專利名稱：：一種采用靜息細胞的雄烯二酮生物發(fā)酵方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種新的關(guān)于雄烯二酮及雄二烯二酮發(fā)酵工藝。本發(fā)明一種以所述雄甾化合物為活性成分的藥物制劑及該雄甾化合物在制備治療人或哺乳動物疾病的藥物中的應用。
發(fā)明內(nèi)容雄甾4-烯-3，17-雙酮(androst-4-ene-3，17_dione，簡稱雄烯二酮或AD)是甾體激素類藥物不可替代的中間體，對機體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用?？梢哉f幾乎所有甾體激素藥物都是以AD作為起始原料進行生產(chǎn)的。如用于生產(chǎn)性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮質(zhì)激素，又可用于合成氫化可的松，氧化潑尼松，黃體酮、雌烯醇、地塞米松等100余種藥物，也是直接用于生產(chǎn)抗早孕米非司酮和各類計劃生育用藥的必不可少的基本原料。如今AD不斷被一些發(fā)達國家用于開發(fā)和生產(chǎn)新的醫(yī)藥主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及類固醇類激素免疫抗原等，目前全世界范圍內(nèi)，AD的應用領域日益拓寬，用AD做原材料生產(chǎn)的醫(yī)藥品種不斷增加。由于化學全合成雄烯二酮成本較高，國內(nèi)外很多科學家一直研究如何通過生物發(fā)酵方法得到雄烯二酮。50年代，美國Upjohn公司首先利用側(cè)鏈上有雙鏈的大豆甾醇和麥角甾醇為原料生產(chǎn)出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-l，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作為合成甾體藥物的原料。近年來，由于甾體藥物應用量逐年增加，人們的目光又轉(zhuǎn)到在動植物界中含量較多的膽甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被認為是具有巨大潛能的甾體激素類藥物的起始原料。20世紀60年代中期，由Sih等首先發(fā)現(xiàn)有些微生物可以選擇性降解切除甾醇的飽和側(cè)鏈而得到AD和ADD，70年代初，日本的有馬啟利用微生物降解膽甾醇生產(chǎn)ADD獲得成功，受到許多制藥公司的高度重視。為了大量生產(chǎn)類固醇激素，研究者試圖使用甾醇為唯一碳源分離微生物和改變甾醇結(jié)構(gòu)用作發(fā)酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化學添加劑來提高類固醇的收得率，這一努力已獲得很大進展(Marsheck等，ApliedMicroobiology，23(1):7277，1972)。此外，埃及國家研究中心生物與天然產(chǎn)品化學系的和Sallam等研究發(fā)現(xiàn)，利用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)底物培養(yǎng)基pH值5.57.38可提高生物降解AD、ADD的轉(zhuǎn)化率。由于AD與ADD結(jié)構(gòu)非常類似，兩者的混合物分離較為困難，而且在使用中AD的用途遠多于ADD，AD也可以通過生物法得到ADD，所以科學家更希望通過控制生物轉(zhuǎn)化，減少ADD的含量，更多得到高含量的AD。Upjohn公司在美國專利No.4，293，644中描述了一種通過分枝桿菌(ATCC29472)的突變株從多種類固醇中得到以高產(chǎn)量的雄-4-烯-3，17-二酮(AD)為主，并有少量雄-l，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的產(chǎn)物的方法。以后的研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌，諾卡氏菌和分枝桿菌等微生物均可用于直接切除甾醇的飽和側(cè)鏈，在一定條件下得到AD和ADD，這使得微生物轉(zhuǎn)化工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。近年來該工藝主要是通過菌種的改造，提高收率和含量，如W09949075A1公開了一種植物甾醇向雄烯二酮(AD)和雄二烯二酮(ADD)的微生物轉(zhuǎn)化方法，并具體公開以下技術(shù)特征利用一種培養(yǎng)基增殖分枝桿菌屬的分枝桿菌MB3683菌種；利用一種或多種增溶劑將植物甾醇組3合物溶解成溶液；將分枝桿菌MB3683培養(yǎng)物和植物甾醇組合物溶液置于生物反應器中，并保持足夠的時間，將植物甾醇組合物轉(zhuǎn)化為AD和/或ADD。以上工藝基本上采取生長細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法，即是在微生物細胞培養(yǎng)前或培養(yǎng)一段時間后，將底物直接加到微生物培養(yǎng)基中，微生物在自身繁殖生長的同時對底物進行生物轉(zhuǎn)化。