專利名稱：：一種鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法及其引物、試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，涉及一種利用微衛(wèi)星及線粒體遺傳標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)鑒定的方法及專用引物與試劑盒。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)代動(dòng)物生產(chǎn)和育種中，要利用各種親屬的表型信息確定準(zhǔn)確的遺傳系譜并通過(guò)正確的系譜了解種公畜的育種價(jià)值，以此來(lái)確定個(gè)體選留及避免個(gè)體近親繁殖。大規(guī)模聯(lián)合育種工作的開展以及BLUP技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得系譜信息在育種中的影響越來(lái)越大。因系譜信息錯(cuò)誤產(chǎn)生的誤差會(huì)在整個(gè)選育過(guò)程中被逐級(jí)的放大，并極有可能造成群體的大規(guī)模近交，導(dǎo)致種群退化，從而導(dǎo)致育種過(guò)程中不可挽回的重大損失。因此，在家畜育種中應(yīng)用親權(quán)鑒定技術(shù)鑒別個(gè)體身份，修正錯(cuò)誤系譜信息有著極為重要的意義。親權(quán)鑒定是明確個(gè)體間親緣關(guān)系、建立正確譜系的重要輔助手段，親權(quán)鑒定主要包括以下幾個(gè)方面?zhèn)€體生父的確定，個(gè)體生母的確定，個(gè)體生父生母的確定，生父、生母后代的確定，爺孫關(guān)系的確認(rèn)(即隔代鑒定)等。親權(quán)鑒定方法按材料不同可以分為很多種，如利用表型標(biāo)記、系譜記錄、血型、蛋白質(zhì)多態(tài)、同工酶、在DNA分子水平進(jìn)行鑒定等。在DNA水平上大致可以分為以下幾種DNA指紋技術(shù)、MVR-PCR技術(shù)、STR分型技術(shù)(微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù))、mtDNA分型(線粒體DNA技術(shù))、MHC分型、性染色體鑒定。在眾多DNA分子標(biāo)記中，微衛(wèi)星標(biāo)記是目前應(yīng)用最為廣泛的一種。微衛(wèi)星是指一類由1-6個(gè)核苷酸組成的短序列首尾相連重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA，廣泛分布于真核生物基因組中；微衛(wèi)星標(biāo)記由核心序列和兩側(cè)保守的側(cè)翼序列構(gòu)成。與其他DNA分子標(biāo)記相比，微衛(wèi)星標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)數(shù)量巨大、分布廣泛、均勻，可以代表整個(gè)基因組提供大量信息；高度多態(tài)、信息含量豐富、鑒定準(zhǔn)確率高，微衛(wèi)星多態(tài)信息含量(PIC)可高達(dá)0.7以上(當(dāng)PIC值大于0.5時(shí)該座位即被認(rèn)為是高度多態(tài)座位，而血液蛋白標(biāo)記則在O.l左右，RFLP在O.2左右)，多個(gè)微衛(wèi)星基因座聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，個(gè)體識(shí)別機(jī)率和非父排除率很高；突變率低、具有保守性，微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性以及物種間某些染色體區(qū)段的共顯性，使微衛(wèi)星引物具有一定的通用性，可在一定程度上降低研究成本；檢測(cè)需要的DNA數(shù)量較少、純度要求不高，檢測(cè)樣品來(lái)源廣泛，可通過(guò)PCR迅速擴(kuò)增，重復(fù)性好，靈敏度高；遵循孟德爾遺傳法則，呈共顯性遺傳，能很好地區(qū)分純合子與雜合子。由于具有上述優(yōu)點(diǎn)，微衛(wèi)星標(biāo)記被廣泛地應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、遺傳關(guān)系分析、品種鑒定等領(lǐng)域，已經(jīng)成為國(guó)際上主流的標(biāo)記技術(shù)之一。然而目前還未有用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行中國(guó)水牛單親親權(quán)關(guān)系鑒定方法的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行單親親權(quán)鑒定的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種利用微衛(wèi)星及線粒體遺傳標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)鑒定的方法。本發(fā)明還提供了上述親權(quán)鑒定方法的專用引物與試劑盒。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的采用以下技術(shù)方案一種鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法，包括以下步驟(1)從普通牛種微衛(wèi)星標(biāo)記中，篩選出多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物；(2)以待檢水?；蚪MDNA為模板，在篩選出的微衛(wèi)星引物的引導(dǎo)下進(jìn)行25pL反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增；(3)對(duì)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；(4)根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果判斷每個(gè)個(gè)體的基因型，根據(jù)基因型計(jì)算單親親權(quán)指數(shù)PI值、并根據(jù)PI值計(jì)算出親子相對(duì)概率值W值，當(dāng)W值大于或等于99.73%時(shí)，則認(rèn)定假設(shè)親代與子代個(gè)體有親生關(guān)系，當(dāng)W值小于99.73。/。時(shí)，則可以認(rèn)為假設(shè)親代與子代個(gè)體不具有親生關(guān)系。上述微衛(wèi)星引物包括以下引物-由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物ETH225;由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物BM1818;由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物INRA035;由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物BM2113;由序列表中序列9和序列10的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物TGLA227;由序列表中序列11和序列12的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物CSRM60;由序列表中序列13和序列14的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物麗2934;由序列表中序列15和序列16的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物麗1862。所述PCR擴(kuò)增的25yL反應(yīng)體系包括DNA模板1.25ng，10XPCR擴(kuò)增緩沖液2.50uL，25腿ol/L的MgClJ.50uL，2.5隨1/L的dNTPs1.00uL，5U/pL的^yra^DNA聚合酶0.50pL，20pmo1/uL的上游引物0.50pL，20pmol/uL的下游引物0.50iiL，加滅菌蒸餾水，使反應(yīng)體系補(bǔ)足25.00uL。所述25"L反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為9fC預(yù)變性5min;94。C變性30s，50-65。C退火30s，72。C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。