專利名稱：重組人干擾素α2b DNA片段及編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組人干擾素DNA片段及編碼的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
干擾素a (interferon, IFNa)是一種細(xì)胞因子，具有抗腫瘤增生、抗病毒等生物活性， 在炎癥、病毒和惡性腫瘤等方面具有顯著療效。采用分子生物學(xué)及DNA重組技術(shù)，已經(jīng)研
發(fā)上市了重組人干擾素。但是人干擾素a2b作為藥物，并沒(méi)有達(dá)到最大優(yōu)化，有的人干擾 素a2b其比活不夠高，也有的可溶性程度不高。人們不斷應(yīng)用新方法和技術(shù)，對(duì)人干擾素 a2b進(jìn)行改造，試圖尋找和發(fā)現(xiàn)比活更高、可溶性程度較高的新型人干擾素?；蚬こ毯?PCR方法為改造干擾素基因序列提供了有力的技術(shù)支持，用于獲得更高活性的干擾素a2b， 提高療效和延長(zhǎng)半衰期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組人干擾素a2b DNA片段。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供第二種重組人干擾素a2b DNA片段。 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供第二種重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供第三種重組人干擾素a2b DNA片段。 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供第三種重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供第四種重組人干擾素a2b DNA片段。 本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供第四種重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下 一種重組人干擾素a2b DNA片段，它是序列表SEQIDNO.l所述的核苷酸序列。 第二種重組人干擾素a2b DNA片段，它是序列表SEQIDN02所述的核苷酸序列。 序列表SEQ ID N0.2的重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)，它是序列表SEQ IDN0.3所述的氨基酸序列。
第三種重組人干擾素a2b DNA片段，它是序列表SEQIDN0.4所述的核苷酸序列。 序列表SEQ ID N0.4的重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)，它是序列表SEQ IDN0.5所述的氨基酸序列。
第四種重組人干擾素a2b DNA片段，它是序列表SEQIDN0.6所述的核苷酸序列。 序列表SEQIDN0.6的重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)，它是序列表SEQ IDN0.7所述的氨基酸序列。
分別含有序列表SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6的重組人干擾素a2b t)NA片段的質(zhì)粒，用下述兩種方法之一構(gòu)建的-
第一種方法是根據(jù)大腸桿菌EC0lC1958基因序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到產(chǎn)物
EcolC1958，用Xbal和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pET28a和擴(kuò)增產(chǎn)物EcolC1958，連接，構(gòu)建出載 體pBPE172，將含有序列表SEQ IDN0.2所述的核苷酸序列與載體pBPE172酶切后連接或 將含有序列表SEQIDN0.4所述的核苷酸序列與載體pBPE172酶切后連接或含有序列表 SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列與載體pBPE172酶切后連接，得到含有序列表SEQ ID N0.2 的重組人干擾素a2b DNA片段的質(zhì)?；蚝行蛄斜鞸EQ ID N0.4的重組人干擾素a2b DNA片段的質(zhì)粒或含有序列表SEQ ID N0.6的重組人干擾素a2b DNA片段的質(zhì)粒。
第二種方法是將含有序列表8￡(210討0.2所述的核苷酸序列與載體 ￡丁43.13酶切后 連接或?qū)⒑行蛄斜鞸EQ ID N0.4所述的核苷酸序列與載體pET 43.1a酶切后連接或含有序 列表SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列與載體pET 43.1a酶切后連接，得到含有序列表SEQ ID N0.2的重組人干擾素a2b DNA片段的質(zhì)?；蚝行蛄斜鞸EQ ID N0.4的重組人干擾素a2b DNA片段的質(zhì)?；蚝行蛄斜鞸EQ ID N0.6的重組人干擾素a2b DNA片段的質(zhì)粒。
本發(fā)明的重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)主要以可溶性方式存在，其抗病毒 活性是人天然干擾素的幾十倍。其抗腫瘤活性，與人天然干擾素相比，具有較高的抗增殖 活性。


圖1是PCR后的rh-mIFN-1片段的電泳圖。 圖2是大引物法獲得的rh-mlFN-2片段的電泳圖。 圖3是大引物法獲得的rh-mlFN-3片段的電泳圖。 圖4是重疊延伸獲得的rh-mlFN-7片段的電泳圖。 圖5是pBPE172- rh-mlFN-7人干擾素產(chǎn)物的質(zhì)粒雙酶切的電泳圖。 圖6是pPET43. la- rh-mIFN系列質(zhì)粒雙酶切電泳圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明在干擾素研究方面，進(jìn)行了大量的前期工作。對(duì)目前發(fā)現(xiàn)的干擾素進(jìn)行生物信 息學(xué)同源性分析和功能預(yù)測(cè)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的干擾素基因序列的活性位點(diǎn)，比較了 幾種干擾素藥物的差異，設(shè)計(jì)出了 l種可具有高比活性的人干擾素a2b氨基酸序列，并反 向推出一種重組人干擾素a2b DNA片段(序列表SEQ IDNO.l所述的核苷酸序列)。并 依據(jù)大腸桿菌的密碼子偏嗜性和表達(dá)特性，進(jìn)行定向突變改造，得到三種重組人干擾素a2b DNA片段(序列表SEQIDN0.2、 SEQIDN0.4、 SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列)，分別 將三種重組干擾素a2b DNA片段序列與載體連接后，導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，得到重組 人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)(序列表SEQ ID N0.3、 SEQ ID N0.5、 SEQ ID NO.7 所述的氨基酸序列)。本發(fā)明的重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)其抗病毒活性是 人天然干擾素的幾十倍。其抗腫瘤活性，與人天然干擾素相比，具有較高的抗增殖活性。
