專利名稱：：一種檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及臨床體外診斷試劑應用
技術領域：
，特別是涉及一種定量檢測血清(漿)中葉酸濃度的試劑盒。
背景技術：
：目前測定血清(漿)葉酸濃度的的商品試劑盒均以化學發(fā)光免疫和放射免疫法為基本原理，價格較高，而且測定結果不能完全反映具有生物學活性的葉酸成份。在醫(yī)學領域應用，不僅增加患者經濟負擔，而且容易使醫(yī)生對患者的葉酸營養(yǎng)狀況作出錯誤的判斷。《衛(wèi)生研究》第32巻，第1期，56，2003年1月，皇甫照；王毓明；鄭家駒."96孔板微生物法微量測定血漿和紅細胞內葉酸含量"其使用的材料葉酸培養(yǎng)基、葉酸標準品、干酪乳酸桿菌、丙三醇、96子L細胞培養(yǎng)板、免疫酶聯(lián)測定儀；測定方法-準備樣品分離血清，-20°保存直到測定。準備檢測用的微生物Lcasei(NCIB10463)，微孔板測定步驟用新配制的0.5%抗壞血酸鈉溶液稀釋血清(按1:20)和紅細胞(按1:40)?；靹?，加入4個孔(2個孔分別加IOO微升、另兩孔分別加50微升)用50微升0.5%抗壞血酸鈉將所有的孔補償至100微升。稀釋的紅細胞溶解液。測定標準品葉酸標準溶液(500pg/ml)是用0.5%抗壞血酸鈉稀釋的。加入這種標準品使每個孔葉酸含量范圍在0至50pg(0-100微升)，所有孔的液體體積用0.5抗壞血酸鈉補足至100微升。培養(yǎng)基:蒸餾水中加入5.7克葉酸培養(yǎng)基干粉、3毫克氯霉素、30微升吐溫-80，配成100毫升培養(yǎng)基?；靹蚝?，加熱至沸，冷卻后，每百毫升培養(yǎng)基加入75毫克抗壞血酸。最后，加入上述的檢測用微生物。邊攪拌邊向微孔板的每個微孔中加入200微升培養(yǎng)基。額外做一個加入了異丙醇消毒劑(1:25)的微孔作為檢測時的空白對照孔。所有的微孔板用封口膜封緊后，顛倒混勻，在暗處37°孵育42小時。然后充分顛倒混勻，揭去封口膜，使用570nm波長檢測。方法使用氯霉素耐藥株(NCIB10463)避免了無菌操作節(jié)省了時間。封閉了微孔板使混合操作變得容易。評價測試方法的性能包括葉酸回收率、測定的重復性和對葉酸濃度的劑量反應。獲得的193個血清、150個紅細胞葉酸結果與傳統(tǒng)的微生物方法對比。結果回收率很好，血清葉酸的批間和批內精密度均小于5%，紅細胞葉酸也小于5%。等摩爾測定反應采用葉酸、5-甲基四氫葉酸和5-甲酰四氫葉酸。微量測定與傳統(tǒng)的方法相關良好，相關系數分別為0.975(血清)和0.96(紅細胞)。結論:該法比傳統(tǒng)方法更緊湊、耗時更少。尤其對臨床常規(guī)實驗室更經濟和更易操作。但是現(xiàn)有的微孔板微生物培養(yǎng)法測定血清葉酸的操作方法，標準溶液濃度較低，培養(yǎng)基濃度較高，因此在臨床診斷中應用需要將血清預先稀釋，操作較繁瑣。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術的96孔板微生物法微量測定血漿和紅細胞內葉酸含量試劑存在的問題，提供一種成本低廉、操作簡便，適合婦幼機構大范圍開展葉酸營養(yǎng)篩査的檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒方便使用。為達到本發(fā)明的目的根據耐受青霉素的干酪乳酸菌生長需要葉酸作為其必需營養(yǎng)物質的原理設計的檢測方法，并將測試所需的必要試劑經合理搭配組裝成盒，該試劑是一種基于96孔微量反應板并應用免疫酶聯(lián)測定儀比濁測定進行定量測定的葉酸檢測方法。提供一種檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒，包括檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑瓶及放置試劑瓶的盒蓋5、盒底6，其特征在于，該試劑盒內含有6個葉酸標準品的濃度分別為0微克/升、4微克/升、8微克/升、12微克/升、16微克/升、20微克/升，每個標準品溶液均含0.5%抗壞血酸鈉的葉酸標準品瓶1;2個每百毫升水溶液含有葉酸酪蛋白培養(yǎng)基干粉4.7的克葉酸培養(yǎng)基瓶4;1個含40%甘油的干酪乳酸菌溶液瓶2;1個濃