當(dāng)基因組DNA的提取、引物的合成、&r邵DNA聚合酶、dNTPs試劑來(lái)自不同的批次時(shí)，反應(yīng)條件，包括退火溫度等都會(huì)發(fā)生一定的變化。所以在每次進(jìn)行大批量PCR前，都要選擇少量樣本進(jìn)行溫度梯度、引物濃度梯度PCR，進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增效果，以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。為了提高鑒定的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和靈敏度，本發(fā)明的鑒定方法還可以包括以下步驟由序列表中序列17、序列18及序列19、序列20組成線粒體D-Loop區(qū)引物，以待檢水牛基因組DNA為模板，對(duì)線粒體基因片段進(jìn)行50uL反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增，對(duì)線粒體PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化，利用雙脫氧終止法對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，用DNAman軟件分析待檢樣品的DNA序列一致率，若線粒體DNA序列完全一致，則說(shuō)明待檢樣品間存在親緣關(guān)系。所述PCR擴(kuò)增的50uL反應(yīng)體系包括DNA模板2.5ng，10XPCR緩沖液5UL，25mmol/L的MgCl23uL，2.5腿ol/L的dNTPs4uL，5U/uL的j^ra《DNA聚合酶O.50uL，20pmol/pL的上游引物luL,20pmo1/uL的下游引物1uL，加滅菌蒸餾水，使反應(yīng)體系補(bǔ)足50.00iiL。所述50pL反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性5min;94'C變性lmin，55。C退火lmin，72"C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。本發(fā)明還根據(jù)上述設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星引物和線粒體D-Loop區(qū)引物制備了對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)關(guān)系鑒定的快速檢測(cè)試劑盒，除了所含的上述引物外，本發(fā)明的進(jìn)行親權(quán)關(guān)系鑒定的快速檢測(cè)試劑盒還包括以下試劑fz&。DNA聚合酶、10XPCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、無(wú)菌水、IOX凝膠上樣緩沖液、0.5ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、2mg/ml蛋白酶K、10%的SDS、飽和酚、氯仿、異戊醇、70%乙醇、無(wú)水乙醇、TE溶液、30%聚丙烯酰胺溶液、5XTBE電泳緩沖液、10%過(guò)硫酸銨溶液、NWNN-四甲基乙二胺、含10%乙醇、0.5%冰乙酸的固定液、1%硝酸溶液、0.2%硝酸銀溶液、含1.5%氫氧化鈉、0.4%甲醛的顯色液、0.75%碳酸鈉溶液、分子量標(biāo)準(zhǔn)物pUC18DNA/MspI、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，核酸染料、6X凝膠上樣緩沖液；所述各種溶液的溶劑均為水。本發(fā)明提供了一種利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)水牛的單親親權(quán)關(guān)系進(jìn)行鑒定的方法，本發(fā)明的鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法包括從普通牛種微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選出多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物；以待檢水?；蚪MDNA為模板，在篩選出的微衛(wèi)星引物的引導(dǎo)下進(jìn)行25ixL反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增；對(duì)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果判斷每個(gè)個(gè)體的基因型，根據(jù)基因型計(jì)算單親親權(quán)指數(shù)PI值、親子相對(duì)概率值W值，根據(jù)W值判斷親權(quán)關(guān)系是否存在。上述微衛(wèi)星引物是參照GenBank，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選試驗(yàn)，從英國(guó)羅斯林研究所推薦的普通牛種微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選出的多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物。本發(fā)明的鑒定方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確度高。采用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行親權(quán)關(guān)系鑒定雖然具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，但由于在減數(shù)分裂過(guò)程中可能發(fā)生連鎖互換、染色體重組，從而使得微衛(wèi)星位點(diǎn)在群體中基因頻率和基因型頻率發(fā)生改變，導(dǎo)致用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行親權(quán)鑒定的精確度受到影響；同時(shí)微衛(wèi)星標(biāo)記在親子鑒定中對(duì)假設(shè)親本的排除率還會(huì)受到被測(cè)標(biāo)記等位基因數(shù)目的影響，所用等位基因位點(diǎn)越多，具有同一性狀的兩個(gè)個(gè)體相同的概率越小，其檢出率也越大。選用多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)可以提高微衛(wèi)星進(jìn)行親子鑒定的精確度，但同時(shí)也會(huì)增加鑒定成本，加大工作量。為了進(jìn)一步提高鑒定的精確度、降低鑒定成本，本發(fā)明在微衛(wèi)星標(biāo)記的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提供了利用線粒體遺傳標(biāo)記對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)鑒定的方法。粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)存在于細(xì)胞質(zhì)中，是唯一的核外基因組DNA。mtDNA呈閉環(huán)雙鏈結(jié)構(gòu)，由16569bp組成，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。mtDNA的編碼區(qū)含有37個(gè)編碼基因，非編碼區(qū)由1125bp組成，包括一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)及置換環(huán)(dispiacementloopregion,D-環(huán)區(qū))，其中D-環(huán)區(qū)及復(fù)制起點(diǎn)附近的16024-16365nt及73-340nt兩個(gè)區(qū)域?yàn)槎鄳B(tài)性高發(fā)區(qū)，也是mtDNA應(yīng)用于親權(quán)鑒定的理想位點(diǎn)。由于線粒體是以母系遺傳方式遺傳，不會(huì)受到染色體重組的影響，可彌補(bǔ)微衛(wèi)星因發(fā)生重組影響基因頻率、基因型頻率，最終導(dǎo)致鑒定率降低的不足。本發(fā)明將微衛(wèi)星與線粒體遺傳標(biāo)記兩種方法相結(jié)合，從不同的角度進(jìn)行鑒定，且鑒定結(jié)果一致，提高了親權(quán)鑒定的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、靈敏度，使鑒定范圍更廣、樣品要求更低。