首先通過(guò)對(duì)人干擾素IFNa2b基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的分析，選擇性將人干擾素受 體結(jié)合區(qū)域和活性位點(diǎn)的氨基酸殘基置換成其它氨基酸殘基后的結(jié)果的分析，選擇了對(duì)52、53、 55、 103、 107、 113、 121、 125、 132、 161位氨基酸10個(gè)殘基進(jìn)行定向改造，應(yīng)用PCR 技術(shù)，不斷地優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，首先設(shè)計(jì)并合成了 rh-mIFN-l (序列表SEQ ID NO.l所述的核苷酸序列)，再根據(jù)基因片段52、 53、 55和103、 107位氨基酸相隔較近的 特點(diǎn)，采用大引物PCR的方法對(duì)其進(jìn)行多位點(diǎn)誘變，依順序獲得了 rh-mIFN-2和rh-mIFN-3 編碼基因，在獲得rh-mIFN-2時(shí)，利用下游引物對(duì)161位進(jìn)行突變，最后采用重疊延伸定 點(diǎn)突變方法以rh-mlFN-6為模板，分別對(duì)113、 121、 125、 132位氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)誘變， 獲得了 rh-mIFN-4、 rh-mIFN-5、 rh-mIFN-6、 rh-mIFN-7。通過(guò)對(duì)rh-mIFN-7測(cè)序確定最終獲 得了一種重組人干擾素a2b DNA片段(序列表SEQIDN0.6所述的核苷酸序列)。
然后分別將序列表SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列連接 到高效表達(dá)載體pBPE172或pET 43.1a上，將重組載體pBPE172-rh-mlFN或pET 43.1a-rh-mIFN在表達(dá)菌￡co//.BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在選擇表達(dá)菌株時(shí)，我們需選擇可以 表達(dá)相應(yīng)的識(shí)別其稀有密碼子tRNA較多的菌株E②// BL21，最后比較了重組載體 pBPE172-rh-mIFN或pET 43.1a-rh-mIFN的表達(dá)形式，由于前者具有EcolC1958-Tag融合 蛋白，.后者具有Nus-tag融合蛋白，使得本發(fā)明的重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋 白質(zhì)(序列表SEQIDN0.3所述的氨基酸序列、序列表SEQIDN0.5所述的氨基酸序列和 序列表SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列)以可溶性蛋白形式存在。
并且通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度的選擇，初步優(yōu)化了工程菌的表達(dá)條件， 在3(TC， IPTG濃度為lmM，誘導(dǎo)5h后獲得的蛋白表達(dá)量高，工程菌穩(wěn)定性好。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例l
一種重組人干擾素a2b DNA片段，它是序列表SEQIDNO.l所述的核苷酸序列。 基因片段的設(shè)計(jì)與合成為
(1) 通過(guò)National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的人源干擾 素a2b原始序列，并根據(jù)已知上市的干擾素a2b氨基酸序列，在總結(jié)和分析大量關(guān)于干擾 素活性位點(diǎn)的文獻(xiàn)后，定向設(shè)計(jì)一種重組人干擾素a2b DNA片段(序列表SEQIDNO.l 所述的核苷酸序列)；
(2) 重組人干擾素a2bDNA片段(序列表SEQIDNO.l所述的核苷酸序列)的合成。 重組人干擾素a2b中含有166個(gè)氨基酸，其基因序列的長(zhǎng)度在498bp。 引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)設(shè)計(jì)序列表SEQIDN0.1所述的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成8對(duì)引物(A1 A8)，長(zhǎng)度為 60 80bp，相鄰引物的重疊區(qū)域?yàn)?2bp， Tm值在50 6(TC范圍。設(shè)計(jì)上游引物ES和下游引 物HX，上游引物ES引入酶切位點(diǎn)EcoRI，下游引物HX引入酶切位點(diǎn)HindIII;
各引物序列如下
ES (直線為酶切位點(diǎn))CGCGAATTCATGTGCGATCTGCCG ( SEQIDNO.8)
HX (直線為酶切位點(diǎn))GTCAAGCTTTTCTTTGCTACGCAGTCTTTC ( SEQ ID NO.9)
AhTGGCCCAG ( SEQIDNO.10) A2:
TACGACGCATCTGGGCCAGCAG ( SEQIDNO.ll)
A3:
TGCATGAAATGATTCAGCAGAT ( SEQIDN0.12) A4:
AGGTTGAAGATCTGCTGAATC ( SEQIDN0.13)
A5:
GTGATTCAGGGCGTGGGCGTGA ( SEQIDN0.14) A6:
GGGTTTCGGTCACGCCCACGC ( SEQIDN0.15)
A7:
AGTGGTGCGTGCGGAAATTATG ( SEQIDN0.16) A8:
