專利名稱：：一種豬瘟重組亞單位疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及豬瘟疫苗的研制領(lǐng)域，特別是可作為豬瘟防治的新型疫苗應(yīng)用于臨床工作中的一種豬瘟重組亞單位疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
：豬瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的豬的一種烈性、病毒性傳染病，被國際獸疫周(0IE)和我國獸醫(yī)局列位A類傳染病，其癥狀特別嚴(yán)重、傳播迅速、無國界，豬瘟的爆發(fā)往往造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。20世紀(jì)70年代后期，豬瘟的流行特點(diǎn)發(fā)生了很大變化，持續(xù)性感染造成非典型豬瘟的出現(xiàn)，以及免疫失敗事件的時(shí)有發(fā)生，不斷地威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。其中一個(gè)主要原因是不能徹底查清豬群是否存在持續(xù)性豬瘟病毒感染的情況，導(dǎo)致無法確定豬瘟病毒抗體的來源，從而無法準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)疫苗免疫效果。因此，研制符合疫情特點(diǎn)的新型豬瘟疫苗成為形式的需要。國內(nèi)外的研究已經(jīng)證實(shí)，E2是豬瘟病毒最主要的保護(hù)性抗原蛋白，存在4個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)構(gòu)域A、B、C、D，位于E2N末端的690位866位氨基酸處，是病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要部位，是中和性抗原結(jié)構(gòu)域。利用生物學(xué)技術(shù)在體外表達(dá)的E2蛋白免疫動(dòng)物可產(chǎn)生高水平的中和抗體，足以保護(hù)動(dòng)物免受致死劑量豬瘟強(qiáng)毒的攻擊，因此E2基因是目前研制豬瘟基因工程疫苗的首選抗原基因。體外表達(dá)的重組E2蛋白具有抗原性好、表達(dá)量大、容易純化、可規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，制備的基因工程疫苗安全、高效，不存在潛在的危害環(huán)境和人類安全的危險(xiǎn)因素。同時(shí)發(fā)展起來的鑒別診斷技術(shù)可通過血清抗體檢測(cè)的方法準(zhǔn)確區(qū)分基因工程疫苗免疫抗體和野毒感染抗體，及時(shí)發(fā)現(xiàn)群體中隱性感染豬瘟病毒的個(gè)體，從而采取相應(yīng)的措施，剔出潛在的傳染源和導(dǎo)致豬瘟爆發(fā)的危險(xiǎn)因素，達(dá)到凈化豬群的目的，將豬瘟的危害降到最小。但是單個(gè)E2基因的抗原表位數(shù)量有限，影響免疫效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種通過增加一個(gè)E2基因，能使抗原表位數(shù)量增加一倍，彌補(bǔ)抗原表位數(shù)量的不足，提高重組E2亞單位疫苗的免疫效果；通過增加氨基酸連接接頭，使獲得的E2蛋白能夠獨(dú)立形成空間結(jié)構(gòu)，充分展示各自獨(dú)立的抗原表位的一種豬瘟重組亞單位疫苗的制備方法。為解決本發(fā)明的技術(shù)問題所采用的技術(shù)方法包括下述步驟A.利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法克隆豬瘟疫苗株E2蛋白的編碼基因；B.構(gòu)建融合E2基因利用基因重組技術(shù)，將雙E2基因串聯(lián)，在第二個(gè)E2基因5'端起始密碼子ATG上游增加一個(gè)大腸桿菌￡coh'RBS5'-AAGGAG-3、序列；同時(shí)在串聯(lián)的兩個(gè)E2基因之間增加氨基酸接頭——5'-GSAGSAAGSGEF-3';C.構(gòu)建重組表達(dá)載體rE2;D.rE2的誘導(dǎo)表達(dá)在LB液體培養(yǎng)基中表達(dá)rE2;優(yōu)化表達(dá)條件，促進(jìn)rE2蛋白的可溶性表達(dá)；E.rE2純化F.Westernblotting方法檢測(cè)rE2活性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬瘟重組亞單位疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟D中E2蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化是將含有E2基因的重組菌按2.0%的接種量轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基中，37。