線粒體DNA拷貝數(shù)多，每個(gè)細(xì)胞平均含有10-1000個(gè)線粒體，多數(shù)線粒體內(nèi)含有多拷貝的mtDNA，是其他核基因拷貝數(shù)的10倍左右，因此對(duì)mtDNA的檢測(cè)比nDNA具有更高的檢出率。mtDNA序列的高度多態(tài)性使得檢測(cè)的靈敏度高，對(duì)樣本需求量低，僅需pg水平的量。本發(fā)明提供的鑒定方法簡(jiǎn)單、快捷、費(fèi)用低廉，準(zhǔn)確度高(可達(dá)99.96%)，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的直接檢測(cè)。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法開發(fā)出相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，用于中國(guó)水牛的親權(quán)鑒定，該試劑盒使用簡(jiǎn)便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的需要，且檢測(cè)結(jié)果可靠、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，為牛的育種工作提供了便利。本發(fā)明將在中國(guó)水牛親權(quán)鑒定及優(yōu)良牛的分子選育中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明的中國(guó)水牛親權(quán)關(guān)系鑒定快速檢測(cè)試劑盒能夠在24小時(shí)之內(nèi)完成中國(guó)水牛的親權(quán)關(guān)系鑒定，精確度達(dá)99.96%。同時(shí)，本發(fā)明也將對(duì)其他親權(quán)關(guān)系的鑒定起到積極的作用。圖1為微衛(wèi)星位點(diǎn)ETH225PC財(cái)廣增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖2為微衛(wèi)星位點(diǎn)BM2113PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的8Q/^聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖3為微衛(wèi)星位點(diǎn)CSRM60PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖4為微衛(wèi)星位點(diǎn)BM1862PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖5為微衛(wèi)星位點(diǎn)BM1818PC財(cái)廣增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖6為微衛(wèi)星位點(diǎn)INRA035PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的8。^聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖7為微衛(wèi)星位點(diǎn)TGLA227PC財(cái)廣增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖8為微衛(wèi)星位點(diǎn)BM2934PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖9為微衛(wèi)星位點(diǎn)ETH225等位基因標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖10為微衛(wèi)星位點(diǎn)BM2113等位基因標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖11為微衛(wèi)星位點(diǎn)CS脂60等位基因標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖12為微衛(wèi)星位點(diǎn)麗1862等位基因標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的8%聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖13為微衛(wèi)星位點(diǎn)BM1818等位基因標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖14為微衛(wèi)星位點(diǎn)頂RA035等位基因標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖15為微衛(wèi)星位點(diǎn)TGLA227等位基因標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖16為微衛(wèi)星位點(diǎn)BM2934等位基因標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的8X聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果。圖17為線粒體的D-Loop區(qū)PC財(cái)廣增產(chǎn)物的l^瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。圖18為中國(guó)水牛m、cl和c2的線粒體D-Loop區(qū)序列比較結(jié)果。圖中標(biāo)記圖1-8中，阿拉伯?dāng)?shù)字19表示不同的泳道，各個(gè)泳道為不同個(gè)體；M表示pUC18DNA/MspI分子量標(biāo)記；英文小寫字母ag表示不同的等位基因型。圖9_17中，m表示母親；cl表示后代；c2表示嫌疑后代；M和Marker表示pUC18DNA/MspI分子量標(biāo)記；英文小寫字母ag表示不同的等位基因型。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用引物合成由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司完成。實(shí)施例l、用于對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記及線粒體弓l物的篩選一、引物設(shè)計(jì)參照GenBank，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選試驗(yàn)，從英國(guó)羅斯林研究所推薦的普通牛種微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選出的多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物，篩選出的微衛(wèi)星引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)普通牛mtDNA的D-Loop區(qū)設(shè)計(jì)引物，為方便測(cè)序并設(shè)計(jì)了內(nèi)引物，引物序列見(jiàn)表2，引物由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為900bp左右。表l選取的STR基因座8個(gè)微衛(wèi)星基因座及其引物序列表2選取的mtDNA的D-Lo叩區(qū)引物序列基因座序列名稱引物類型引物序列_堿基數(shù)量(bp)序列17正鏈引物5，-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3'20mtDNA序列18反鏈引物5，-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'17D-Loop區(qū)序列19正鏈內(nèi)引物5，-AGGCATCTGGTTCTTTCTTC-3，20_序列20反鏈內(nèi)引物5，-ATTAGCCATTAGTCCATC-3，_18二、微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型檢測(cè)用步驟一獲得的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)在中國(guó)四川西昌農(nóng)戶家采集1頭母牛、1頭已知為該母牛后代和另1頭嫌疑為該母牛后代的中國(guó)水牛的血液樣本及另外隨機(jī)采集32頭中國(guó)水牛共計(jì)35頭中國(guó)水牛進(jìn)行微衛(wèi)星基因型檢測(cè)。