ATTTCCGC ( SEQIDN0.17)
人干擾素a2b基因片段的PCR擴(kuò)增:
PCR反應(yīng)體系
10xpfU Buffer (含]^2+ 15mM) 5pL
dNTP (各2.5mM) 5pL
上游引物ES (20ng/jiL) 2nL
下游引物HX (20ng/pL) 2nL
引物A1 A8 (20ng/pL) 各0.2pL
超純水、、 33.9pL
pfii酶 (5U/^iL) 0.5pL
反應(yīng)條件95。C,5min; 95。C,lmin， 55。C,lmin， 72。C,lmin， 35個(gè)循環(huán);72。C,延伸10min， 4"保存。電泳驗(yàn)證PCR結(jié)果(見(jiàn)圖l，泳道l為500bp左右)，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純 化產(chǎn)物，編號(hào)rh-mIFN-l (序列表SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列)，4'C保存。實(shí)施例2
一種重組人干擾素a2b DNA片段，它是序列表SEQIDNa2所述的核苷酸序列。 步驟為
利用大引物擴(kuò)增方法對(duì)第52、 53、 55位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，同時(shí)設(shè)計(jì)下游引物HX2 突變161位氨基酸，從而獲得重組干擾素序列rh-mlFN-2 (序列表SEQ ID N0.2所述的核 苷酸序列)；
突變引物設(shè)計(jì)(波浪線為突變位點(diǎn))
Mut2 (5，—-3，) TTC ATG CAG CAC QCIAAT QQC C1Q CGC TTT CTG ( SEQ ID N0.18)
設(shè)計(jì)下游引物
HX2 (直線為酶切位點(diǎn))GTC AAG CTT TTC TTT GCT ACG CAG TCG TTC ( SEQ ID N0.19)
具體過(guò)程為
第一輪反應(yīng)體系(總體積為100pL):以上游引物ES ( SEQIDN0.8)和突變引物Mut2 (SEQIDN0.18)為引物，以rh-mIFN-l ( SEQIDNO.l)序列為模板。
PCR反應(yīng)條件94°C， 4min， l個(gè)循環(huán)；94°C， 40s， 60°C， 30s， 72°C， 30s，共24個(gè) 循環(huán)；72'C， 5min， l個(gè)循環(huán)；
第一輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，向10(^L的上述反應(yīng)物中補(bǔ)加 dNTP (各2.5mM) 6pL 下游引物HX2 (20ng/pL) 2pL ; fo酶(5U/pL) lpL PCR反應(yīng)條件94°C， 40s， 68°C， 25s， 72°C， lmin，共10個(gè)循環(huán)；94°C， 40s， 55°C， 25s， 72°C， lmin，共12個(gè)循環(huán)；72°C，延伸lmin， PCR反應(yīng)結(jié)束，電泳驗(yàn)證(見(jiàn)圖2， 圖中泳道1為.第一輪PCR產(chǎn)物；泳道2為.第二輪PCR產(chǎn)物)，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒 純化產(chǎn)物，編號(hào)rh-mlFN-2 (序列表SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列)，4。C保存。 實(shí)施例3
一種重組人干擾素a2b DNA片段，它是序列表SEQIDN0.4所述的核苷酸序列。 步驟為
在獲得rh-mlFN-2目標(biāo)片段后，再以此序列為模板，采用大引物方法，對(duì)103、 107位 氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而獲得目標(biāo)序列rh-mlFN-3 (序列表SEQ IDN0.4所述的核苷酸 序列)；
突變引物如下
(SEQIDNO.20);
進(jìn)行PCR，得到產(chǎn)物，電泳驗(yàn)證(見(jiàn)圖3，圖中泳道1為第一輪PCR產(chǎn)物；泳道2為 第二輪PCR產(chǎn)物)采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物，獲得編號(hào)rh-mlFN-3 (序列表SEQIDN0.4所述的核苷酸序列)，4。C保存。 實(shí)施例4
一種重組人干擾素a2b DNA片段，它是序列表SEQIDN0.6所述的核苷酸序列。 步驟為-
(1)采用重疊延伸PCR定點(diǎn)突變方法對(duì)第132位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而獲得重組 干擾素序列rh-mlFN-4，兩條突變引物如下
Mutl32F: GCT ATA TTT TTT TTC GQICAG ATA CAG ( SEQIDN0.21) Mutl32R: ACC CTG TAT CTG ACC GAA AAA AAA TAT ( SEQIDN0.22)
重疊延伸需要進(jìn)行兩輪三次PCR反應(yīng)，具體歩驟如下
大片段PCR反應(yīng)體系
10xpfii Buffer (含Mg" 15mM) 10pL
dNTP (各2.5mM) 8pL
上游引物ES (20ng4iL) 2pL
突變引物Mutl32F (20ng/VL) ■ 2pL
模板DNA rh-mlFN-3 (15 ng/^L) 2pL
超純水 75pL
; fu酶 (5U/pL) lpL
大片段PCR反應(yīng)條件95。C,5min; 95。C,lmin， 60。C,lmin， 72。C,lmin， 20個(gè)循環(huán)；72°C, 延伸5min， 4'C保存。電泳驗(yàn)證PCR結(jié)果，采用采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物,編號(hào)
CYL-B1，4。C保存；
小片段的PCR反應(yīng)體系
1 Oxpfu Buffer (含Mg" 15mM) 1 OpL
dNTP (各2.5mM) 8pL
下游引物HX2 (20ng/nL) 2pL
突變引物Mutl32R (20ng/pL) 2pL
模板DNA rh-mlFN-3 (15 ng/^iL) 2pL
超純水 75pL
; fu酶 (5U4iL) lpL