這是生物轉(zhuǎn)化法最簡單和最常用的一種方法。該法的優(yōu)點是微生物生物轉(zhuǎn)化容易，缺點是產(chǎn)品的后發(fā)酵時間長，易產(chǎn)生多種產(chǎn)物，處理分離純化困難。如CN03804973中說明按照1%的投料濃度時，植物甾醇轉(zhuǎn)化為AD/ADD的時間在87-91小時，而且AD/ADD的比例一般為9/l。如果降低底物的投料濃度，反應時間可以縮短，但相應工業(yè)化成本會大大提高。名為"一種采用靜息細胞在濁點系統(tǒng)中進行生物轉(zhuǎn)化"(CN200310108967)的中國專利中提到，利用分支桿菌MycobacteriumNRRLB-3683靜息細胞在濁點系統(tǒng)發(fā)酵膽固醇得到1，4雄烯-3，17-酮。但是由于該濁點系統(tǒng)需要使用非離子表面活性劑如TritonX100或114，這類表面活性劑一般價格較高，同時該專利發(fā)明人在《中國工程科學》2005年7巻5期73-78頁《兩相分配生物反應器——濁點系統(tǒng)在生物轉(zhuǎn)化中的應用》中提到"有關(guān)大規(guī)模表面活性劑回收工藝的文獻報道不多，進一步研究產(chǎn)物與濁點系統(tǒng)中表面活性劑的分離工藝對完善濁點系統(tǒng)在生物過程中的應用具有實際意義。"說明濁點系統(tǒng)中表面活性劑的回收問題尚未解決。而雄烯二酮、雄二烯二酮由于市場價格一般不超過800-900元/公斤，所以采用非離子表面活性劑形成的濁點系統(tǒng)進行生物轉(zhuǎn)化，成本極高，實現(xiàn)工業(yè)化困難。
發(fā)明內(nèi)容通過發(fā)明人的長時間科研，驚奇的發(fā)現(xiàn)采用微生物靜息細胞直接降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮，可以不使用昂貴的非離子表面活性劑，可以較好的保證在較高的投料濃度下，反應時間縮短，提高反應效率。尤其是通過靜息細胞可以進行二次發(fā)酵，可以提高菌種的使用效率，減少總體反應時間和能源、物料的消耗，有利于節(jié)能環(huán)保。更重要的是通過對生物轉(zhuǎn)化時間的控制可以使植物甾醇更多的轉(zhuǎn)化為雄烯二酮，減少雄二烯二酮的含量，便于產(chǎn)物的提純和精制。靜息細胞轉(zhuǎn)化法，是將微生物培養(yǎng)至一定階段后分離出菌絲體，將其重新懸浮于緩沖液或不完全培養(yǎng)基(缺少某種營養(yǎng)物質(zhì)如氮源等)中，使其處于不再生長但仍保持原有各種酶活的狀態(tài)，然后添加底物，在適當溫度、振蕩條件下進行轉(zhuǎn)化的方法。本文中提到的分支桿菌是Mycobacterium。雄烯二酮/雄二烯二酮表示雄烯二酮和雄二烯二酮，以及雄烯二酮或雄二烯二酮?！N微生物靜息細胞降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮轉(zhuǎn)化工藝，步驟如下具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種的靜息細胞可直接或經(jīng)適當處理后，加入到植物甾醇轉(zhuǎn)化液中進行第一次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應，使轉(zhuǎn)化液中的植物甾醇轉(zhuǎn)化得到雄烯二酮/雄二烯二酮轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體細胞，將轉(zhuǎn)化液經(jīng)溶劑提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。在第一次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應結(jié)束后，被去除的菌體細胞可以直接或經(jīng)適當處理后，加入到第二批植物甾醇轉(zhuǎn)化液中進行第二次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應，使轉(zhuǎn)化液中的植物甾醇轉(zhuǎn)化得到雄烯二酮/雄二烯二酮后，去除菌體細胞，將轉(zhuǎn)化液經(jīng)溶劑與第一次靜息細胞的轉(zhuǎn)化液合并，通過溶劑提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。優(yōu)選第一次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應時間不超過45小時。微生物靜息細胞的制作工藝為將具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液與菌體分離，所獲菌體沉淀作為靜息細胞。