10基因座ETH225BM1818IN訓(xùn)35證113TGLA227CSRM60BM2934BM1862引物序列堿基數(shù)量(bp)5'-GATCACCTTGCCACTATTTCCT-3'225'-ACATGACAGCCAGCTGCTACT-3'215'-AGCTGGGAATATAACCAAAGG-3z215'-AGTGCTTTCAAGGTCCATGC-3'205'-ATCCTTTGCAGCCTCCACATTG-3'225,—TTGTGCTTTATGACACTATCCG_3'225'-GCTGCCTTCTACCAAATACCC-3'215'-CTTCCTGAGAGAAGCAACACC-3'215'-CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT-3'255'-ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA-3'245'-AAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCA-3'245'-AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG-3'245'-CCAATGTCTTCCTAGCTCTTC-3'215'-CTGTTAGTTCTGCCAAAATCCC-3'225'-AAGCAAAAAGGCTGATGGC-3'195'-TTGCAGATACTGGCAAGTGG-3'20口ln123456789o2356,列列列列列列列列列列列列列列列列，序序序序序序序序序序序序序序序序1、PCR擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)(薩姆布魯克丄弗時(shí)奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第2版.金冬雁，黎孟楓譯.北京科學(xué)出版社，1998，465-467.)中描述的DNA提取方法，提取上述水牛血液的基因組DNA，(基因組DNA還可以從組織樣品、如耳組織，或含有毛囊的牛毛樣品中提取)，以此基因組DNA為模板，分別在篩選出的8對(duì)微衛(wèi)星引物的引導(dǎo)下利用梯度PCR儀進(jìn)行25"L反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增。所述25yL反應(yīng)體系包括DNA模板1.25ng，10XPCR緩沖液2.50uL，25咖ol/L的MgCl21.50uL，2.5腿ol/L的dNTPs1.00uL，5U/uL的ExTaqDNA聚合酶0.50pL，20pmo1/uL的上游引物0.50uL，20pmo1/uL的下游引物0.50PL，加滅菌蒸餾水，使反應(yīng)體系補(bǔ)足25.00uL。所述上游引物指的是序列表中序列1、3、5、7、9、11、13、15的核苷酸序列組成的引物，下游因物指的是序列表中序列2、4、6、8、10、12、14、16的核苷酸序列組成的引物。所述25uL反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94""C預(yù)變性5min;94。C變性30s，50-65。C退火30s，72。C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。2、聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)各引物對(duì)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，具體過(guò)程包括以下步驟-①充分清洗電泳玻片和間隔片，烘干后密封安裝，按照表3給定的配膠比例配制凝膠，混勻后立即灌裝膠板，灌滿膠板后插入梳子，均需注意避免產(chǎn)生氣泡；②室溫凝膠聚合30min后，將梳子拔除，用移液器吸取電泳緩沖液沖洗加樣孔。將聚合完畢的膠放回電泳槽，用配膠同批次的5XTBE配制1XTBE電泳緩沖液注滿電泳槽，并將電泳槽底部氣泡排除；③取PCR產(chǎn)物3uL，按照2:1的比例混合IOX凝膠上樣緩沖液(PCR產(chǎn)物10X凝膠上樣緩沖液二2:1，體積比)，冰浴5分鐘，在80v的電壓下電泳100分鐘，此時(shí)IOX凝膠上樣緩沖液中的藍(lán)色二甲苯氰剛好移動(dòng)到膠板底部；④從電泳槽中取出膠板，取下凝膠放入固定液(10%乙醇，0.5°/。冰乙酸)，振蕩儀上固定6分鐘/次，重復(fù)一次；取出凝膠放入1%硝酸溶液中硝化2分鐘后轉(zhuǎn)入0.2%硝酸銀溶液中閉光染色12分鐘；染色完畢后用蒸餾水充分漂洗3次，每次2分鐘；漂洗后放入預(yù)冷的顯色液(1.5%氫氧化鈉，0.4%甲醛)中顯色15分鐘；顯色后放入0.75。/。的碳酸鈉溶液中終止顯色；⑤在GELD0C2000凝膠成像系統(tǒng)下采用白光掃描圖象，儲(chǔ)存分析；⑥電泳數(shù)據(jù)經(jīng)QuantityOne軟件處理后得到檢測(cè)片段大小。表38。/。PAGE凝膠的配方5102040ddH202.635.2510.521.0Acrylamide(30%)1.332.655.310.65XTBE1.02.04.08.0APS(uL)70707070TEMED(uL)101010108個(gè)微衛(wèi)星基因標(biāo)記ETH225、BM1818、INRA035、BM2113、TGLA227、CSRM60、BM2934、BM1862的8。/。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1-8所示，圖中M為pUC18DNA/MspI、其余泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物在67-400bp之間，本發(fā)明專利申請(qǐng)篩選的8個(gè)位點(diǎn)中最多的等位基因?yàn)?個(gè)，最少的為4個(gè)。三、微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多態(tài)性分析1、等位基因、等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)統(tǒng)計(jì)向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量的上樣緩沖液，在1.5%瓊脂糖凝膠上80V、35min電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，如有所需的條帶呈現(xiàn)多態(tài)現(xiàn)象，可以用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)銀染后用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。由于微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，其表現(xiàn)型可以直接反映基因型。因此，根據(jù)電泳結(jié)果可以直接判斷出每一個(gè)個(gè)體的基因型，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單計(jì)算可以得出各微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因頻率。有效等位基因數(shù)反映等位基因間的相互影響，是衡量基因純合度的另一指標(biāo)。它表明等位基因在群體中分布的均勻程度，等位基因分布越均勻，有效等位基因數(shù)越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)。7Ve=1/1戶'其中i為第i個(gè)等位基因，Pi為等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。將各微衛(wèi)星基因座PCR產(chǎn)物與pUC18DNA/MspI的各條帶大小進(jìn)行比較、判定全部個(gè)體各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因的大小，按由大到小的順序分別依次命名為a、b、c等，具體擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表4。中國(guó)水牛在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因頻率見(jiàn)表5。