PCR反應(yīng)條件95°C， 5min; 95°C， lmin， 55°C， 25s， 72°C， 30s， 20個(gè)循環(huán)；72°C， 延伸5min， 4'C保存。電泳驗(yàn)證PCR結(jié)果，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物，編號(hào) CYL-S1，4。C保存； '
配制反應(yīng)體系(總體積為100pL):以擴(kuò)增序列正確的基因?yàn)槟０澹支潔凈的微量
離心管，依次加入
1 Oxpfu Buffer (含Mg2十15mM) 10pL
dNTP (各2.5mM) 8pL
上游引物ES (20ngVL) 2pL下游引物HX2 (20ng4iL) 2pL
CYL-B1 lpL
CYL-S1 lpL
超純水 75^iL
pfU酶 (5U4iL) lpL
PCR反應(yīng)條件95°C， 5min; 95°C， lmin， 55°C， lmin， 72。C,lmin， 35個(gè)循環(huán)； 72"C，10min,4'C保存。電泳驗(yàn)證，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物，編號(hào)rh-mlFN-4,4'C保 存；
(2) rh-mlFN-5 113位進(jìn)行定點(diǎn)突變 以rh-mlFN-4為模板，兩條突變引物設(shè)計(jì)如下
Mutll3F: AAT GCT ATC TTC fill CAT CAG CGG ( SEQIDN0.23) Mutll3R: ACCCCGCTGATGAACGAAGATAGC ( SEQIDN0.24) .PCR過(guò)程如步驟(1)，得至lJrh-mlFN-5;
(3) rh-mlFN-6 121位進(jìn)行定點(diǎn)突變 以rh-mlFN-5為模板，突變引物設(shè)計(jì)如下
Mutl21F: CTG AAA ATA TTT HI CAC GGC CAG AAT ( SEQIDN0.25) Mutl21R: ATT CTG GCC GTG AAA AAA TAT TTT CAG ( SEQIDN0.26) PCR過(guò)程如步驟(1)，得到rh-mlFN-6;
(4) rh-mlFN-7 125位進(jìn)行定點(diǎn)突變 以rh-mlFN-6為模板，突變引物設(shè)計(jì)如下
Mutl25F: CAG GGT GAT GCGICI AAA ATA TTT TTT CAC ( SEQIDN0.27)
Mutl25R: AAA AAA TAT TTT ￡GA CGC ATC ACC CTG ( SEQIDN0.28)
PCR過(guò)程如步驟(1)獲得了一種重組人干擾素a2b DNA片段rh-mIFN-7，是序列表SEQ
IDN0.6所述的核苷酸序列。(見(jiàn)圖4，圖中泳道l為小片段；泳道2為大片段；泳道3為
重疊延伸產(chǎn)物rh-mlFN-7)。
實(shí)施例5
含有序列表SEQ ID N0.2的重組人干擾素a2b DNA片段的質(zhì)粒 (pBPE172-rh國(guó)mlFN誦2)的構(gòu)建
根據(jù)大腸桿菌EcolC1958基因序列，設(shè)計(jì)兩條引物，分別引入酶切位點(diǎn)XbaI和EcoRI， 以大腸桿菌DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物EcolC1958，用XbaI和EcoRI雙酶切 質(zhì)粒pET28a和擴(kuò)增產(chǎn)物EcolC1958，純化酶切產(chǎn)物，連接，構(gòu)建載體pBPE172;
將PCR所獲得的重組干擾素rh-mlFN-2基因片段用EcoRI和Hindlll雙酶切，反應(yīng)體 系為EcoRI和HindIII各1^1， DNA產(chǎn)物lOpl, 10xM Buffer 2(^1,無(wú)菌水補(bǔ)足20pl， 37。C反 應(yīng)3h，反應(yīng)產(chǎn)物用EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit Cat純化(純化歩驟依照試劑 盒說(shuō)明依步操作)。同樣，用EcoRI和HindIII雙酶切pBPEl72質(zhì)粒，純化酶切產(chǎn)物。
將pBPE172酶切片段與重組干擾素rh-mIFN-2基因片段進(jìn)行瓊脂糖電泳，估測(cè)濃度后，按3: l摩爾濃度混合，加入等體積DNA Ligation Kit Ver 2.0連接酶，16。C連接lh。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，冰浴30min， 42。C水浴熱擊卯s， 迅速放置碎冰中靜置2min，然后加入400plLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)， 37'C搖床靜置 50min， 5000rpm/min離心1分鐘，棄上清，加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基200nl，均勻涂布在 含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37'C培養(yǎng)過(guò)夜，第二天挑單菌落，用堿法提取質(zhì)粒進(jìn) 行雙酶切驗(yàn)證，最后經(jīng)測(cè)序正確即為表達(dá)質(zhì)粒pBPE172-rh-mlFN-2。 實(shí)施例6
含有序列表SEQ ID N0.4的重組人干擾素a2b DNA片段的質(zhì)粒 (pBPE172-rh-mlFN-3)的構(gòu)建。步驟同實(shí)施例5。 實(shí)施例7
含有序列表SEQ ID NO.6的重組人干擾素a2bDNA片段的質(zhì)粒 (pBPE172-rh-mlFN-7)的構(gòu)建。步驟同實(shí)施例5。見(jiàn)圖5。 實(shí)施例8
表達(dá)載體也可以選pET43.1a替代實(shí)施例5中的pBPE172，構(gòu)建出表達(dá)寧體pET 43.1a-rh隱mlFN-2。 實(shí)施例9
表達(dá)載體也可以選pET43.1a替代實(shí)施例6中的pBPE172，構(gòu)建出表達(dá)載體pET 43.1a-rh-mIFN-3。 實(shí)施例10
表達(dá)載體也可以選pET 43.la替代實(shí)施例7中的pBPE172，構(gòu)建出表達(dá)載體pET 43.1a-rh-mIFN-7。
見(jiàn)圖6，圖中，泳道6為pET 43.1a-rh-mIFN-2，泳道8為pET 43.1a-rh-mlFN國(guó)3，泳道 22為pET 43.1a-rh-mIFN-7。 實(shí)施例11
重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)(序列表SEQ ID N0.3、 SEQIDN0.5、 SEQIDN0.7所述的氨基酸序列)的制備。 a、重組人干擾素a2b的分離純化