微生物靜息細胞的制作工藝為將具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種接種到含植物甾醇的培養(yǎng)液中，進行植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)，同時不斷添加底物植物甾醇到轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)液中，維持植物甾醇濃度在O.1%以上，轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)液與菌體分離，所獲轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)溶劑提取，得到雄烯二酮/雄二烯二酮，所獲菌體沉淀作為靜息細胞。轉(zhuǎn)化液可以僅為水或磷酸鹽的緩沖液。磷酸鹽的緩沖液pH為6.58.0。本文中所述的磷酸鹽緩沖液(PhosphateBuffer,PB)配制方法如下先配制0.2mol/L的NaH2P04和0.2mol/L的Na2HP04，兩者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(PB)，根據(jù)需要可配制不同濃度的PB和PBS。(1)0.2mol/L的Na2HP04;稱取Na2HP04.12H2031.2g(或NaH2P04H2027.6g)加重蒸水至1000ml溶解。(2)0.2mol/L的Na2HP04:稱取NaHP04.'12H2071.632g(或Na2HP04'7H2053.6g或Na2HP042H2035.6g)加重蒸水至1000ml溶解。0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(p朋.58.0)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>轉(zhuǎn)化液也可以含有玉米漿或Refiner糖蜜之一及無機鹽，其中優(yōu)選玉米漿和無機鹽；也可以僅含有無機鹽。無機鹽可以優(yōu)選磷酸銨和硝酸鈉，其比例優(yōu)選磷酸銨硝酸鈉為10:40-99，可以利用無機堿調(diào)節(jié)PH至7.0-7.5。轉(zhuǎn)化液也可以加入磷酸鹽、鎂和/或亞鐵離子、緩沖液，其中的一種或多種。上述轉(zhuǎn)化過程中植物甾醇可以進行粉碎或與溶劑混合后緩慢與轉(zhuǎn)化液混合，便于植物甾醇與靜息細胞接觸。其中植物甾醇通過常規(guī)方法粉碎粒徑D9?！禝OO微米，優(yōu)選D9。《10微米，更優(yōu)選D9。《IO微米。溶劑優(yōu)選N，N-二甲基甲酰胺、四個碳以內(nèi)的醇如甲醇和乙醇、六個碳以內(nèi)的醚如乙醚和四氫呋喃。靜息細胞培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基含有玉米漿或Refiner糖蜜、無機鹽，還可以增加糖，其中優(yōu)選玉米槳，無機鹽可以優(yōu)選磷酸銨和硝酸鈉，其比例優(yōu)選磷酸銨硝酸鈉為io:40-99，糖優(yōu)選葡萄糖，靜息細胞可以用磷酸緩沖液洗滌，優(yōu)選ra可以優(yōu)選為6.5-7的磷酸緩沖液。每升培養(yǎng)基優(yōu)選含有玉米漿5-50ml，無機鹽4-10g，葡萄糖5-15g。培養(yǎng)基可以加入磷酸鹽、鎂和/或亞鐵離子、緩沖液，其中的一種或多種。微生物菌種的靜息細胞直接或經(jīng)適當處理加入到植物甾醇轉(zhuǎn)化液中，直接使用是指是微生物培養(yǎng)結(jié)束后，直接從培養(yǎng)液經(jīng)離心或過濾獲得的菌體沉淀；使用經(jīng)適當處理是指前述的菌體沉淀經(jīng)40-9(TC加熱處理一段時間后所獲得的死菌體；或是指前述的菌體沉淀經(jīng)任意一種已知的固定化方法處理所獲得的固定化菌體；或是指前述的菌體沉淀，通過細胞自溶、或細胞破碎等方法使酶釋放到溶液中，通過離心或過濾等方法除去菌體細胞碎片后，所得的細胞酶提取液，或經(jīng)硫酸按鹽析法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法等純化后的酶制劑。上述具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種優(yōu)選為分枝桿菌屬(Mycobacterium)或諾卡氏菌屬(Nocardia)，更優(yōu)選分枝桿菌屬(Mycobacterium)，更優(yōu)選為NRRLB-3683，NRRLB_3805，NRRLB_8153。菌種中提到的NRRL是美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)的縮寫，該中心是國際菌種保藏機構(gòu)之一。具體實施例方式以下實施例的無菌水是自來水滅菌(12rC持續(xù)20分鐘)得到。靜息細胞的量以培養(yǎng)靜息細胞培養(yǎng)液的量計算，例如靜息細胞1L，相當于1L培養(yǎng)液過濾得到的菌絲的量。轉(zhuǎn)化液用二氯甲烷抽提，減壓濃縮后稀釋適當倍數(shù)，10000r/min離心除去可能的不溶物，然后采用天津科技大學學報第23巻第1期"氣相色譜法測定植物甾醇發(fā)酵液中雄甾烯酮和植物甾醇的含量"中的方法進行檢測AD、ADD。實施例1菌種分枝桿菌-Mycobacteriumfortuiturn.NRRLB_3683。1.1靜息細胞培養(yǎng)方法[OO38]靜息細胞培養(yǎng)基(每升)40ml玉米槳，5.2gNaN03，0.8gNH4H2P04，5.3g葡萄糖，其余為無菌水。