由表4可知，8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上共擴(kuò)增出47個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)上的等位基因數(shù)為5.875個(gè)，其中，BM1818、INRA035、BM1862位點(diǎn)等位基因最多，有7個(gè)，ETH225位點(diǎn)等位基因最少，有4個(gè)。由表5可知，ETH225位點(diǎn)按序列由大到小有a、b、c、d四個(gè)等位基因，其中d的出現(xiàn)頻率最大，為0.4915，c的出現(xiàn)頻率最小，為0.1186。BM2113位點(diǎn)按序列由大到小有a、b、c、d、e、f六個(gè)等位基因，其中c的出現(xiàn)頻率最大，為0.2462，a的出現(xiàn)頻率最小，為0.0769。CS脂60位點(diǎn)按序列由大到小有a、b、c、d、e、f六個(gè)等位基因，其中d的出現(xiàn)頻率最大，為0.2698，f的出現(xiàn)頻率最小，為0.0794。BM1862位點(diǎn)按序列由大到小有a、b、c、d、e、f、g七個(gè)等位基因，其中a的出現(xiàn)頻率最大，為0.2449，g的出現(xiàn)頻率最小，為0.0612。BM1818位點(diǎn)按序列由大到小有a、b、c、d、e、f、g七個(gè)等位基因，其中b的出現(xiàn)頻率最大，為0.1846，g的出現(xiàn)頻率最小，為0.0923。INRA035位點(diǎn)按序列由大到小有a、b、c、d、e、f、g七個(gè)等位基因，其中c的出現(xiàn)頻率最大，為0.2344，g的出現(xiàn)頻率最小，為0.0781。TGLA227位點(diǎn)按序列由大到小有a、b、c、d、e五個(gè)等位基因，其中c的出現(xiàn)頻率最大，為0.3333，a的出現(xiàn)頻率最小，為0.1228。BM2934位點(diǎn)按序列由大到小有a、b、c、d、e五個(gè)等位基因，其中d的出現(xiàn)頻率最大，為0.3167，c的出現(xiàn)頻率最小，為0.1333。8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)見(jiàn)表6。有效等位基因數(shù)是基因一致度的倒數(shù)，反映了等位基因間的相互影響。它與平均雜合度和多態(tài)信息含量一樣，可用來(lái)測(cè)度群體的遺傳多態(tài)性。由表6可以得出8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的有效等位基因數(shù)為27個(gè)。平均有效等位基因數(shù)為5.15。在BM1818位點(diǎn)上的有效等位基因數(shù)最多為6.76個(gè)。在ETH225位點(diǎn)上的有效等位基因數(shù)最少為2.98個(gè)。表4各微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增的多態(tài)情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>_表58個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在中國(guó)水牛中的等位基因頻率_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>_表68個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在中國(guó)水牛的有效等位基因數(shù)_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2、群體雜合度合多態(tài)信息含量群體雜合度(Heterozygosity)表示群體某一特定基因位點(diǎn)上雜合子的比例，反映群體遺傳變異程度的大小。//e=1-它尸,2,=1其中i為第i個(gè)等位基因，Pi為等位基因頻率，n某一位點(diǎn)的為等位基因數(shù)。選擇做親權(quán)鑒定的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記應(yīng)滿足以下條件①具有較高的多態(tài)信息含量(PI〉0.7)和雜合度(He〉0.9)等位基因數(shù)豐富，由10-12各等位基因最佳；②擴(kuò)增長(zhǎng)度在400bp—下；③微衛(wèi)星標(biāo)記位于不同的染色體上，或各標(biāo)記之間沒(méi)有連鎖，標(biāo)記之間的距離大于40cM;④沒(méi)有"啞等位基因"，標(biāo)記具有種屬特異性；⑤重復(fù)性好，PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的群體雜合度見(jiàn)表7。群體雜合度表示被檢測(cè)位點(diǎn)在該群體中的雜合子頻率，它是遺傳標(biāo)記多態(tài)性和被檢測(cè)群體雜合度的度量單位。在本研究8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，BM1818位點(diǎn)的雜合度最大為0.8521，ETH225位點(diǎn)最小為0.6648。該群體的平均雜合度為0.7943。表78個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在中國(guó)水牛的雜合度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>多態(tài)信息含量(Polymorphisminformationcontent,PIC)用于對(duì)豐示i己基因多態(tài)性的估計(jì)。PIO0.5為高度多態(tài)；0.25<PIC<0.5為中度多態(tài)；PIC<0.25為低度多態(tài)。P/C=1—《尸,2)—(2X2戶，/)I=〗/=Z+1其中i，j為第i，j個(gè)等位基因；h和P,分別為第i和第j個(gè)等位基因的頻率；n為等位基因數(shù)。8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量見(jiàn)表8。多態(tài)信息含量是衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的指標(biāo)，當(dāng)PIC〉0.5時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.25〈PIC〈0.5時(shí)，為中度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)PIC〈0.25時(shí)，為低度多態(tài)位點(diǎn)。在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上，BM1818的多態(tài)信息含量最大，為0.8462，而ETH225的多態(tài)信息含量最小，為0.6574，8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量為0.7841，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。由表8可知，PIC隱25二0.6547>0.5，PIC腕咖二O.8462〉0.5，PIC麗腦二O.8344〉0.5,PIC證u^0.8006〉0.5，PICTGLA227=0.7515〉0.5，PIQ;SK,=0.7995〉0.5，PICBM2934=0.7666>0.5，PICBM1862=0.8191>0.5。因此，每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIO0.5，都具有高度多態(tài)性。所以選用這8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行單親親權(quán)鑒定的鑒別力較高。表88個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在中國(guó)水牛的多態(tài)信息含量<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例2、用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)鑒定本實(shí)施例鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法，包括以下歩驟從普通牛種微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選出多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物；以待檢測(cè)水?