C劇烈震蕩培養(yǎng)0D600"0.60.8，加入終濃度為0.10mmol/L的IPTG，在24。C條件下誘導(dǎo)表達(dá)24小時(shí)；超聲波冰浴條件裂解菌體，收集上清和沉淀樣品，SDS-PAGE凝膠鑒定，獲得可溶性的rE2蛋白質(zhì)。本發(fā)明創(chuàng)造性地以雙E2基因串聯(lián)表達(dá)方式使E2抗原表位的數(shù)量增加一倍，顯著提高了重組E2亞單位疫苗的免疫效果；為了提高串聯(lián)后地E2蛋白表達(dá)效率，在第二個(gè)E2基因5'端起始密碼子(ATG)上游增加一個(gè)大腸桿菌co力')特別是在雙E2基因串聯(lián)后的第二個(gè)E2基因的5'端起始密碼子(ATG)上游增加一個(gè)大腸桿菌(fco乃')RBS序列(5'-AAGGAG-3');為了最大限度的降低雙基因表達(dá)后抗原表位被遮蔽地頻率，在串聯(lián)的兩個(gè)E2基因之間增加"氨基酸接頭"(AminoAcidLinker)5、-GSAGSAAGSGEF-3、(5'-GGCAGCGCAGGCAGCGCAGCAGGCAGCGGCGAATTC-3、)，促進(jìn)目標(biāo)蛋白的正確折疊和可溶性表達(dá)，使獲得的E2蛋白能夠獨(dú)立形成空間結(jié)構(gòu)，完整展示各自得抗原表位。利用融合雙基因E2蛋白制備重組亞單位疫苗，其免疫效果與豬瘟兔化弱毒疫苗免疫保護(hù)效果相當(dāng)，可川于豬瘟的臨床免疫工作中。本發(fā)明的有益效果在于1.RBS序列對(duì)串聯(lián)地雙E2基!大l農(nóng)達(dá)的促進(jìn)作用。通過蛋白質(zhì)電泳證實(shí)，rE2重組蛋白的大小與預(yù)測(cè)的大小一致，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)E2基因的共表達(dá)，增加的RBS(5'-AAGGAG-3、)提高了下游E2基因的表達(dá)效率。2.氨基酸接頭的作用。在兩個(gè)同源E2基閎之問增加的氨基酸接頭可以有效地提高目標(biāo)蛋白的可溶性，促進(jìn)rE2蛋白形成正確的空間構(gòu)象，同時(shí)減少包涵體的形成。3.rE2亞單位疫苗的安全性。通過rE2亞單位疫苗對(duì)供試動(dòng)物的臨床反應(yīng)、可以肯定的認(rèn)為豬瘟病毒rE2重組亞單位疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物是安全、可靠的，不會(huì)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物造成不良的影響。4.免疫效果。從抗豬瘟病毒抗體的消長(zhǎng)規(guī)律和免疫效果的試驗(yàn)可以得到如下的結(jié)論。(1)原核系統(tǒng)農(nóng)達(dá)的可溶性rE2融合蛋白能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生針對(duì)CSFV的中和抗體，足以抵抗致死劑量豬瘟強(qiáng)毒的攻擊下。(2)研制的rE2亞單位疫苗基本達(dá)到了豬瘟兔化弱毒細(xì)胞系疫苗的保護(hù)水平，可成為新型的基因工程疫苗應(yīng)用在未來的豬瘟預(yù)防和控制工作當(dāng)中。具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、E2基因抗原區(qū)域的克隆和重組表達(dá)載體pCSFV-rE2的構(gòu)建按照擴(kuò)增CSFVE2基因的方法，設(shè)計(jì)兩對(duì)分別含有限制性酶切位點(diǎn)特異性引物見表一，單個(gè)E2基因序列跨度為569bp，串聯(lián)后為1138bp。表-引物的編號(hào)、序列、位賞、長(zhǎng)度編號(hào)序列位置酶切位點(diǎn)f':2--i5'(;c(;(;ATccc(;GCTA(;c(.:T(;TMG(;AAGAT3'24342462B柳HIE2-l5'GCGMTCCTGTGTAATACACT(;aTCGC3'REcoRIEcoRi<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>備注引物E2-2F:GAATCC酶切位點(diǎn)序列;GGCTTC氨基酸接頭序列；ATGGAT為E2基因本序列；RBS序列5'-AAGGAG-3提取疫苗毒株(C-株)總RNA，RT-PCR的方法擴(kuò)增E2基因主要抗原區(qū)片段。