專利名稱：：一種生產(chǎn)α-干擾素的純化方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及生物制劑領域，更具體地說，是涉及一種用于生產(chǎn)豬a-干擾素的純化方法。
背景技術(shù)：
：'干擾素(IFN)是一類具有廣泛生物學活性的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。IFN的抗病毒活性是通過宿主細胞而間接完成的，并具有嚴格的種屬特異性及選擇性。根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)，IFN可分為a、p、y三種類型，近年來，還發(fā)現(xiàn)了(0、t等類型的干擾素。IFN—a主要由單核細胞產(chǎn)生；IFN—P主要由纖維母細胞產(chǎn)生，血管內(nèi)皮細胞也可產(chǎn)生；IFN-，由抗原及PHA等有絲分裂原刺激T細胞后產(chǎn)生，此外，NK細胞也可產(chǎn)生。IFN—t是反芻動物孕體附植時滋養(yǎng)層細胞分泌的特有的妊娠識別信號因子，在妊娠識別中發(fā)揮著重要的作用。豬干擾素是被研究最早的動物干擾素之一，20世紀80年代就有豬干擾素的相關(guān)報道。近年來，對豬干擾素的誘導條件和理化活性有了進一步的研究，同時對豬白細胞干擾素進行了大量的臨床試驗。研究表明，它對豬的許多病毒性傳染病，如流行性腹瀉、豬瘟、傳染性胃腸炎等，以及對牛病毒性腹瀉、小鵝瘟，羔羊腹瀉等都具有不錯的療效，試驗證實豬干擾素與牛羊等動物之間存在交叉活性。最近幾年，豬干擾素a、p、y基因的分子克隆與序列分析獲得成功。謝海燕等采用PCR技術(shù)克隆得到的IFN—a基因由501個核苷酸組成，共編碼166個氨基酸；夏春等克隆得到的豬卩干擾素IFN—(3基因片段有668個核苷酸，編碼186個氨基酸。曹瑞兵等從經(jīng)CoriA誘導培養(yǎng)的豬外周血白細胞中擴增出豬IFNi基因，經(jīng)改造后插入原核表達載體PRLG，并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達，表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)變性、復性、脫鹽、凝膠層析純化處理，重組豬IFNi具有較高的干擾素活性。同時，萬建青、陳濤等分別成功地在畢赤酵母表達系統(tǒng)和大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達出重組干擾素基因，表達產(chǎn)物占菌體總蛋白的比率在20%35%之間，表達產(chǎn)物具有的抗病毒活性，為基因工程干擾素的規(guī)模化生產(chǎn)和應用提供了可能。目前，生產(chǎn)動物用的干擾素(如豬干擾素)的常見方法有在動物體內(nèi)提取、構(gòu)建基因工程菌株表達生產(chǎn)。其中利用重組菌株表達生產(chǎn)干擾素，具有表達量高、抗病毒活性強的優(yōu)點。因此，成為了干擾素批量生產(chǎn)的趨勢。但是，利用重組菌株表達生產(chǎn)干擾素，在后期的分離純化過程中一般都要使用價值昂貴的單抗柱，純度才能達到95%以上；而目前國產(chǎn)的單抗柱，無論在產(chǎn)量和質(zhì)量上，都不能滿足廠家的需要，而只能高價進口，增加生產(chǎn)成本。因此，目前需要一種經(jīng)濟、快速、高效地的純化方法，以用于生產(chǎn)干擾素。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種經(jīng)濟、快速、高效的a-干擾素純化方法。因此，本發(fā)明目的在于提供一種a-干擾素純化方法，步驟包括(1)重組菌株進行發(fā)酵；(2)離心發(fā)酵液(6000rpm，離心15min)取上清，通過微濾除雜、超濾濃縮；(3)用醋酸調(diào)節(jié)濃縮液的pH至5，并過陽離子層析柱(CMSephamse柱層析)，收集0.45mol/L的目標洗脫峰；(4)加入硫酸銨30。/。(v/v)至稍混濁，離心取上清(7000rpm,離心10min);(5)過SephacrylS-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰；(6)過SephadexG-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液；(7)得到純度高于97%的干擾素原液，置于4。C冰箱保存。在一個具體實施方案中，在實施步驟5之前，先去熱原，用50mmol/L，pH5.5的醋酸緩沖液平衡，上樣。