；蚪MDNA為模板，在篩選出的8個(gè)微衛(wèi)星引物的引導(dǎo)下，對(duì)在中國(guó)四川西昌農(nóng)戶家采集1頭母牛(m)、1頭已知為該母牛后代cl和另1頭嫌疑為該母牛后代c2的中國(guó)水牛的血液樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增;對(duì)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果判斷每個(gè)個(gè)體的基因型，根據(jù)基因型計(jì)算單親親權(quán)指數(shù)PI值、親子相對(duì)概率值W值，根據(jù)W值判斷親權(quán)關(guān)系是否存在。PCR擴(kuò)增方法、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法同實(shí)施例1。單親親權(quán)指數(shù)(PI)和親子關(guān)系相對(duì)概率(W)的計(jì)算根據(jù)中國(guó)水牛等位基因頻率分布(如表5)和親權(quán)指數(shù)計(jì)算公式(如表9)，計(jì)算出后代cl和該母牛(m)的PI值(表IO)和W值。CPI二PIETH225XPIbM18L8乂PIlNRA035乂PIbM2113xpicsrm60XPIbM2934乂PIbM1862乂PItGLA227=2537.2227W=[累計(jì)PI值/(累計(jì)PI值+l)]X100%=99.9606%_表9單親親子鑒定各種遺傳組合親權(quán)指數(shù)計(jì)算公式__§^_嫌疑子代_^_1AAAA1/P2AAAiAj(i^j)1/2Pi3A人(W)AA1/2Pi4AiAj(i半j)AiAj(i^j)1/4Pi+l/4Pj5AiAj(i^j)AiAk(k共i'j)1/4Pi注:Pi是第i個(gè)等位基因頻率；Pj是第j個(gè)等位基因頻率在3份待判定親權(quán)關(guān)系的中國(guó)水牛中，在BM2934位點(diǎn)上m、cl和c2均有相同的等位基因a和d;在麗1862位點(diǎn)上m和cl均有相同的等位基因b和f，而c2則有等位基因a和e;ETH225位點(diǎn)上m、cl和c2均有相同的等位基因a和d;在BM1818位點(diǎn)上m和cl均有相同的等位基因a和e，而c2則有等位基因b和f;在INRA035位點(diǎn)上m有等位基因a和c，cl有等位基因c和e，而c2有等位基因b和d;在BM2113位點(diǎn)上m、cl和c2均有相同的等位基因c和f;在CSRM60位點(diǎn)上m、cl和c2均有相同的等位基因b和d;在TGLA227位點(diǎn)上m和cl均有相同的等位基因d，而c2則有等位基因c和d(見(jiàn)圖9圖16)?；蚍中鸵?jiàn)表11。從表11可以得出子代與親本等位基因比較結(jié)果(表12)。由此可見(jiàn)嫌疑后代c2與該母牛(m)有3個(gè)STR基因座遺傳違背孟德爾遺傳規(guī)律，所以該嫌疑后代c2與該母牛(m)排除親生關(guān)系。而后代cl與該母牛(m)的8個(gè)STR基因座遺傳都遵循孟德爾遺傳規(guī)律。表IO8個(gè)STR基因座的PI值基因座mclPI計(jì)算公式PIETH225a/da/dl/4Pa+l/4Pd1.5622BM1818a/ea/el/4Pa+l/4Pe3.2500頂RA035a7cc/e1Z4PC1.0667國(guó)113c/fc/fl/4Pc+l/4Pf3.3370CSRM60bZdb/dl/4Pb+l/4Pd2.3583BM2934a/da/dl/4Pa+l/4Pd3.1667BM1862b/fb/fl/4Pb+l/4Pf4.2875TGLA227dd1/Pd4.3846注:m為來(lái)自于母親的等位基因；cl為來(lái)自于孩子的等位基因。表118個(gè)STR基因座的基因分型基因座mclc2ETH225a/da/da/d隨818a/ea/eb/fINRA035a/cc/eb/dBM2113c/fc/fc/fCSRM60b/db/db/dBM2934a/da/da/dBM1862b/fb/fa/eTGLA227ddc/d注m為來(lái)自于母親的等位基因；cl、c2為來(lái)自于孩子的等位基因表12子代與親本等位基因結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注:m為來(lái)自于母親的等位基因；cl、c2為來(lái)自于孩子的等位基因；"+"表示具有該等位基因；"-"表示不具有該等位基因。實(shí)施例3用微衛(wèi)星標(biāo)記及線粒體遺傳標(biāo)記對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)鑒定微衛(wèi)星標(biāo)記親權(quán)鑒定方法同實(shí)施例2。線粒體遺傳標(biāo)記對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)鑒定包括以下歩驟根據(jù)普通牛mtDNA的D-Loop區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表2;以待檢測(cè)水?；蚪MDNA為模板，在線粒體引物的引導(dǎo)下，對(duì)在中國(guó)四川西昌農(nóng)戶家采集l頭母牛、l頭已知為該母牛后代和另1頭嫌疑為該母牛后代的水牛的血液樣本進(jìn)行50PL反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增，對(duì)線粒體PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化，利用雙脫氧終止法對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，用DNAman軟件分析測(cè)序結(jié)果并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。1、PCR擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)(薩姆布魯克J，弗時(shí)奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第2版.金冬雁，黎孟楓譯.北京科學(xué)出版社，1998，465-467.)中描述的DNA提取方法，提取上述水牛血液的基因組DNA，(基因組DNA還可以從組織樣品、如耳組織，或含有毛囊的牛毛樣品中提取)，而后以此基因?yàn)槟０?，進(jìn)行50PL反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，取3ul進(jìn)樣，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，在65V電壓下電泳60min后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像(見(jiàn)圖17)。對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000，所擴(kuò)增的特異性帶出現(xiàn)在約900bp處，擴(kuò)增的目的條帶單一，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增條帶，效果理想。所述PCR擴(kuò)增的50uL反應(yīng)體系包括DNA模板2.5ng，10XPCR緩沖液5uL，25mmol/L的MgCl23uL，2.5mmol/L的dNTPMix4uL，5U/uL的7ag0.50tiL，20pmol/yL的上游引物luL，20pmo1/uL的下游引物1uL，加滅菌蒸餾水，使反應(yīng)體系補(bǔ)足50.00ixL。所述上游引物指的是序列表中序列17、19的核苷酸序列組成的引物，下游因物指的是序列表中序列18、20的核苷酸序列組成的引物。所述50iiL反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94"C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。2、PCR產(chǎn)物純化及序列測(cè)定將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交金杰生物公司，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化產(chǎn)物，利用雙脫氧終止法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)序列表21-23，序列表21為中國(guó)水牛12號(hào)(母本)的D-Loop序列，序列表22為中國(guó)水牛13號(hào)(后代cl)的D-Loop序列，序列表23為中國(guó)水牛25號(hào)(后代c2)的D-Lo叩序列，表明12號(hào)(即m)和13號(hào)(即cl)為890bp，25號(hào)(即c2)為892bp，與NCBI上的序列比較分析發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與預(yù)計(jì)結(jié)果一致。