雙酶切pGEX-6p-l載體和純化的E2片段，利用共有EcoRI酶切位點(diǎn)將兩個(gè)基因連接起來，構(gòu)建重組表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建策略圖譜見圖一。重組質(zhì)粒經(jīng)核苷酸序列測(cè)定，在確保閱讀框(ORF)正確后，將陽性重組質(zhì)粒命名為pCSFV-rE2，并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。2.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定LB培養(yǎng)基均為Amp+氨芐青霉素鈉，濃度為10(^g/iiiL。將挑取的單菌落接種到5mLLB液體培養(yǎng)基中，37"C過夜培養(yǎng)；按照2.0%的接菌量轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)0D600L60.8，誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為1.0mol/L，37。C培養(yǎng)誘導(dǎo)6h.取lmL誘導(dǎo)后重組齒液，離心后收集沉淀。SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳凝膠鑒定表達(dá)產(chǎn)物。3.E2蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化含有E2基因的重組菌按2.0%的接種量轉(zhuǎn)接1LLB液體培養(yǎng)基中，37。C劇烈震蕩培養(yǎng)0D600L60.8，加入終濃度為0.10mmol/L的IPTG，在24。C條件下誘導(dǎo)表達(dá)21小時(shí)；超聲波冰浴條件裂解菌體，收集上清和沉淀樣品，SDS-PAGE凝膠鑒定。4.SDS-PAGE和Westernblotting分析目標(biāo)蛋白試驗(yàn)表明，在58kDa處有-一條明顯特異性蛋白帶，該蛋白條帶可以被豬瘟的陽性血清識(shí)別，確定H的蛋白已經(jīng)表達(dá)。5.豬體攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)5.1CSFVrE2亞單位疫苗豬體免疫試驗(yàn)5.1.1試驗(yàn)動(dòng)物未免疫豬瘟疫苗的50n齡斷奶仔豬(15-20kg)40頭，經(jīng)檢測(cè)無豬瘟病毒血清抗體。5.1.2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)rE2亞單位疫苗免疫組30頭豬(SYp組)，設(shè)C株豬瘟兔化弱毒疫苗免疫對(duì)照5頭豬(Cp組)，空白對(duì)照組5頭豬(Bp組)。免疫方法及劑量見表二。兩次免疫時(shí)間間隔4周。二免4周后進(jìn)行免疫效果試驗(yàn)，即攻毒試驗(yàn)。5.1.3病毒每株C株豬瘟兔化弱毒疫苗來A商品化的細(xì)胞疫苗(40頭份/瓶)；攻毒用的豬瘟病毒為石門系血毒。表二試驗(yàn)豬分組及免疫劑量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>備a::—W次免疫E2抗原ffl生理鹽水稀釋，然后滴加卜.j休枳的弗式佐劑(Sigma公,d產(chǎn)品)，充分乳化，豬/l:頸部肌肉沐射lmL/頭.，D對(duì)照組漢接種化中位疫苗免疫組相l(xiāng)ni劑it的生理鹽水.以IDEXX公司生產(chǎn)的"豬瘟病毒抗體診斷ELISA試劑盒"檢測(cè)豬瘟病毒抗體阻斷率，阻斷率》40%抗體陽性，阻斷率《30%為陰性，介于兩者之間為可疑。5.2、E2亞單位疫苗對(duì)豬的臨床反應(yīng)和病理變化5.2.l豬的臨床反應(yīng)5.2.1.1E2亞單位疫苗免疫豬組(1)試驗(yàn)組購買的40頭試驗(yàn)豬按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)分組，在試驗(yàn)場(chǎng)地飼養(yǎng)7天，每天測(cè)量體溫，結(jié)果表明試驗(yàn)用的動(dòng)物體溫在38.(TC40.(TC之間，屬于豬的正常體溫范闈，符合試驗(yàn)要求。飼養(yǎng)期間試驗(yàn)動(dòng)物精神狀態(tài)良好，食欲旺盛，沒有異常的臨床反應(yīng)，符合試驗(yàn)要求.(2)免疫期間的臨床反應(yīng)rE2亞單位疫苗免疫豬后每天測(cè)量體溫。rE2亞單位疫苗免疫組、C株疫苗免疫組和空白對(duì)照組的豬體溫在38.(TC40.0。C之間變化，屬于正常體溫范圍.在此期間動(dòng)物精神狀態(tài)良好，采食」H常，生長(zhǎng)正常.