其中，去熱源的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸堿法、其它方法等。其中，優(yōu)選是吸附法。在另一具體實施方案中，在實施步驟6之前，將充分浸泡后的SephadexG-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7.0的PBS緩沖液平衡，上樣。其中，去熱源的方法優(yōu)選吸附法。應當指出，本發(fā)明目的不在于提供一種具體的重組菌株來生產(chǎn)(X干擾素，而是提供對重組菌株的產(chǎn)物進行純化，以獲得高純度的(x干擾素產(chǎn)品。因此所述的重組菌株可包括各種常規(guī)的重組菌株，例如大腸桿菌工程菌、酵母(如畢赤酵母)工程菌、重組病毒。本發(fā)明優(yōu)選酵母工程菌。應當指出，本發(fā)明目的不在于提供一種特定(x干擾素的純化方法，而是提供常規(guī)a干擾素類型進行純化，以獲得高純度的a干擾素產(chǎn)品。因此所述的a干擾素可包括各種動物用a干擾素，例如畜用a干擾素、禽類a干擾素、魚類a干擾素。本發(fā)明優(yōu)選豬a干擾素。術(shù)語"熱原"系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。它包括細菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學熱原等。這里所指的"熱原"，主要是指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產(chǎn)物、細菌尸體及內(nèi)毒素。致熱能力最強的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽性桿5菌類，革蘭陽性球菌則較弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。熱原通常是磷脂多醇與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復合物。磷脂多醇是復合物的活性中心，致熱作用最強。其化學組成因菌種不同而有所差異。分子量為5xl045xl05，分子量越大致熱作用也越強。去熱原的方法包括1.高溫法熱原的耐熱性能良好，60。C加熱lh不被分解破壞，IO(TC不降解，但180。C34h、20(TC60min或25(TC3045min可使熱原徹底破壞。因此耐熱物品如玻璃制品、金屬制品、生產(chǎn)過程中所用的容器和其它用具以及注射時使用的注射器等，均可采用此法破壞熱原。但在通常使用的注射劑熱壓滅菌條件下不足以破壞熱原。2.吸附法熱原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性質(zhì)穩(wěn)定、吸附性強兼具助濾和脫色作用，故廣泛用于注射劑生產(chǎn)，但應注意吸附藥液所造成的主藥的損失。3.超濾法熱原分子量為&106左右，體積較小，約15nm，可以通過一般濾器和微孔濾膜，但采用超濾法如用3.015nm超濾膜可將其除去。4.蒸餾法熱原能溶于水但不揮發(fā)，但可隨水蒸氣的霧滴進入注射用水中，因此制備注射用水時，原水中的熱原可經(jīng)蒸餾除去，但需多次蒸餾，，并加有隔沫裝置，單次蒸餾往往效果不理想。5.酸堿法熱原能被強酸、強堿、強氧化劑破壞。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、輸液瓶等可用重鉻酸鉀硫酸清潔液或稀氫氧化鈉處理，破壞熱原。6.其它包括離子交換法、凝膠濾過法、反滲透法等。有益效果本發(fā)明提供的重組菌株表達干擾素的后續(xù)純化方法，無需使用價格昂貴的單抗柱，避免了單抗脫落造成的污染，縮短了純化時間，降低了生產(chǎn)成本，最終可得到純度高于97%的干擾素原液，在工業(yè)生產(chǎn)中應用將會帶來良好的經(jīng)濟效益。具體實施方案下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述。實施例l:重組酵母表達豬a-干擾素的純化(1)重組菌株進行發(fā)酵；(2)離心發(fā)酵液(6000rpm，離心15min)取上清，通過微濾除雜、超濾濃縮；(3)用醋酸調(diào)節(jié)濃縮液的pH至5，并過陽離子層析柱(CMSepharose柱層析)，收集0.45mol/L的目標洗脫峰；(4)加入硫酸銨30。/。