(1) 誘導(dǎo)表達(dá)
將正確重組的pBPE172-rh-mlFN-2 、 pBPE172-rh-mlFN-3禾Q pBPE172-rh-mlFN-7質(zhì)粒 分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株￡.0 //.8121感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，冰浴30min， 42"C水浴熱擊90s， 迅速放置碎冰中靜置2min，然后加入lmlLB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37。C靜置45min， 5000rpm/min離心1分鐘，棄上清，加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基均勻涂布在含有抗 生物的LB固體培養(yǎng)基上，37"C培養(yǎng)過(guò)夜，做為種子菌。
(2) 菌體收獲
將種子菌接入5mlLB液體培養(yǎng)基中(含氯霉素和氨芐青霉素)，37'C過(guò)夜復(fù)蘇。然后 將復(fù)蘇的菌液按l: 100接種于50mlLB液體培養(yǎng)基中(含氯霉素和氨芐青霉素)，37匸培養(yǎng)OD,為0.5—0.6，加入lmM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，30。C誘導(dǎo)表達(dá)5h。用冷凍離心機(jī)8000rpm、 4'C下離心10min，收集菌體。
(3) 超聲破菌
將收集的菌體用1/10體積的PBS (pH8.0)懸浮，置冰上，用超聲裂解，采用功率水 平為6 7，超10s，停10s，共30次。當(dāng)裂解液粘度變小，基本澄清時(shí)，說(shuō)明菌體已經(jīng)基本 破碎。基本破碎后，將破碎液在12000rpm， 4。C離心10min，收集上清和沉淀，沉淀用等體 積PBS懸浮，冷凍保存，SDS-PAGE電泳分析。
(4) SDS-PAGE電泳分析
按照以下步驟進(jìn)行電泳
樣品處理
取適量體積的各部分樣品，包括誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌體、超聲后上清和沉淀，加入1/5 體積的5xSDS電泳緩沖液。IO(TC水浴加熱10min使蛋白充分變性。 凝膠配制
12%分離膠的配制4mlA液、3.5mlB液、2.5ml超純水，5(^L10。/。過(guò)硫酸胺，5pL TEMED。
4x濃縮膠配制0.67ml A液、lml C液、2,3ml超純水、3(^L10。/。過(guò)硫酸銨、5pL TEMED。
加入TEMED后，立即混勻，灌膠。
上樣
當(dāng)PAGE膠凝固后，電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，上樣。 電泳
電泳時(shí)先用較低電壓，先150V，待樣品進(jìn)入分離膠后，電壓提高到180V，直至溴酚 藍(lán)至膠的底部為止。
染色 ，
電泳完畢后，剝離分離膠，立即泡入考馬斯亮藍(lán)染色液中，搖床上緩慢搖30min，然后 更換脫色液沖洗兩次，每次約45min，染色后掃描，確認(rèn)有目標(biāo)條帶，以標(biāo)準(zhǔn)Marker做參 照估算特異性產(chǎn)物(序列表SEQ ID N0.3、 SEQ ID N0.5、 SEQ ID N0.7所述的氨基酸序列) 的表達(dá)量及其在菌體總蛋白中的比例。 (5)上清過(guò)柱純化
將樹(shù)脂加入層析柱中，結(jié)合緩沖液(20mmol/L磷酸鈉；500mmol/L氯化鈉；pH 7.8) 引流到頂部，使樹(shù)脂沉淀至底部。將獲得的細(xì)胞裂解液上清上柱，調(diào)整流速為每小時(shí)IO個(gè) 柱體積，約3 4秒一滴。用6倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗柱。用洗滌緩沖液(20mmol/L磷 酸鈉；500mmol/L氯化鈉；pH 6.0)洗柱，直至流出液280nm下的吸光值小于0.01 ，大約 為20倍柱體積的緩沖液。用6個(gè)柱體積的100mmol/L的咪唑洗脫緩沖液(20mmol/L磷酸 鈉；500mmoI/L氯化鈉；100mmol/L咪唑；pH7.8)，洗脫結(jié)合的蛋白。分歩收集蛋白，每 份lml，檢測(cè)280nm下的吸光值。 b、重組人干擾素a2b的發(fā)酵優(yōu)化(1) 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化
在3個(gè)250ml搖瓶中(含50mlLB液體培養(yǎng)基)分別接種表達(dá)菌，37'C培養(yǎng)至0D6(K) 為0.6左右，加入終濃度lmM的IPTG誘導(dǎo)，分別在25'C、 30°C、 37匸誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5 小時(shí)，取出搖瓶，用冷凍離心機(jī)在8000ipm、 4'C離心10min，收集菌體，取樣分析。
(2) 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化
按上述方法接種表達(dá)菌，37'C搖瓶培養(yǎng)至OD6(K)為0.6左右時(shí)，加入lmM的IPTG， 在30'C下誘導(dǎo)，分別在lh、 2h、 3h、 4h和5h取樣電泳，分析不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量 的影響。
(3) 誘導(dǎo)劑濃度的確定
按上述方法接種表達(dá)菌，37。C搖瓶培養(yǎng)至OD6(K)為0.6左右時(shí)，加入O.lmM、 0.5mM、 lmM的IPTG，在3(TC下誘導(dǎo)，取樣電泳，分析不同誘導(dǎo)劑濃度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響。 結(jié)論
從誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，初步確定發(fā)酵表達(dá)條件為30°C， IPTG 濃度為lmM，誘導(dǎo)5h。
(也可以用pET 43.1 a-rh-mlFN-2替代pBPE 172-rh-mIFN-2 、 pET 43.1 a-rh誦mlFN-3替代 pBPE172-rh-mlFN-3、 pET 43.la-rh-mlFN-7替代pBPEl72-rh-mIFN- 7進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)) 實(shí)施例12
