCCMggcacgtctgcctgggagtcacgcatagcgtctctccccacctccaaagtgt420g眺ggg卿gg8卿tggCctcccatgcctcaccgggtgtggatggcct480gcctcgggatacgagatgccgcggcgaUggtggttctatacatggccttcccttgtgtc540gtgc8tcacgtagcctatggggcctcgtaggacccttaaaaacctt58權利要求1.鑒別川牛膝道地藥材的核苷酸序列，該序列為來源于白牛膝的rDNAITS序列，具體序列如下tcgaaacctgcctagcagaatgaccagcgaacatgtttgtaccatggattgggagggggtgctggattgcccagtccctccctaatgccgaggggtacccccttgtttgggggtgctgcttggcacaacaacgaaccccggcgtgttaagcgccaaggaacatacacaagagtgtgcttattttctgctcggattttccgcgtatggatgtttgcacccaatataagtcattaaatgactctcggcaacggatatctcggctctcgcatcgatgaagaacgtagcgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtttttgaacgcaagttgcgcctgaagccttttggccaaggcacgtctgcctgggcgtcacgcatagcgtctttcctcaccccaagtgtgtggtggggaaaggatgatggcctcccatatctcaccgggtgtggatggcttaaataaggagccttgggttgcaagatgccgcggcgattggtggtggtataatacatggccttaccttgcgtcgtgcatcatgtagccctggtgggctcgtaggacccttgaaaacctt。2.利用權利要求1所述的核苷酸序列鑒別川牛膝道地藥材的方法，其特征在于收集新鮮健康的樣品材料，按照下述主要步驟進行品種鑒定工作(1)、總DNA提取收集新鮮健康樣品的幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取總DNA;(2)PCR擴增利用下列引物PI:5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3，，位于18S上；P2:5'-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3'，位于26S上；以上述(1)步提取的總DNA為模板，進行PCR擴增反應；(3)PCR產(chǎn)物純化；(4)DNA序列測定以上述(3)步純化后的PCR產(chǎn)物直接測序，確立rDNAITS區(qū)，包括18S、5.8S和26SrDNA區(qū)的全序列；(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析運用ClustalX程序?qū)ι鲜鰷y定的rDNAITS序列進行對位排列，并輔以人工校對，比對得到的序列用分析軟件MEGAVersion1.02進行聚類分析，根據(jù)序列比對和聚類分析結果鑒定〗11牛膝道地藥材。3.根據(jù)權利要求2所述的鑒別川牛膝道地藥材的方法，其特征在于所述的步驟(1)的改良CTAB法包括如下具體步驟①取樣、研磨稱取23g的無病健康植物幼嫩葉片，剪碎后放入研缽中，倒入液氮速凍，迅速將葉片研磨成粉末；②水浴溫浴在化凍之前將葉片粉末轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入650uL經(jīng)65。C水浴預熱的2%CTAB提取緩沖液，混勻；將盛有葉片粉末混合物的1.5mL離心管在65"水浴下溫浴12h，其間每隔10分鐘輕輕倒轉(zhuǎn)混勻，溫浴結束后，取出離心管冷卻至室溫；③離心、抽提在冷卻至室溫的離心管中加入等體積的體積比為24:1的氯仿-異戊醇溶液，不停地倒轉(zhuǎn)混勻，獲得乳濁液，6000rpm離心15min，取上清液；對上清液重復離心、抽提1次，取上清液；沉淀DNA:取上清夜轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，加入0.7倍或等體積的預冷的異丙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻，于-2(TC冷凍沉淀DNA;清洗DNA:挑出DNA，加入2mL75%乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，加入2mL無水乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，晾干后加入200uLTE緩沖液溶解；除去RNA:加入5uL濃度為10ug/uL的RNA酶，37。C溫育lh;加入等體積的體積比為25:24:1的酚-氯仿-異戊醇，12000rpm離心10min，取上清液；對上清液重復抽提1次，取上清液；⑦純化DNA:加入相當于上清液休積1/10的NaAc，NaAc濃度為3mol/L，PH=5.2，輕輕搖勻，加入相當于上清液2倍體積的冷凍的無水乙醇，于-2(TC冷凍2030分釗'，5000rpm離心5min，倒掉溶液，加入2mL75%乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，加入2mL無水乙醇清洗，5000rpm離心5min，倒掉溶液，晾干至無乙醇氣味，即得樣品材料的總DNA;加入200"TE緩沖液充分溶解DNA，備用。4.根據(jù)權利要求2所述的鑒別川牛膝道地藥材的方法，其特征在于所述的(2)步PCR擴增的反應體系中，每25uL中含有Mg2+25mmol/L1.7uL，lOXBuffer2.5uL，dNTP0.2腿ol/L0.2mM，模版DNA50ng/uL2ng/uL，Taq酶5U0.25uL，正反引物1Opmol/L各1uL。5.根據(jù)權利要求2所述的鑒別川牛膝道地藥材的方法，其特征在于所述的(2)歩PCR擴增的反應程序為95。C預變性4min，95。C變性40s，52。C復性40s，72。C延伸2min，30個循環(huán)，最后72。C延伸7min，4"C保存。全文摘要本發(fā)明公開了一種鑒別川牛膝道地藥材的核苷酸序列，該序列為來源于正品川牛膝(白牛膝)的rDNAITS序列，可用于對照鑒別川牛膝道地藥材；通過從DNA水平上分析川牛膝種質(zhì)資源的遺傳特征，為區(qū)分正品川牛膝、混雜川牛膝和懷牛膝等提供了有效的分子標記，為川牛膝道地藥材的品種真?zhèn)舞b定和質(zhì)量優(yōu)劣鑒定、及篩選優(yōu)良品種等奠定了良好的基礎。同時，本發(fā)明提供了一種利用上述核苷酸序列鑒別川牛膝道地藥材的方法，該方法操作簡單易行，可達到方便、快速、客觀、準確區(qū)分川牛膝道地藥材與其它牛膝類藥材等目的。文檔編號C12Q1/68GK101445827SQ20081014809公開日2009年6月3日申請日期2008年12月29日優(yōu)先權日2008年12月29日發(fā)明者劉天成,莉唐,徐攀輝,巧王,田孟良,丹胡,胡瑩瑩,范巧佳,袁繼超,鄭順林申請人:雅安三九中藥材科技產(chǎn)業(yè)化有限公司