(v/v)至稍混濁—離心取上清(7000rpm，離心10min);(5)先去熱原，用50mmol/L，pH5.5的醋酸緩沖液平衡，過SephacrylS-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰，其中通過吸附法進行去熱原；(6)將充分浸泡后的SephadexG-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7.0的PBS緩沖液，過SephadexG-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液，其中通過吸附法進行去熱原；(7)得到純度高于97%的干擾素原液，置于4。C冰箱保存。實施例2:豬(X-干擾素的活性測試對重組酵母表達豬a-干擾素的后續(xù)純化結(jié)果(取3批)進行檢測(1)生物活性檢測采用半數(shù)細胞抑制病變法，應用VSV-MDBK系統(tǒng)。參照《中華人民共和國藥典》2005年版。(2)SDS-PAGE測產(chǎn)品的純度分離膠15%，濃縮膠5%，上樣量IO嗎，考馬斯亮藍250染色。G)HPLC分析產(chǎn)物純度采用C18柱，柱長250mmx4.6mm，以0-70%乙腈-0.1。/。TFA做線性梯度洗脫。實驗結(jié)果如下表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明所得到的三批豬a-干擾素的純度均高于97%，且活性均達到107IU/mL以上。通過上述實施例，我們發(fā)現(xiàn)所純化的a干擾素具有預期的活性，在此活性范圍內(nèi)能有效的保護正常機體細胞免受豬藍耳病病毒的感染。并且本發(fā)明的純化方法無需使用價格昂貴的單抗柱，避免了單抗脫落造成的污染，縮短了純化時間，降低了生產(chǎn)成本，最終可得到純度高于97%的干擾素，具有廣闊的應用市場。權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)α-干擾素的純化方法，步驟包括(1)重組菌株進行發(fā)酵；(2)離心發(fā)酵液(6000rpm，離心15min)取上清，通過微濾除雜、超濾濃縮；(3)用醋酸調(diào)節(jié)濃縮液的pH至5，并過陽離子層析柱(CMSepharose柱層析)，收集0.45mol/L的目標洗脫峰；(4)加入硫酸銨30％(v/v)至稍混濁，離心取上清(7000rpm，離心10min)；(5)過SephacrylS-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰；(6)過SephadexG-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液；(7)得到純度高于97％的干擾素原液，置于4℃保存。2、權(quán)利要求1所述的方法，其中在實施步驟5之前，先去熱原，用50mmol/L，pH5.5的醋酸緩沖液平衡，上樣。3、權(quán)利要求2所述的方法，其中去熱原的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸堿法、其它方法等，優(yōu)選是吸附法。4、權(quán)利要求1所述的方法，其中在實施步驟6之前，將充分浸泡后的SephadexG曙75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7.0的PBS緩沖液平衡，上樣。5、權(quán)利要求4所述的方法，其中去熱原的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸堿法、其它方法等，優(yōu)選是吸附法。6、權(quán)利要求1—5中任一項所述的方法，其中所述的重組菌株大腸桿菌工程菌、酵母(如畢赤酵母)工程菌、重組病毒，優(yōu)選酵母工程菌。7、權(quán)利要求1_5中任一項所述的方法，其中所述的a干擾素畜用a干擾素、禽類a干擾素、魚類a干擾素，優(yōu)選豬a干擾素。全文摘要本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)α-干擾素的純化方法，包括發(fā)酵、粗提發(fā)酵液、陽離子層析柱純化、硫酸銨純化、SephacrylS-200層析柱純化、SephadexG-75色譜柱純化等步驟，其中在層析之前先去熱原。本發(fā)明方法無需要單克隆抗體層析柱，能經(jīng)濟、快速、高效地的純化獲得純度高于97％α-干擾素，具有廣闊的應用前景。文檔編號C12P21/04GK101475975SQ200810153999公開日2009年7月8日申請日期2008年12月11日優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日發(fā)明者李旭東,王麗娟,蘇建東申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司