培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(l"throw)200rpm溫度30。C生長時間50小時培養(yǎng)注解如果在底部有黃色細胞沉淀形成則表示為良好的培養(yǎng)物生物方法在培養(yǎng)基中制備用于生物轉(zhuǎn)化的接種物。從瓊脂料面(在玻璃試管中培養(yǎng))接種錐形瓶，在無菌條件下進行接種，移取無菌水(5mL)到瓊脂抖面上.用移液管末端輕輕刮下細菌培養(yǎng)物.然后移取該混懸培養(yǎng)物并放入錐形瓶中.在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進行細菌增殖(200rpm，1"throw,30度)。在培養(yǎng)50小時后，過濾，用無菌水洗滌，得到菌絲，即靜息細胞。在操作中，還可以針對種子進行二級乃至三級培養(yǎng)，得到更多的靜息細胞。1.2菌體靜息轉(zhuǎn)化方法甾體發(fā)酵轉(zhuǎn)化液(每升)底物10.0g植物甾醇(1.0%)粉碎粒徑D9?！?0微米。靜息細胞量0.5L。余量的無菌水。無菌水用1MNaOH溶液(40g/LNaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至7.5，將轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)移至生物反應器中，隨后加熱至40-50°C。在燒杯中稱重植物甾醇，倒入生物反應器中已加熱的轉(zhuǎn)化液中(40-5(TC)，攪拌均勻，然后冷卻至3(TC，加入靜息細胞，保持該溫度進行生物轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)時間50小時，通氣量0.3L/L/min，攪拌300rpm。70小時后轉(zhuǎn)化液中AD和ADD的含量是表1中的含量。表1\^批號12345678910AD+ADD(%)86.087.685.087.187.088.186.987.388.085.9AD:ADD7.67.07.17.57.77.77.47.37.67.3注AD:ADD是AD峰面積除以ADD峰面積的值。實施例2菌種分枝桿菌.Mycobacteriumfortuitum.NRRLB_3683。2.l靜息細胞培養(yǎng)方法靜息細胞培養(yǎng)基(每升)40mlRefiner糖蜜，5.2gNaN03，0.8gNH4H2P04，5.3g葡萄糖，1.5g植物甾醇(粉碎粒徑D9。《90微米)，Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0，其余為無菌水。培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(1"throw)200rpm溫度30。C生長時間72小時培養(yǎng)注解如果在底部有黃色細胞沉淀形成則表示為良好的培養(yǎng)物生物方法在培養(yǎng)基中制備用于生物轉(zhuǎn)化的接種物。從瓊脂料面(在玻璃試管中培養(yǎng))接種錐形瓶，在無菌條件下進行接種，移取無菌水(5mL)到瓊脂抖面上.用移液管末端輕輕刮下細菌培養(yǎng)物.然后移取該混懸培養(yǎng)物并放入錐形瓶中.在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進行細菌增殖(200rpm，1〃throw,30度)。維持植物甾醇濃度在0.1%以上，在培養(yǎng)72小時后，過濾，用ra7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌，得到菌絲，即靜息細胞。在操作中，還可以針對種子進行二級乃至三級培養(yǎng)，得到更多的靜息細胞。2.2菌體靜息轉(zhuǎn)化方法甾體發(fā)酵轉(zhuǎn)化液(每升)底物20.0g植物甾醇(2.0%)粉碎粒徑D9?！?0微米。靜息細胞量0.75L。余8量的無菌水。無菌水用1MNaOH溶液(40g/LNaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至7.5，將轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)移至生物反應器中，隨后加熱至40-50°C。在燒杯中稱重植物甾醇12g，倒入生物反應器中已加熱的轉(zhuǎn)化液中(40-50°C)，攪拌均勻，然后冷卻至30°C，加入靜息細胞進行第一次轉(zhuǎn)化，保持該溫度進行生物轉(zhuǎn)化，通氣量0.3L/L/min，攪拌300rpm，轉(zhuǎn)化時間40小時；過濾得到靜息細胞，再用ffl為7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌后再次按照第一次轉(zhuǎn)化的方法投入8g甾醇，進行第二次轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時間為50小時，過濾得到的過濾液與第一次轉(zhuǎn)化過濾得到的過濾液合并。兩次轉(zhuǎn)化液合并后的AD和ADD的含量是表2中的含量。