度為3%的疊氮鈉水溶液瓶3、數個微孔板封口所述的檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒，其特征是檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒使用方法是試劑組成g、培養(yǎng)基溶液15mlX2m、葉酸標準溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>n、微孔板封口膜2張z、3%疊氮鈉溶液lmly、干酪乳酸菌溶液lml實驗材料-微孔容量至少300微升的96孔細胞培養(yǎng)板，并且內壁潔凈能夠用于組織細胞培養(yǎng)；免疫酶聯(lián)測定儀；微孔容量至少30微量？加樣器要求能夠準確加樣5微升；與微量加樣器相匹配的吸頭要求一次性使用，不可復用；標本收集和保存葉酸對光敏感，標本采集和保存過程中盡量減少光暴露。推薦測定血清葉酸，不要使用EDTA抗凝血漿，血清標本室溫保存不宜超過8小時；8小時內如不能測定，需蓋緊蓋子并置2-8'C冰箱保存標本；如48小時內不能完成測定，則需將血清標本冷凍于-20。C以下；標本只能凍融一次，融化后需充分混勻；冰凍標本可在無霜冷柜保存30天；如需保存30天以上，則需冷凍于-8CTC以下；測定前請確認標本無纖維蛋白或其它顆粒物質，無氣泡；測定步驟1)在室溫下融化實驗所需試劑；2)每15ml培養(yǎng)基加干酪乳酸菌溶液90"l，混勻備用；3)在微孔板中分別加入各濃度葉酸標準液5ul，空白孔加標準液"A"5yl，樣品孔加待檢血清5ul;4)在空白孔內加入5ul疊氮鈉溶液；5)所有檢測孔中加入280ul已混合干酪乳酸菌溶液的培養(yǎng)基；6)用封口膠嚴密封堵微孔板各孔，不可留有縫隙；7)置37"C環(huán)境孵育18小時后，充分混勻，撕下封口膠，靜置30秒，確認各孔內無氣泡后，于免疫酶聯(lián)測定儀580-620nm比濁測定；選擇適當的標準曲線擬合方式計算待檢血清(漿)的葉酸濃度；如果待檢樣品的葉酸濃度超過標準曲線范圍，需要將待檢樣品用標準溶液"A"適當稀釋后重新測定，結果乘以樣品的稀釋倍數?，F(xiàn)有的微孔板微生物培養(yǎng)法測定血清葉酸的操作方法，標準溶液濃度較低，培養(yǎng)基濃度較高，因此需要將血清預先稀釋，操作較繁瑣。本發(fā)明將葉酸標準液的濃度設定為0微克/升、4微克/升、8微克/升、12微克/升、16微克/升、20微克/升，同時將"葉酸酪蛋白培養(yǎng)基"濃度降低至4.7%，將樣本加入量設定為5微升，將加培養(yǎng)基加入量設定為250至300微升。這樣無需預先稀釋血清(漿)樣本，而可直接加樣測試，簡化了步驟，易于操作。本發(fā)明的有益效果是，解決了以往微生物法測定血清葉酸過程中需要預先稀釋血清(漿)再行檢測的繁瑣過程、同時縮短了檢測時間。本試劑盒的研制，填補了國內微生物法檢測葉酸濃度的商品化體外診斷試劑的空白，該試劑盒成本低廉，有望在相關人群的葉酸營養(yǎng)評價中大規(guī)模應用。本試劑盒所使用的方法是根據干酪乳酸菌青霉素耐藥株的生長需要葉酸作為營養(yǎng)物質，在一定時間內干酪乳酸菌生長的多少與被檢物葉酸含量呈一定函數關系的原理測定葉酸濃度的。該法應用至今己有五十多年，具有很高的靈敏度和準確度、成本低、能反映具有生物活性的葉酸含量等優(yōu)點，但也存在操作繁瑣、試劑消耗量大等缺點，因而至今沒有基于這種檢測原理的商品化試劑盒供醫(yī)院、科研院所等單位使用。圖l為本發(fā)明的檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒結構示意圖；附圖符號說明1:葉酸標準液瓶2:干酪乳酸菌溶液瓶3:疊氮納溶液瓶4:葉酸培養(yǎng)基溶液瓶5:試劑盒的盒蓋6:試劑盒的盒底7:微孔板封口膜具體實施例方式圖1為本發(fā)明的檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒結構示意圖；如圖1所示，一種定量檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒。盒體內設置有6個葉酸標準液瓶、1個干酪乳酸菌液瓶、1個防腐劑液體瓶、2個培養(yǎng)基瓶和2張微孔板封口膜。