未出現(xiàn)異常的臨床反應(yīng).5.3rE2亞單位疫苗在豬體內(nèi)的抗體消長(zhǎng)規(guī)律和攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)5.3.l抗體消長(zhǎng)規(guī)律第二次亞單位疫苗后4周進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)攻毒試驗(yàn)前宰殺的8頭SYp組豬、2頭Cp組豬和2頭Bp組的血清抗體消長(zhǎng)規(guī)律(見表三)。表三部分試驗(yàn)豬的抗體阻斷率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>判斷標(biāo)準(zhǔn):阻斷率240W豬瘟病&抗體m性，阻斷率530%為陰性，介丁'兩者之間為可疑。喪中黑體部分為陽性依。通過表三數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果可知，所有rE2亞單位疫苗免疫組(SYp組)豬的血潔抗體在首次免疫14天后全部為陽性.SYp組與弱毒疫苗免疫組(Cp組)和空白對(duì)照組(Bp組)比較發(fā)現(xiàn)，rE2亞單位疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗豬瘟病毒抗體，其效果基本達(dá)到了與Cp組相同的效果，并且在豬體內(nèi)，亞單位疫苗產(chǎn)生的豬瘟病毒抗體穩(wěn)定的、持續(xù)性的存在.5.3.免疫效果試驗(yàn)5.3.1攻毒方法參考"豬瘟兔化弱毒疫苗n型"的豬效力保護(hù)試驗(yàn)方法，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。剩余28頭試驗(yàn)豬在相同條件下分別在頸部皮下注射石門血毒lmL(l(f感染劑量)，每H觀察試驗(yàn)豬的精神狀態(tài)、食欲等臨床反應(yīng)。5.3.2結(jié)果攻毒5天后，對(duì)照豬Bpl死亡，8天后Bp3死亡，10天最后1頭空白對(duì)照豬死亡。在此期間，rE2亞單位疫苗免疫豬和弱毒疫苗免疫豬未出現(xiàn)異常臨床反應(yīng)和豬瘟的臨床癥狀。根據(jù)"豬瘟兔化弱毒疫苗II型"的豬效力保護(hù)試驗(yàn)的要求"如果設(shè)4(3頭)頭攻毒對(duì)照豬全部發(fā)病至少死亡3(2頭)頭，而效檢豬(E2亞單位疫苗免疫組和弱毒疫苗免疫組)全部鍵活或稍有體溫反應(yīng)，但無豬瘟臨床癥狀出現(xiàn)，為免疫合格"的判斷標(biāo)準(zhǔn)，可以判定在攻毒后，亞單位疫苗免疫組和弱毒疫苗免疫組的豬全部被保護(hù)。試劑和材料1、毒株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所保存。2、引物和測(cè)序由Takara公司合成。3、Sigma公司:辣根過諷化物酶標(biāo)記的兔抗IgG、TMB、IPTG、核酸電泳、弗式佐劑和蛋白電泳所用試劑。4、Takara公司組織總DNA提取試劑盒、擴(kuò)增用單核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高保真的Taq酶、限制性核酸內(nèi)切酶(BamHI、Xholl、EcoRI)、T4DNA連接酶。5、安瑪兩亞瓊脂糖4B填料、超濾濃縮管。6、IDEXX公司提供"豬瘟病毒抗體診斷ELISA試劑盒"。序列表OrganizationApplicantStreet:鹽場(chǎng)路徐家坪1City:蘭州State:甘肅Country:中華人民共和國PostalC。de:730046PhoneNumber:0931-8342706FaxNumber:0931-8342052EmailAddress:yinshuanghuikangr置63.com<110>OrganizationName:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所ApplicationProject〈120〉Title:—種豬瘟重組亞單位疫苗的制備方法〈130>AppFileReference:M.M.Hulst，D.FWestra，G.Wensvoort，R.J.M.Moormann,GlycoproteinElofhogcholeravirusexpressedininsectcellsprotectsswinefromhogcholera,J.Virol.67(1993)5435-5442.