專利名稱：以動(dòng)物血液為原料生產(chǎn)多肽-Fe技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從豬、牛及羊等動(dòng)物血液中提取血紅素蛋白和以血紅素蛋白為原料， 生產(chǎn)具有抗氧化功能性多肽-卟啉Fe的方法。其特征在于用于制備具有藥物性能的補(bǔ)鐵 劑和防貧血功能食品。
背景技術(shù)：
血紅素蛋白是一大類含有原卟啉IX作為輔基的金屬蛋白，根據(jù)血紅素輔基上連 接蛋白質(zhì)和金屬離子以及蛋白質(zhì)多肽鏈包裹血紅素的蛋白分子組成方式不同，而行使不同 的生物功能。鐵血紅蛋白是紅細(xì)胞中最主要的成分，它由珠蛋白和血紅素組成。血紅素分 子是一個(gè)具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子與一 個(gè)亞鐵離子配位結(jié)合，珠蛋白肽鏈中第8位一個(gè)組氨酸殘基中的吲哚側(cè)鏈上的氮原子從卟 啉分子平面的上方與亞鐵離子配位結(jié)合。 血紅素目前除了在食品行業(yè)常被用作著色劑外，在醫(yī)學(xué)臨床上也廣泛使用，用作 半合成膽紅素原料，和生產(chǎn)抗肝功能亢進(jìn)、抗炎癥作用和抗腫瘤作用的重要藥物和治療貧 血的血紅素補(bǔ)鐵劑。 蛋白質(zhì)在胃腸道消化酶的作用下，最終分解成寡肽和游離氨基酸。寡肽在吸收 上比游離氨基酸具有更多的優(yōu)越性，可被完整吸收進(jìn)入血液。血紅素蛋白的分解產(chǎn)物多 肽_卟啉鐵，具有較強(qiáng)的補(bǔ)鐵功效，還具有很強(qiáng)的抗氧化能力和保健作用。多肽_卟啉Fe 用作補(bǔ)鐵劑將有非常強(qiáng)的優(yōu)勢。 本課題組以動(dòng)物血液為原料，分離出血紅蛋白，利用真空輔助蛋白酶定向降解技 術(shù)，將血紅蛋白分解為固定鏈長的功能多肽-卟啉Fe ;通過絮凝技術(shù)，將目標(biāo)多肽-卟啉鐵 產(chǎn)品從水解產(chǎn)生的混合物中分離出來；用多肽-卟啉鐵產(chǎn)品制備具有抗衰老、抗氧化、消除 自由基、預(yù)防和治療貧血等功能的藥物以及用于治療貧血的藥品或具有特定功能的保健品 與各種特定功能的食品與飲料的添加劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種血紅蛋白的提取和血紅素蛋白定向切斷制備多肽-卟
啉鐵的方法。本發(fā)明血紅素蛋白的提取方法包括下述步驟 1)向新鮮的血液中加入抗凝劑，離心分離出紅細(xì)胞。 2)紅細(xì)胞破碎，血紅蛋白等電點(diǎn)沉淀，離心分離出血紅蛋白。 3)將限制性內(nèi)切酶與血紅蛋白混合，攪勻后，將體系放入真空環(huán)境中反應(yīng)。 4)將反應(yīng)到設(shè)定時(shí)間的體系從真空環(huán)境中取出，加入絮凝劑，離心得沉淀。 5)將離心得到的沉淀溶解后，向其中加入沉淀齊U，離出各種多肽-卟啉鐵產(chǎn)品。 血紅素蛋白與多肽-卟啉鐵的制備成功，可以為國民補(bǔ)鐵提供優(yōu)質(zhì)的有機(jī)鐵原
料，為解決我國龐大的動(dòng)物血液資源的高附加值利用提供有效途徑，為開發(fā)新的抗氧化物
質(zhì)提供指導(dǎo)。
具體實(shí)施例方式1.血紅蛋白的制備 A)向新鮮的豬血中加入抗凝劑，攪勻，3000r/min離心20min后，除去上層清液，得 紅細(xì)胞。 B)將紅細(xì)胞加入5倍體積的生理鹽水中，攪勻，超聲10min后，3000r/min離心 20min，棄上層液體，再加入5倍體積的生理鹽水重復(fù)洗滌三次，最后一次以3000r/min離心 20min，倒去上層清液，得固體。 C)向上述所得的固體中加入等體積蒸餾水和0.5倍體積的四氯化碳，超聲10min， 3000r/min離心15min，倒出上層清液，真空蒸發(fā)，得血蛋白固體，置于4t:冰箱保存。