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注AD:ADD是AD峰面積除以ADD峰面積的值。實施例3菌禾中分枝桿菌-Mycobacteriumfortuiturn.NRRLB_3805。3.1靜息細胞培養(yǎng)方法[oose]靜息細胞培養(yǎng)基(每升)10mlRefiner糖蜜，8.6gNaN03，0.4gNH4H2P04，4.8g葡萄糖，1.5g植物甾醇(粉碎粒徑D9?！?0微米)，Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0，其余為無菌水。培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(l"throw)200rpm溫度30。C生長時間45小時培養(yǎng)注解如果在底部有黃色細胞沉淀形成則表示為良好的培養(yǎng)物生物。方法在培養(yǎng)基中制備用于生物轉(zhuǎn)化的接種物。從瓊脂料面(在玻璃試管中培養(yǎng))接種錐形瓶，在無菌條件下進行接種，移取無菌水(5mL)到瓊脂抖面上.用移液管末端輕輕刮下細菌培養(yǎng)物.然后移取該混懸培養(yǎng)物并放入錐形瓶中.在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進行細菌增殖(200rpm，1〃throw,30度)。維持植物甾醇濃度在0.1%以上，在培養(yǎng)45小時后，過濾，用ra7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌，得到菌絲，即靜息細胞。在操作中，還可以針對種子進行二級乃至三級培養(yǎng)，得到更多的靜息細胞。3.2菌體靜息轉(zhuǎn)化方法甾體發(fā)酵轉(zhuǎn)化液(每升)pH為7.0的磷酸鹽緩沖液底物20.0g植物甾醇(2.0%)。靜息細胞量1L。余量的無菌水。無菌水用1MNaOH溶液(40g/LNaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至7.5，將轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)移至生物反應器中，隨后加熱至40-50°C。在燒杯中稱重植物甾醇全溶于N，N-二甲基甲酰胺中，倒入生物反應器中已加熱的轉(zhuǎn)化液中(40-50°C)，攪拌均勻，然后冷卻至3(TC，加入靜息細胞進行第一次轉(zhuǎn)化，保持該溫度進行生物轉(zhuǎn)化，通氣量0.3L/L/min，攪拌300rpm，轉(zhuǎn)化時間45小時；過濾得到濾液。過濾后轉(zhuǎn)化液合并后的AD和ADD的含量是表3中的含量。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注AD:ADD是AD峰面積除以ADD峰面積的值。實施例4菌種分枝桿菌-Mycobacteriumfortuiturn.NRRLB_8153。4.l靜息細胞培養(yǎng)方法靜息細胞培養(yǎng)基(每升)40ml玉米漿，5.2gNaN03，0.8gNH4H2P04，2g葡萄糖，1.5g植物甾醇(粉碎粒徑D9?！?0微米)，Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0，其余為無菌水。培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液。容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(l"throw)200rpm溫度30。C生長時間72小時培養(yǎng)注解如果在底部有黃色細胞沉淀形成則表示為良好的培養(yǎng)物生物。方法在培養(yǎng)基中制備用于生物轉(zhuǎn)化的接種物。從瓊脂料面(在玻璃試管中培養(yǎng))接種錐形瓶，在無菌條件下進行接種，移取無菌水(5mL)到瓊脂抖面上.用移液管末端輕輕刮下細菌培養(yǎng)物.然后移取該混懸培養(yǎng)物并放入錐形瓶中.在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進行細菌增殖(200rpm，1〃throw,30度)。在培養(yǎng)72小時后，維持植物甾醇濃度在0.1%以上，過濾，用ra7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌，得到菌絲，即靜息細胞。在操作中，還可以針對種子進行二級乃至三級培養(yǎng)，得到更多的靜息細胞。4.2菌體靜息轉(zhuǎn)化方法甾體發(fā)酵轉(zhuǎn)化液(每升)PH為7.5的磷酸鹽緩沖液。底物20.Og植物甾醇(2.0%)。靜息細胞量1L。余量的無菌水。無菌水用1MNaOH溶液(40g/LNaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至7.5，將轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)移至生物反應器中，隨后加熱至40-50°C。