3、線粒體DNA的D-Loop區(qū)序列分析線粒體DNA在人類和動(dòng)物的線粒體序列中都有一個(gè)區(qū)域叫D-Loop區(qū)，具有很高的多態(tài)性，且成單倍型母系遺傳。據(jù)報(bào)道在對(duì)人類線粒體DNA的D-Loop區(qū)的測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)了400多個(gè)變異。與DNA指紋技術(shù)、STR分型相比，對(duì)線粒體DNA的D-Loop進(jìn)行測(cè)序可有更高的靈敏度，產(chǎn)生等位基因更多，因此更容易對(duì)個(gè)體進(jìn)行分析。但由于線粒體DNA是母系遺傳，所以可以通過(guò)對(duì)線粒體DNA的D-Loop區(qū)測(cè)序來(lái)區(qū)分母系的單親親權(quán)鑒定。由序列表21-23及圖18可知后代13號(hào)(即cl)與該母牛12號(hào)(即m)序列一致。嫌疑后代25號(hào)(即c2)與該母牛12號(hào)(即m)在212、314、416上分別有3次T/C轉(zhuǎn)換，在275、285上分別有2次G/A和在795上有1次A/G轉(zhuǎn)換。嫌疑后代25號(hào)(即c2)分別在178和744位插入A和C堿基。所以，后代13號(hào)(即cl)與該母牛12號(hào)(即m)是來(lái)源于同一個(gè)母系的個(gè)體而嫌疑后代25號(hào)(即c2)與該母牛12號(hào)(即m)是來(lái)源于不同母系的個(gè)體。本發(fā)明結(jié)果表明m(即12)和cl(即13)的線粒體DNA的D-Lo叩區(qū)的堿基數(shù)為890bp，c2(即25)的線粒體DNA的D-環(huán)的堿基數(shù)為892bp。由此結(jié)果可知，具有親緣關(guān)系的m和cl測(cè)序的結(jié)果堿基數(shù)完全相同，而嫌疑后代c2比母牛m多出了2個(gè)堿基。4、待檢樣本親權(quán)關(guān)系認(rèn)證本發(fā)明結(jié)果表明后代cl(即13)與該母牛m(即12)序列一致。嫌疑后代c2(即25)與該母牛m(即12)在212、314、416上分別有3次T/C轉(zhuǎn)換，在275、285上分別有2次G/A和在795上有1次A/G轉(zhuǎn)換。嫌疑后代c2分別在178和744位插入A和C堿基。所以，印證了后代cl與該母牛m是來(lái)源于同一個(gè)母系的個(gè)體，嫌疑后代c2與該母牛m是來(lái)源于不同母系的個(gè)體。實(shí)施例4、制備中國(guó)水牛親權(quán)鑒定試劑盒本發(fā)明用于中國(guó)水牛親權(quán)鑒定的十幾個(gè)主要包括一下試劑(1)10XPCR擴(kuò)增緩沖液；(2)MgCl2(25腿ol/L);(3)dNTPs(2.5畫1/L);(4)fxTa。DNA聚合酶(5U/uL);(5)實(shí)例l、2中所述的10對(duì)用于中國(guó)水牛親權(quán)鑒定的專用引物(20pmol/uL);(6)ddH20。本發(fā)明提供的試劑盒為利用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記和線粒體遺傳標(biāo)記兩種技術(shù)對(duì)中國(guó)水牛進(jìn)行親權(quán)鑒定的通用試劑盒，如單獨(dú)用于微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)，每盒可供檢測(cè)50次，如單獨(dú)用于線粒體標(biāo)記檢測(cè)，每盒可供檢測(cè)500次。每盒中各組分的量為10XPCR擴(kuò)增緩沖液1瓶(1250uL/瓶)，25腿ol/LMgCl2l瓶(750uL/瓶)，2.5腿ol/LdNTPs1瓶(500pL/瓶)，5U/pLr邵DNA聚合酶1瓶(250pL/瓶)，每對(duì)引物的上下游引物各一瓶(50uL/瓶)，ddH201瓶(10mL/瓶)，按上述劑量對(duì)試劑盒中的各組分進(jìn)行分裝，包裝后得到中國(guó)水牛親權(quán)鑒定試劑盒。序列表〈110〉西南民族大學(xué)〈120〉一種鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法及其引物、試劑盒<160>23<210>1〈211〉22<212〉腿〈213>人工序列〈220><223〉人工序列的描述引物〈400>1gatcaccttgccactatttcct22<210〉2<211>21〈212〉薩〈213>人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述引物〈400〉2acatgacagccagctgctact21〈210〉3〈211〉21〈212〉薩〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物〈■〉3agctgggaatataaccaaagg21〈210〉4<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223>人工序列的描述引物〈400>4agtgctttcaaggtccatgc20<210>5<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220>〈223>人工序列的描述引物〈400〉5atcctttgcagcctccacattg22〈210>6<211>22〈212>腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物〈400〉6ttgtgctttatgacactatceg22〈210>7<211〉21〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物〈400〉7gctgccttctaccaaataccc21〈210〉8<211〉21〈212〉腿〈213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述引物〈400〉8cttcctgagagaagcaacacc21<210〉9〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述引物〈400〉9cgaattccaaatctgttaatttgct25〈210〉10〈211〉24〈212〉薩〈213>人工序列<220><223〉人工序列的描述引物<■〉10acagacagaaactcaatgaaagca24〈210〉11<211>24<212〉腿〈213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述引物〈400〉11aagatgtgatccaagagagaggca24〈210〉12〈211〉24<212>腿〈213〉人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述引物〈400〉12aggaccagatcgtgaaaggcatag24<210>13〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>人工序列的描述引物〈400〉13ccaatgtcttcctagctcttc21〈210〉14<211〉22〈212〉DNA〈213>人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述引物〈400〉14ctgttagttctgccaaaatccc22〈210>15〈211〉19〈212〉瞧〈213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述引物〈400〉15aagcaaaaaggctgatggc19〈210〉16<211〉20〈212>腿〈213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述引物<400〉16ttgcagatactggcaagtgg20<210>17〈211〉20<212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221〉D-Loop<223〉人工序列的描述引物〈400〉17ctgcagtctcaccatcaacc20<210〉18〈211〉17〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉D-Loop<223〉人工序列的描述引物<400>18ggggtgt卿tgcttgc17〈210〉19<211>20〈212〉腿<213〉人工序列〈220〉〈221〉D-Loop<223>人工序列的描述引物<400〉19aggcatctggttctttcttc20〈210〉20〈211〉18<212>■<213>人工序列<220〉<221>D-Loop〈223〉人工序列的描述引物<400>20attagccattagtccatc18〈210〉21<image>imageseeoriginaldocumentpage28</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>權(quán)利要求1、一種鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法，其特征在于包括以下步驟(1)從普通牛種微衛(wèi)星標(biāo)記中，篩選出多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星引物；(2)以待檢水?