2.血紅蛋白的分解與多肽-Fe的制備 A)取一定量1(C)步驟中制備的血紅蛋白溶液，加入O. lmol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)ra值 至8. O，加熱煮沸10min，自然冷卻到室溫。 B)將(A)制得的溶液放入37. 5"恒溫箱中恒溫5h，加入限制性內(nèi)切酶，在37. 5°C 恒溫下攪拌水解10h，在反應(yīng)過程中，通過補(bǔ)加0. lmol/LNaOH溶液保證溶液的ffl值維持在 7. 6 8. 0。 C)向(B)所得的溶液中加入特定絮凝劑，待沉淀物不增加，過濾得固體多肽-卟啉 鐵混合物。濾液備提取多肽用。 D)將(C)所得的固體溶解于蒸餾水中，加入特定的鹽，當(dāng)有固體析出時(shí)，微調(diào)溶液 中離子強(qiáng)度，保證固體析出至不再增加，過濾，得產(chǎn)品(P 13肽_卟啉鐵)。
E)將(D)所得的濾液用透析袋透析，除去溶液中的無機(jī)離子，加入沉淀劑，析出沉 淀，過濾，干燥，得產(chǎn)品(a29肽-卟啉鐵)。 F)將(C)所得的濾液用孔徑大小不一的透析袋進(jìn)行梯度過濾，得到分子量不同的 肽。
權(quán)利要求
一種從豬、牛及羊等動(dòng)物血液中提取血紅素蛋白，再以血紅素蛋白為原料，生產(chǎn)具有抗氧化功能性肽-Fe產(chǎn)品。血紅素蛋白和各種肽-Fe產(chǎn)品都是重要的醫(yī)藥原料和食品添加劑，可以用于制備補(bǔ)鐵劑藥物和防貧血食品。
2. 權(quán)利要求1所述的從豬、牛及羊等動(dòng)物血液中提取血紅素蛋白方法，其特征在于它 包括下述步驟血液抗凝血處理，離心分離紅細(xì)胞，紅細(xì)胞破碎、等電點(diǎn)沉淀，離心分離血紅 素蛋白。
3. 權(quán)利要求2所述的血液抗凝血處理和離心分離紅細(xì)胞是向剛從動(dòng)物體內(nèi)放出的血 液中加入凝血?jiǎng)瑪噭蚓鶆蚝?，離心沉淀分離，得到紅細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求2所述的紅細(xì)胞破碎、等電點(diǎn)沉淀，離心分離血紅素蛋白是將3所得的紅細(xì) 胞攪碎，向溶液中加入離子沉淀劑，離心分離得到血紅素蛋白。
5. 權(quán)利要求l所述的再以血紅素蛋白為原料，生產(chǎn)具有抗氧化功能性肽-Fe方法，其特 征在于它包括下述步驟血紅素蛋白真空-酶定向降解、絮凝沉淀與離心分離、肽-Fe的分 離與純化。
6. 權(quán)利要求5所述的血紅素蛋白真空_酶定向降解方法，是向血紅素蛋白溶液中加 入限制性內(nèi)切酶，選擇性將肽鏈從賴氨酸和精氨酸的羧基端切斷，生成大小不一的多肽及 肽-鐵產(chǎn)物。
7. 權(quán)利要求5所述的絮凝沉淀與離心分離是向降解后的肽-Fe與肽混合物中加入特異 性絮凝劑，使目標(biāo)肽-Fe產(chǎn)物沉淀出來。
8. 權(quán)利要求5所述的肽-Fe的分離與純化是應(yīng)用目標(biāo)肽-Fe自身特性，通過調(diào)節(jié)溶液 的離子強(qiáng)度將其分離出來。
全文摘要
本發(fā)明涉及從豬、牛、羊等動(dòng)物血液中提取血紅蛋白，再以血紅蛋白為原料，生產(chǎn)具有抗氧化功能性肽-Fe產(chǎn)品。豬、牛、羊等動(dòng)物血液是畜產(chǎn)品加工企業(yè)的副產(chǎn)物，其中含有大量的血紅素蛋白。將新鮮動(dòng)物血液進(jìn)行抗凝處理，分離出紅細(xì)胞；應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀和離心分離技術(shù)處理紅細(xì)胞，得到血紅素蛋白；血紅素蛋白經(jīng)真空-蛋白酶定向降解，生成大小不同的肽-卟啉鐵及肽鏈；通過絮凝沉淀，離心分離得到肽-卟啉鐵混合物。應(yīng)用離子強(qiáng)度沉淀法分離出目標(biāo)產(chǎn)品α29肽-卟啉鐵和β13肽-卟啉鐵。此類肽-卟啉鐵的水溶性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，具有補(bǔ)鐵與抗氧化雙重功效。
文檔編號C12P21/06GK101747408SQ20081015396
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者劉安軍, 王丹, 胡祥正, 陳汝潔 申請人:天津科技大學(xué)