在燒杯中稱重植物甾醇10g全溶于乙醇中，倒入生物反應器中已加熱的轉(zhuǎn)化液中(40-50°C)，攪拌均勻，然后冷卻至30°C，加入靜息細胞進行第一次轉(zhuǎn)化，保持該溫度進行生物轉(zhuǎn)化，通氣量0.3L/L/min，攪拌300rpm，轉(zhuǎn)化時間45小時；過濾得到靜息細胞，再用ffl為7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌后再次按照第一次轉(zhuǎn)化的方法對剩余10g甾醇進行第二次轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時間為45小時，過濾得到的過濾液與第一次轉(zhuǎn)化過濾得到的過濾液合并。過濾后轉(zhuǎn)化液合并后的AD和ADD的含量是表1中的含量。表412345678910AD+ADD(%)76.777.177.076.576.776.576.677.076.876.9AD:ADD8,58.38.28.28.38.58.48.18.58.4注AD:ADD是AD峰面積除以ADD峰面積的值。實施例5菌種諾卡氏菌Nocardia.alienaMCI-0710(JP54067098,JP54067099中介紹)5.l靜息細胞培養(yǎng)方法靜息細胞培養(yǎng)基(每升)40ml玉米槳，5.8gNaN03，0.5gNH4H2P04，4.3g葡萄糖，Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0，其余為無菌水Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(l"throw)加Orpm溫度30。C生長時間50小時培養(yǎng)注解如果在底部有黃色細胞沉淀形成則表示為良好的培養(yǎng)物生物方法在培養(yǎng)基中制備用于生物轉(zhuǎn)化的接種物。從瓊脂料面(在玻璃試管中培養(yǎng))接種錐形瓶，在無菌條件下進行接種，移取無菌水(5mL)到瓊脂抖面上.用移液管末端輕輕刮下細菌培養(yǎng)物.然后移取該混懸培養(yǎng)物并放入錐形瓶中.在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進行細菌增殖(200rpm，1"throw,30度)。在培養(yǎng)50小時后，過濾，用無菌水洗滌，得到菌絲，即靜息細胞。在操作中，還可以針對種子進行二級乃至三級培養(yǎng)，得到更多的靜息細胞。5.2菌體靜息轉(zhuǎn)化方法甾體發(fā)酵轉(zhuǎn)化液(每升)底物15g植物甾醇(1.0%)粉碎粒徑Dg?！?0微米。靜息細胞量0.7L。余量11的無菌水。無菌水用1MNaOH溶液(40g/LNaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至7.5，將轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)移至生物反應器中，隨后加熱至40-50°C。在燒杯中稱重植物甾醇，倒入生物反應器中已加熱的轉(zhuǎn)化液中(40-5(TC)，攪拌均勻，然后冷卻至3(TC，加入靜息細胞，保持該溫度進行生物轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)時間60小時，通氣量0.4L/L/min，攪拌300rpm。60小時后轉(zhuǎn)化液中AD和ADD的含量是表5中的含量。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注AD:ADD是AD峰面積除以ADD峰面積的值。權(quán)利要求一種微生物靜息細胞降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮轉(zhuǎn)化工藝，步驟如下具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種的靜息細胞可直接或經(jīng)適當處理后，加入到植物甾醇轉(zhuǎn)化液中進行第一次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應，使轉(zhuǎn)化液中的植物甾醇轉(zhuǎn)化得到雄烯二酮/雄二烯二酮轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體細胞，將轉(zhuǎn)化液經(jīng)溶劑提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。2.如權(quán)利要求1所述，其特征在于第一次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應結(jié)束后，被去除的菌體細胞可以直接或經(jīng)適當處理后，加入到第二批植物甾醇轉(zhuǎn)化液中進行第二次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應，使轉(zhuǎn)化液中的植物甾醇轉(zhuǎn)化得到雄烯二酮/雄二烯二酮后，去除菌體細胞，將轉(zhuǎn)化液經(jīng)溶劑與第一次靜息細胞的轉(zhuǎn)化液合并，通過溶劑提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。