〈140〉CurrentAppNumber:10003.2006.7〈141>CurrentFilingDate:2000-06_30Sequence〈213>OrganismName:classicalswinefevervirusE2gene〈400〉PreSequenceString:gaagattacaggtacgcaatatcgtcaaccgatgagatagggctacttggggccggaggt60ctcaccaccacctggaaggaatacaaccacgatttgcaactgaatgacgggaccgtcaag120gccagttgcg180ttggcgtcat240gggaccaacc300gatacgagtc360tatcttgtct420actctgagga480gattgtgtga540tggacatgtg600cacaaagtga660tctggcg卿720catcaccatg780gccgg郷tc840accgtcaagg900aggaggtatt960ctgttcgacg1020tggcaggttctgcataagaacatcaactgactgttgttaagcccaataggca,gtggtccaccatagttg肌aggcgaggaatgaagtatgccctgttaagattacagtcaccaccacccagttgcgttggcgtcattggaccaacccctttaaagtcggctttacccggaaatgggagggaaagtacgtggacgggtaaagaccttcggaaaatgaBattcaaggagaatggtccgcagtagccttagtacgcaatactggaaggaaggcaggttccgcataagaagatcaactgagacagcacttaacttccgtgagatgacttcaaatacgacctgtcatagagtaggagagacagatttattctatggctggcttggtttggtgttcggctacgtcgtcaaccgtacaaccscgtttaaagtcagctttacccagaaatgggagatgtggtcagcattcgagctggtccgggcttgttgaacgggcacagcagtagccctttccattgtaagttccgctgctggacgctggctctaggatatcaatg卿taggatttgcaactcagcacttaacttccgtgacatgacttcagtaggaggtatcctgttcgacgtgcccgttttaatgctttcgagcccaacagcacagaatgggggggc朋cttctggcaaacgctgctggtgcaccatcacgctacttggggaatgacgggtgtggtcagtattcgagctcgtccgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgttaagggaaagtacaatacgaccttgttgaacggt1080aatgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgtcatagagtgcacagcagtg1140agcccaacaactctgaggacagaagtggtaaagaccttcaggagagacaagccctttccg1200cacagaatggattgtgtgaccaccatagtggaaaatgaagatttattctattgtaagttg1260gggggcaactggacatgtgtgaaaggc1287〈212〉Type:腿<211〉Length:1287SequenceName:rE2vaccineSequenceDescription:FeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:E2gene<222〉LocationFrom:1〈222〉LocationTo:558OtherInformation:第一個(gè)E2基因CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:CDS<222〉LocationFrom:1<222〉LocationTo:1286OtherInformation:CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:<221〉FeatureKey:EcoRI〈222〉LocationFrom:559〈222〉LocationTo:564OtherInformation:限制性酶切位點(diǎn)EcoRICDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:ABS<222〉LocationFrom:565〈222〉LocationTo:570OtherInformationCDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:〈221〉FeatureKey:ATG<222〉LocationFrom:571〈222〉LocationTo:573OtherInformation