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是選擇葉酸標準液濃度的范圍，使其與大多數人的血清(漿)葉酸濃度相近；降低待檢血清(漿)的加入量，在有效控制測量誤差的情況下，又使葉酸的檢測不致因血清(漿)內的干擾物質因濃度過大(稀釋不足)而對檢測結果產生干擾。這樣就使得被檢血清(漿)無需預先稀釋而可直接加樣檢測，簡化了操作步驟，同時，培養(yǎng)時間控制在18小時。使用時先將培養(yǎng)基和干酪乳酸菌液按適當比例混勻；在潔凈無雜質干擾物的96孔微孔板的微孔內分別加入5微升標準液("0"標準液做2個孔)和待檢血清(漿)；然后再加入已混入菌液的培養(yǎng)基液體250至300微升；在其中一個"0"標準液孔內加5微升防腐劑作為"空白孔"；用封口膠紙將微孔板口封嚴；置37。C溫箱保溫18至30小時；然后混勻培養(yǎng)物，揭去封口膜；用酶標儀測量各孔濁度，根據標準曲線計算標本的葉酸含量。本發(fā)明解決現(xiàn)有的微孔板微生物培養(yǎng)法測定血清葉酸的操作方法其技術問題所采用的技術方案是選擇葉酸標準液濃度的范圍，使其與大多數人的血清(漿)葉酸濃度相近；降低待檢血清(槳)的加入量，在有效控制測量誤差的情況下，又使葉酸的檢測不致因血清(漿)內的干擾物質因濃度過大(稀釋不足)而對檢測結果產生干擾。這樣就使得被檢血清(槳)無需預先稀釋而可直接加樣檢測，簡化了操作步驟，同時，培養(yǎng)時間控制在18小時。本試劑盒組成成份為①葉酸培養(yǎng)基成分為每百毫升水溶液含有"葉酸酪蛋白培養(yǎng)基干粉"(BDDifcoFolicAcidCaseiMedium)4.7克、"抗壞血酸"50毫克、"抗壞血酸鈉"167毫克；②六個不同濃度的葉酸標準品溶液葉酸濃度分別為0微克/升、4微克/升、8微克/升、12微克/升、16微克/升、20微克/升，每個標準品溶液均含0.5%抗壞血酸鈉；③含40%甘油保護劑的干酪乳酸菌溶液；④3X疊氮鈉水溶液；⑤微孔板封口膜。本發(fā)明檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒使用說明測定原理葉酸是干酪乳酸菌(Lactobacilluscasei，L.C，ATCC7469)生長所必需的營養(yǎng)素。在一定條件下，L.C的生長繁殖與培養(yǎng)基中葉酸含量呈正比關系，細菌增殖的量以光密度值計，通過與標準曲線相比較，計算出樣品中葉酸的含量。試劑組成1.培養(yǎng)基溶液15mlX23.微孔板封口膜2張4.3%疊氮鈉溶液lml5.干酪乳酸菌溶液lml需自備的實驗材料-1!微孔板96孔細胞培養(yǎng)板，要求微孔容量至少300微升，并且內壁潔凈能夠用于組織細胞培養(yǎng)；2.微量加樣器要求能夠準確加樣5微升；3.與微量加樣器相匹配的吸頭要求一次性使用，不可復用；4.免疫酶聯(lián)測定儀。標本收集和保存-葉酸對光敏感，標本采集和保存過程中盡量減少光暴露。推薦測定血清葉酸，不要使用EDTA抗凝血漿。血清標本室溫保存不宜超過8小時；8小時內如不能測定，需蓋緊蓋子并置2-8'C冰箱保存標本；如48小時內不能完成測定，則需將血清標本冷凍于-2(TC以下。標本只能凍融一次，融化后需充分混勻。冰凍標本可在無霜冷柜保存30天。如需保存30天以上，則需冷凍于-80'C以下。測定前請確認標本無纖維蛋白或其它顆粒物質，無氣泡。測定步驟1.在室溫下融化實驗所需試劑。2.每15ml培養(yǎng)基加干酪乳酸菌溶液90"l，混勻備用。3.在微孔板中分別加入各濃度葉酸標準液5u1，空白孔加標準液"A"5ul，樣品孔加待檢血清5ul。4.在空白孔內加入5ul疊氮鈉溶液。5.所有檢測孔中加入280P1已混合干酪乳酸菌溶液的培養(yǎng)基。6.用封口.膠嚴密封堵微孔板各孔，不可留有縫隙。7.置37。C環(huán)境孵育18-30小時后，充分混勻，撕下封口膠，靜置30秒，確認各孔內無氣泡后，于酶標儀580-620mn比濁測定。選擇適當的標準曲線擬合方式計算待檢血清(漿)的葉酸濃度。如果待檢樣品的葉酸濃度超過標準曲線范圍，需要將待檢樣品用標準溶液"A"適當稀釋后重新測定，結果乘以樣品的稀釋倍數。參考范圍大于5.3pg/L。建議不同地區(qū)的實驗室建立自己的正常人群葉酸濃度參考范圍。注意事項1.本培養(yǎng)基全部液體組分需冰凍保存，凍融次數不宜超過三次。2.