3.如權(quán)利要求2所述，其特征在于第一次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應時間不超過45小時。4.如權(quán)利要求1所述，其特征在于微生物靜息細胞的制作工藝為將具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種接種到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液與菌體分離，所獲菌體沉淀作為靜息細胞。5.如權(quán)利要求1所述，其特征在于微生物靜息細胞的制作工藝為將具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種接種到含植物甾醇的培養(yǎng)液中，進行植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)，同時不斷添加底物植物甾醇到轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)液中，維持植物甾醇濃度在0.1%以上，轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)液與菌體分離，所獲轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)溶劑提取，得到雄烯二酮/雄二烯二酮，所獲菌體沉淀作為靜息細胞。6.如權(quán)利要求3或4所述，其特征在于靜息細胞培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基含有玉米漿或Refiner糖蜜、無機鹽，還可以增加糖，其中優(yōu)選玉米漿，無機鹽可以優(yōu)選磷酸銨和硝酸鈉，其比例優(yōu)選磷酸銨硝酸鈉為10:40-99，糖優(yōu)選葡萄糖，靜息細胞可以用磷酸緩沖液洗滌。7.如權(quán)利要求1所述，其特征在于植物甾醇可以進行粉碎或與溶劑混合后緩慢與轉(zhuǎn)化液混合，便于植物甾醇與靜息細胞接觸。8.如權(quán)利要求1所述，其特征在于微生物菌種的靜息細胞直接或經(jīng)適當處理加入到植物甾醇轉(zhuǎn)化液中，直接使用是指是微生物培養(yǎng)結(jié)束后，直接從培養(yǎng)液經(jīng)離心或過濾獲得的菌體沉淀；使用經(jīng)適當處理是指前述的菌體沉淀經(jīng)40-9(TC加熱處理一段時間后所獲得的死菌體；或是指前述的菌體沉淀經(jīng)任意一種已知的固定化方法處理所獲得的固定化菌體；或是指前述的菌體沉淀，通過細胞自溶、或細胞破碎等方法使酶釋放到溶液中，通過離心或過濾等方法除去菌體細胞碎片后，所得的細胞酶提取液，或經(jīng)硫酸按鹽析法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法等純化后的酶制劑。9.如權(quán)利要求1-8所述，其特征在于具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種為分支桿菌。10.如權(quán)利要求9所述，其特征在于降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種為NRRLB-3683，NRRLB_3805，NRRLB_8153。全文摘要一種采用靜息細胞的雄烯二酮生物發(fā)酵方法，具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌種的靜息細胞，加入到植物甾醇轉(zhuǎn)化液中進行第一次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應，使轉(zhuǎn)化液中的植物甾醇轉(zhuǎn)化得到雄烯二酮/雄二烯二酮轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體細胞，將轉(zhuǎn)化液經(jīng)溶劑提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。在第一次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應結(jié)束后，被去除的菌體細胞可以直接或經(jīng)適當處理后，加入到第二批植物甾醇轉(zhuǎn)化液中進行第二次靜息細胞轉(zhuǎn)化反應，使轉(zhuǎn)化液中的植物甾醇轉(zhuǎn)化得到雄烯二酮/雄二烯二酮后，去除菌體細胞，將轉(zhuǎn)化液經(jīng)溶劑與第一次靜息細胞的轉(zhuǎn)化液合并，通過溶劑提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。文檔編號C12R1/32GK101760494SQ20081015287公開日2010年6月30日申請日期2008年11月6日優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日發(fā)明者孫亮,李金祿,李靜申請人:天津金耀集團有限公司