本發(fā)明制備的重組人干擾素a 2b活性的測(cè)定
(1) 抗病毒活性檢測(cè)
以WISH細(xì)胞/VSV系統(tǒng)進(jìn)行抗病毒活性檢測(cè)，按標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算其抗病毒活性。 結(jié)果為
人天然干擾素為1.0X 108 IU/mg。本發(fā)明所制備的三種重組人干擾素a 2b (序列表SEQ IDN0.3、 SEQIDN0.5、 SEQ ID N0.7所述的氨基酸序列)的活性分別為8.0X 108IU/mg、 3.0X109IU/mg、 5X109IU/mg，其抗病毒活性分別是人天然干擾素的8倍、30倍和50倍。
(2) 抗腫瘤活性檢測(cè)
以A549細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)本發(fā)明所制備的三種重組人干擾素a2b (序列 表SEQIDN0.3、 SEQIDN0.5、 SEQ ID N0.7所述的氨基酸序列)的抗腫瘤活性，以A549 細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以人天然干擾素作為對(duì)照。
結(jié)果為以相同活性(抗病毒)的人天然干擾素與a2b衡量它的抗增殖活性，本發(fā)明所制 備的三種重組人干擾素a 2b與人天然干擾素相比，都具有較高的抗增殖活性。序列表
<110>天津大學(xué)
<120〉重組人干擾素a 2b DNA片段及編碼的蛋白質(zhì)
<160>28
<210〉1
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222〉 (1)…(498) <400>1
atgtgcgatc tgccgcagac ccatagcctg ggcagccgtc gtaccctgat gctgctggcc 60
cagatgcgtc gtattagcct gtttagctgc ctgaaagatc gtcatgattt tggctttccg 120
caggaagaat ttggcaacca gtttcagaaa gcggaaacca ttccggtgct gcatgaaatg 180
attcagcaga tcttcaacct gtttagcacc aaagatagca gcgcggcgtg ggatgaaacc 240
ctgctggata aattctatac cgaactgtat cagcagctga acgatctgga agcgtgcgtg 300
attcagggcg tgggcgtgac cgaaaccccg ctgatgaaag aagatagcat tctggccgtg 360
cgtaaatatt ttcagcgcat caccctgtat ctgaaagaaa aaaaatatag cccgtgcgcg 420
tgggaagtgg tgcgtgcgga aattatgcgt agctttagcc tgagcaccaa cctgcaggaa 480
agcctgcgta gcaaagaa 498
<210>2
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(498) <400>2
atgtgcgatc tgccgcagac ccatagcctg ggcagccgtc gtaccctgat gctgctggcc 60 cagatgcgtc gtattagcct gtttagctgc ctgaaagatc gtcatgattt tggctttccg 120 caggaagaat ttggcaacca gtttcagaaa gcgcaggcca ttagcgtgct gcatgaaatg 180 attcagcaga tcttcaacct gtttagcacc aaagatagca gcgcggcgtg ggatgaaacc 240 ctgctggata aattctatac cgaactgtat cagcagctga acgatctgga agcgtgcgtg 300 attcagggcg tgggcgtgac cgaaaccccg ctgatgaaag aagatagcat tctggccgtg 360 cgtaaatatt ttcagcgcat caccctgtat ctgaaagaaa aaaaatatag cccgtgcgcg 420tgggaagtgg tgcgtgcgga aattatgcgt agctttagcc tgagcaccaa cctgcaggaa 480
cgactgcgta gcaaagaa 498
<210〉3
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<400〉3
Met Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala 20
Gin Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro 40
Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Met 60
lie Gin Gin lie Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val 100
He Gin Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser He Leu Ala Val 120
Arg Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 140
Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 160
Arg Leu Arg Ser Lys Glu 166
<210>4
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220> ,
<221〉gene
<222> (1)…(498) <400>4