；蚪MDNA為模板，在篩選出的微衛(wèi)星引物的引導(dǎo)下進(jìn)行25μL反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增；(3)對(duì)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；(4)根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果判斷每個(gè)個(gè)體的基因型，根據(jù)基因型計(jì)算單親親權(quán)指數(shù)PI值、并根據(jù)PI值計(jì)算出親子相對(duì)概率值W值，當(dāng)W值大于或等于99.73％時(shí)，則認(rèn)定假設(shè)親代與子代個(gè)體有親生關(guān)系，當(dāng)W值小于99.73％時(shí)，則可以認(rèn)為假設(shè)親代與子代個(gè)體不具有親生關(guān)系；上述微衛(wèi)星引物包括以下引物由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物ETH225；由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物BM1818；由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物INRA035；由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物BM2113；由序列表中序列9和序列10的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物TGLA227；由序列表中序列11和序列12的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物CSRM60；由序列表中序列13和序列14的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物BM2934；由序列表中序列15和序列16的核苷酸序列組成的微衛(wèi)星引物BM1862。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的25yL反應(yīng)體系包括DNA模板1.25ng，10XPCR緩沖液2.50wL，25mmol/L的MgCl21.50uL，2.5腿ol/L的dNTPs1.00uL，5U/uL的ExTaqDNA聚合酶0.50uL，20pmol/nL的上游引物O.50nL，20pmol/iiL的下游引物0.50uL，余量為滅菌蒸餾水。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法，其特征在于所述25uL反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min;94'C變性30s，50-65°C退火30s，72。C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法，其特征在于還包括以下步驟由序列表中序列17、序列18及序列19、序列20組成線粒體D-Loop區(qū)引物，以待檢水牛基因組DNA為模板，對(duì)線粒體基因片段進(jìn)行50iiL反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增，對(duì)線粒體PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化，利用雙脫氧終止法對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，用DNAman軟件分析待檢樣品的DNA序列一致率，若線粒體DNA序列完全一致，則說(shuō)明待檢樣品間存在親緣關(guān)系。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的50pL反應(yīng)體系包括DNA模板2.5ng，10XPCR緩沖液5uL，25mmol/L的MgCl23uL，2.5mmol/L的dNTPs4uL，5U/PL的ExTaqDNA聚合酶O.50uL，20pmol/uL的上游引物1pL，20pmo1/uL的下游引物1uL，余量為滅菌蒸餾水。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法，其特征在于所述50uL反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min;94。C變性lmin，55°C退火lmin，72"延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。7、一種用于鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的試劑盒，其特征在于試劑盒中包含序列表中序列1-20的引物，以及以下試劑TsgDNA聚合酶，10XPCR擴(kuò)增緩沖液，dNTPs，無(wú)菌水，10X凝膠上樣緩沖液，0.5mL磷酸緩沖鹽溶液，2mg/mL蛋白酶K，1C)q/。SDS液，飽和酚，氯仿，異戊醇，70%乙醇，無(wú)水乙醇，TE溶液，30%聚丙烯酰胺溶液，5XTBE電泳緩沖液，10%過(guò)硫酸銨溶液，NNNN-四甲基乙二胺，含10%乙醇、0.5%冰乙酸的固定液，1%硝酸溶液，0.2%硝酸銀溶液，含1.5%氫氧化鈉、0.4%甲醛的顯色液，0.75%碳酸鈉溶液，分子量標(biāo)準(zhǔn)物pUC18DNA/MspI，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，核酸染料，6X凝膠上樣緩沖液；所述各種溶液的溶劑均為水。全文摘要本發(fā)明公開了一種鑒定單親水牛親權(quán)關(guān)系的方法及其引物、試劑盒，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明篩選出多態(tài)性豐富的8個(gè)微衛(wèi)星引物，以待檢水?；蚪MDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷每個(gè)個(gè)體的基因型，根據(jù)基因型計(jì)算單親親權(quán)指數(shù)PI值、親子相對(duì)概率值W值，根據(jù)W值判斷親權(quán)關(guān)系是否存在。為進(jìn)一步提高鑒定的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和靈敏度，本發(fā)明還根據(jù)普通牛mtDNA的D-Loop區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行線粒體遺傳鑒定。本發(fā)明將微衛(wèi)星與線粒體遺傳標(biāo)記兩種方法相結(jié)合，從不同的角度進(jìn)行鑒定，且鑒定結(jié)果一致，提高了親權(quán)鑒定的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、靈敏度，使鑒定范圍更廣、樣品要求更低。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101509033SQ20081014809公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2008年12月29日優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日發(fā)明者蕊孫,徐亞歐,亮毛申請(qǐng)人:西南民族大學(xué)