本實驗不需在無菌環(huán)境下操作，但操作環(huán)境應盡量清潔。3.融化試劑的溫度不宜超過37。C。4.標本的葉酸濃度超過標準曲線范圍時應將標本用血清稀釋液稀釋后再測定。5.干酪乳酸菌是微嗜氧菌，因此在培養(yǎng)時必須用封口膠將微孔板封嚴，不可透氣。6.使用過的微孔不可再次使用。7.雖然干酪乳酸菌對人體沒有致病性，但對實驗物品也應按照生物安全規(guī)范妥善處置。8.本培養(yǎng)基在冰凍條件下可至少保存六個月。權利要求1、一種檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒，包括檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑瓶及放置試劑瓶的盒蓋5、盒底6，其特征在于，該試劑盒內含有6個葉酸標準品的濃度分別為0微克/升、4微克/升、8微克/升、12微克/升、16微克/升、20微克/升，每個標準品溶液均含0.5％抗壞血酸鈉的葉酸標準品瓶1；2個每百毫升水溶液含有葉酸酪蛋白培養(yǎng)基干粉4.7的克葉酸培養(yǎng)基瓶4；1個含40％甘油的干酪乳酸菌溶液瓶2；1個濃度為3％的疊氮鈉水溶液瓶3、數個微孔板封口膜7。2、根據權利要求1所述的檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒，其特征是檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒使用方法是試劑組成g、培養(yǎng)基溶液15mlX2m、葉酸標準溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>n、微孔板封口膜2張z、3%疊氮鈉溶液lmly、干酪乳酸菌溶液lml實驗材料微孔容量至少300微升的96孔細胞培養(yǎng)板，并且內壁潔凈能夠用于組織細胞培養(yǎng)；免疫酶聯(lián)測定儀；微孔容量至少30微量加樣器要求能夠準確加樣5微升；與微量加樣器相匹配的吸頭要求一次性使用，不可復用；標本收集和保存葉酸對光敏感，標本采集和保存過程中盡量減少光暴露。推薦測定血清葉酸，不要使用EDTA抗凝血漿，血清標本室溫保存不宜超過8小時；8小時內如不能測定，需蓋緊蓋子并置2-8'C冰箱保存標本；如48小時內不能完成測定，則需將血清標本冷凍于-2(TC以下；標本只能凍融一次，融化后需充分混勻；冰凍標本可在無霜冷柜保存30天；如需保存30天以上，則需冷凍于-80'C以下；測定前請確認標本無纖維蛋白或其它顆粒物質，無氣泡；測定步驟1)在室溫下融化實驗所需試劑；2)每15ml培養(yǎng)基加干酪乳酸菌溶液90ul，混勻備用；3)在微孔板中分別加入各濃度葉酸標準液5ul，空白孔加標準液"A"5Ul，樣品孔加待檢血清5yl;4)在空白孔內加入5ul疊氮鈉溶液；5)所有檢測孔中加入280nl已混合干酪乳酸菌溶液的培養(yǎng)基；6)用封口膠嚴密封堵微孔板各孔，不可留有縫隙；7)置37。C環(huán)境孵育18小時后，充分混勻，撕下封口膠，靜置30秒，確認各孔內無氣泡后，于免疫酶聯(lián)測定儀580-620nm比濁測定；選擇適當的標準曲線擬合方式計算待檢血清(漿)的葉酸濃度；如果待檢樣品的葉酸濃度超過標準曲線范圍，需要將待檢樣品用標準溶液"A"適當稀釋后重新測定，結果乘以樣品的稀釋倍數。全文摘要本發(fā)明屬于試劑裝置的
技術領域：
，特別是涉及一種檢測血清(漿)葉酸濃度的試劑盒，其是根據干酪乳酸菌青霉素耐藥株(ATCC7469)生長需要葉酸作為其必需營養(yǎng)物質的原理設計的檢測方法，并將測試所需的必要試劑經合理搭配組裝成盒，方便使用，其葉酸標準系列溶液的濃度分別為0、4、8、12、16、20微克/升，被檢樣品無需預先稀釋，直接加樣5微升即可測定，在盒體內設有培養(yǎng)基瓶、葉酸標準液瓶、干酪乳酸菌液瓶、防腐劑液體瓶。該試劑是一種基于96孔微量反應板并應用免疫酶聯(lián)測定儀比濁測定進行定量測定的葉酸檢測方法，該方法檢測葉酸成本低廉、操作簡便，適合婦幼機構大范圍開展葉酸營養(yǎng)篩查。文檔編號C12Q1/02GK101430330SQ20081015417公開日2009年5月13日申請日期2008年12月17日優(yōu)先權日2008年12月17日發(fā)明者濤葉申請人:濤葉