atgtgcgatc tgccgcagac ccatagcctg ggcagccgtc gtaccctgat gctgctggcc 60 cagatgcgtc gtattagcct gtttagctgc ctgaaagatc gtcatgattt tggctttccg 120 caggaagaat ttggcaacca gtttcagaaa gcgcaggcca ttagcgtgct gcatgaaatg 180 attcagcaga tcttcaacct gtttagcacc aaagatagca gcgcggcgtg ggatgaaacc 240 ctgctggata aattctatac cgaactgtat cagcagctga acgatctgga agcgtgcgtg 300 attcaggaag tgggcgtgga agaaaccccg ctgatgaaag aagatagcat tctggccgtg 360 cgtaaatatt ttcagcgcat caccctgtat ctgaaagaaa aaaaatatag cccgtgcgcg 420 tgggaagtgg tgcgtgcgga aattatgcgt agctttagcc tgagcaccaa cctgcaggaa 480 cgactgcgta gcaaagaa 498 <210>5 <211>166 <212>PRT<213>人工序列 <400>5
Met Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala 20
Gin Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro 40
Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Met 60
He Gin Gin lie Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val 100
He Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser lie Leu Ala Val 120
Arg Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 140
Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 160
Arg Leu Arg Ser Lys Glu 166
<210>6
<211>498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(498) <400>6
atgtgcgatc tgccgcagac ccatagcctg ggcagccgtc gtaccctgat gctgctggcc 60
cagatgcgtc gtattagcct gtttagctgc ctgaaagatc gtcatgattt tggctttccg 120
caggaagaat ttggcaacca gtttcagaaa gcgcaggcca ttagcgtgct gcatgaaatg 180
attcagcaga tcttcaacct gtttagcacc aaagatagca gcgcggcgtg ggatgaaacc 240
ctgctggata aattctatac cgaactgtat cagcagctga acgatctgga agcgtgcgtg 300
attcaggaag tgggcgtgga agaaaccccg ctgatgaacg aagatagcat tctggccgtg 360
aaaaaatatt ttcgacgcat caccctgtat ctgaccgaaa aaaaatatag cccgtgcgcg 420
tgggaagtgg tgcgtgcgga aattatgcgt agctttagcc tgagcaccaa cctgcaggaa 480
cgactgcgta gcaaagaa 498
<210>7
<2U>166
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Met Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala 20 Gin Met Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro 40 Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala He Ser Val Leu His Glu Met 60鄰Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr 80 Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val 100 He Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser lie Leu Ala Val 120 Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 140 Trp Glu Val Val Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu 160 Arg Leu Arg Ser Lys Glu 166 <210>8 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221>gene <222> (1)…(24) <400>8
cgcgaattca tgtgcgatct gccg 24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(30)
<400>9
gtcaagcttt tctttgctac gcagtctttc 30
<210>10
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(63)
<400>10
atgtgcgatc tgccgcagac ccatagcctg ggcagccgtc gtaccctgat gctgctggcc 60
cag 63
<210>11
<211>76<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(76)
<400>11
cttcctgcgg aaagccaaaa tcatgacgat ctttcaggca gctaaacagg ctaatacgac 60
gcatctgggc .cagcag 76
<210>12
<211〉76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(76)
<400>12
ttccgcagga agaatttggc aaccagtttc agaaagcgga aaccattccg gtgctgcatg 60
aaatgattca gcagat 76
<210>13
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(76)
<400>13
gaatttatcc agcagggttt catcccacgc cgcgctgcta tctttggtgc taaacaggtt 60
gaagatctgc tgaatc 76
<210>14
<211>76