:CDSJoin:No大腸桿菌核糖體識(shí)別位點(diǎn)起始密碼子FeatureSequence:rE2vaccine:<221〉FeatureKey:AminoAcidLinker<222〉LocationFrom:574<222〉LocationTo:729OtherInformation:增加的氨基酸接頭序列CDSJoin:NoFeatureSequence:rE2vaccine:<221>FeatureKey:E2gene<222>LocationFrom:730<222〉LocationTo:1286OtherInformation:串聯(lián)的第二個(gè)E2基因序列CDSJoin:NoThesisSequence:rE2vaccine:<301〉A(chǔ)uthors:vanRijnPA.，MiedemaGKW.，WensvoortG.，etal.<302>Title:Classicalswinefevervirus(CSFV)envelopeglycoproteinE2containingonestructuralantigenicunitprotectspigsfromlethalCSFVchallenge<306〉PageRange:2737-2745〈307〉Date:1996-—-—<308〉DBAccessionNumber:〈309〉DBEntryDate:_-—-—<313>From:<313>To:權(quán)利要求1、一種豬瘟重組亞單位疫苗的制備方法，其特征在于包括下述步驟A.利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法克隆豬瘟疫苗株E2蛋白的編碼基因；B.構(gòu)建融合E2基因利用基因重組技術(shù)，將雙E2基因串聯(lián)，在第二個(gè)E2基因5′端起始密碼子ATG上游增加一個(gè)大腸桿菌E.coliRBS5`-AAGGAG-3`序列；同時(shí)在串聯(lián)的兩個(gè)E2基因之間增加氨基酸接頭——5`-GSAGSAAGSGEF-3`；C.構(gòu)建重組表達(dá)載體rE2；D.rE2的誘導(dǎo)表達(dá)在LB液體培養(yǎng)基中表達(dá)rE2；優(yōu)化表達(dá)條件，促進(jìn)rE2蛋白的可溶性表達(dá)；E.rE2純化F.Westernblotting方法檢測(cè)rE2活性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬瘟重組亞單位疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟D中E2蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化是將含有E2基因的重組菌按2.0%的接種量轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基中，37'C劇烈震蕩培養(yǎng)0D600^0.60.8，加入終濃度為0.10ramol/L的IPTG，在24"C條件下誘導(dǎo)表達(dá)24小時(shí)；超聲波冰浴條件裂解菌體，收集上清和沉淀樣品，SDS-PAGE凝膠鑒定，獲得可溶性的rE2蛋白質(zhì)。全文摘要一種豬瘟重組亞單位疫苗的制備方法，包括下述步驟A.利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法克隆豬瘟疫苗株E2蛋白的編碼基因；B.構(gòu)建融合E2基因C.構(gòu)建重組表達(dá)載體rE2；D.rE2的誘導(dǎo)表達(dá)E.rE2純化。F.Westernblotting方法檢測(cè)rE2活性。本發(fā)明創(chuàng)造性地以雙E2基因串聯(lián)表達(dá)方式使E2抗原表位的數(shù)量增加一倍，顯著提高了重組E2亞單位疫苗的免疫效果；為提高雙E2蛋白表達(dá)效率，在第二個(gè)E2基因5′端起始密碼子(ATG)上游增加一個(gè)大腸桿菌RBS序列(5′-AAGGAG-3′)；同時(shí)在串聯(lián)的E2基因之間增加氨基酸接頭5′-GSAGSAAGSGEF-3′，使獲得的E2蛋白能夠完整展示其抗原表位。本發(fā)明的E2蛋白重組亞單位疫苗，免疫保護(hù)效果與豬瘟兔化弱毒疫苗相當(dāng)。文檔編號(hào)C12N15/70GK101418303SQ20081015030公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2008年7月6日優(yōu)先權(quán)日2008年7月6日發(fā)明者劉湘濤,劉艷紅,孫世琪,尚佑軍,尹雙輝,宏田,韓雪清申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所