<212〉DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222〉 (1)…(76)
<400>14ctggataaat tctataccga actgtatcag cagctgaacg atctggaagc gtgcgtgatt 60
cagggcgtgg gcgtga 76
<210>15
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(76)
<400>15
gtgatgcgct gaaaatattt acgcacggcc agaatgctat cttctttcat cagcggggtt 60
tcggtcacgc ccacgc 76
<210>16
<211>76bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(76)
<400>16
tcagcgcatc accctgtatc tg.aaagaaaa aaaatatagc ccgtgcgcgt gggaagtggt 60
gcgtgcggaa attatg 76
<210>17
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(63)
<400>17
ttctttgcta cgcaggcttt cctgcaggtt ggtgctcagg ctaaagctac gcataatttc 60
cgc 63
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>gene
<222> (1)…(33)
<400>18
ttcatgcagc acgctaatgg cctgcgcttt ctg 33
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(30)
<400>19
gtcaagcttt tctttgctac gcagtcgttc 30
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(39)
<400>20
cagcggggtt tcttccacgc ccacttcctg aatcacgca 39
<210>21
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gerie
<222> (1)…(27)
<400>21
gctatatttt ttttcggtca gatacag 27
<210>22
<211>27
<212〉DNA
<213>人工序列<220>
<221>gene
<222> (1)…(27)
<400〉22
accctgtatc tgaccgaaaa aaaatat 27
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(24)
<400>23
aatgctatct tcgttcatca gcgg 24
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(24)
<400>24
accccgctga tgaacgaaga tagc 24
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213〉人工序列
<220>
<221〉gene
<222> (1)…(27)
<400>25
ctgaaaatat tttttcacgg ccagaat 27
<210>26
<211>27
<212〉DNA
<213>人工序列<220>
<221>gene
<222> (1)…(27)
<400>26
attctggccg tgaaaaaata ttttcag 27
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(30)
<400>27
cagggtgatg cgtctaaaat attttttcac 30
<210>28
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>gene
<222> (1)…(27)
<400>28
aaaaaatatt ttcgacgcat caccctg 2權(quán)利要求
1. 一種重組人干擾素α2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
2. —種重組人干擾素a2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列。
3. 權(quán)利要求2的一種重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)，其特征是它是 序列表SEQ ID N0.3所述的氨基酸序列。
4. 一種重組人干擾素a2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列。
5. 權(quán)利要求4的一種重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)，其特征是它是 序列表SEQ ID N0.5所述的氨基酸序列。
6. —種重組人干擾素a2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQIDN0.6所述的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求6的一種重組人干擾素a2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)，其特征是它是 序列表SEQ ID N0.7所述的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人干擾素α2b DNA片段及編碼的蛋白質(zhì)，重組人干擾素α2bDNA片段是序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，重組人干擾素α2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)是序列表SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。本發(fā)明的重組人干擾素α2b DNA片段編碼的蛋白質(zhì)主要以可溶性方式存在，其抗病毒活性是人天然干擾素的幾十倍。其抗腫瘤活性，與人天然干擾素相比，具有較高的抗增殖活性。
文檔編號(hào)C12N15/19GK101434957SQ20081015423
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者張和平, 磊 杜, 梁玲玲, 祝琳琪, 趙廣榮 申請(qǐng)人:天津大學(xué)