專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生產(chǎn)γ-干擾素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制劑領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及一種用于生產(chǎn)豬Y-干擾素的純化方法。
背景技術(shù)：
干擾素(IFN)是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。IFN的抗病毒活性是通過(guò)宿主細(xì)胞而間接完成的，并具有嚴(yán)格的種屬特異性及選擇性。根據(jù)其來(lái)源和結(jié)構(gòu)，IFN可分為a 、 13 、 Y三種類(lèi)型，近年來(lái)，還發(fā)現(xiàn)了 "、 t等類(lèi)型的干擾素。IFN-a主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生；IFN-P主要由纖維母細(xì)胞產(chǎn)生，血管內(nèi)皮細(xì)胞也可產(chǎn)生；IFN-Y由抗原及PHA等有絲分裂原剌激T細(xì)胞后產(chǎn)生，此外，NK細(xì)胞也可產(chǎn)生。IFN-t是反芻動(dòng)物孕體附植時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的特有的妊娠識(shí)別信號(hào)因子，在妊娠識(shí)別中發(fā)揮著重要的作用。
其中，IFN-Y是具有促炎作用的細(xì)胞因子，由Thl細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)機(jī)體非特異性的免疫，保護(hù)機(jī)體免受病毒感染；IFN-Y與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)相互作用顯著，可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1、 IL-6、 TNF-a 、 IL_8、 MCP-1等細(xì)胞因子，并可上調(diào)TNF、淋巴毒素和IL-1等細(xì)胞因子的受體，從而增強(qiáng)了其促炎作用；IFN-y可使巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上Fc受體表達(dá)增加，使多種組織細(xì)胞II類(lèi)MHC表達(dá)增加，從而增強(qiáng)這些細(xì)胞的吞噬活性和抗原遞呈能力；IFN-Y可剌激巨嗜細(xì)胞內(nèi)活性氧和活性氮的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)殺菌和殺寄生蟲(chóng)活性；IFN-Y能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞株的分化，同時(shí)能直接抑制病毒的復(fù)制，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和抗細(xì)胞增殖的功能，所以又稱(chēng)免疫干擾素。由此可見(jiàn)，IFN-Y是一類(lèi)非常有前途的生物類(lèi)藥物。 豬干擾素是被研究最早的動(dòng)物干擾素之一，20世紀(jì)80年代就有豬干擾素的相關(guān)報(bào)道。近年來(lái)，對(duì)豬干擾素的誘導(dǎo)條件和理化活性有了進(jìn)一步的研究，同時(shí)對(duì)豬白細(xì)胞干擾素進(jìn)行了大量的臨床試驗(yàn)。研究表明，它對(duì)豬的許多病毒性傳染病，如流行性腹瀉、豬瘟、傳染性胃腸炎等，以及對(duì)牛病毒性腹瀉、小鵝瘟，羔羊腹瀉等都具有不錯(cuò)的療效，試驗(yàn)證實(shí)豬干擾素與牛羊等動(dòng)物之間存在交叉活性。最近幾年，豬干擾素a 、 13 、 Y基因的分子克隆與序列分析獲得成功。謝海燕等采用PCR技術(shù)克隆得到的IFN-a基因由501個(gè)核苷酸組成，共編碼166個(gè)氨基酸；夏春等克隆得到的豬13干擾素IFN-P基因片段有668個(gè)核苷酸，編碼186個(gè)氨基酸。曹瑞兵等從經(jīng)ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)的豬外周血白細(xì)胞中擴(kuò)增出豬IFN-Y基因，經(jīng)改造后插入原核表達(dá)載體PRLG，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)變性、復(fù)性、脫鹽、凝膠層析純化處理，重組豬IFN-y具有較高的干擾素活性。同時(shí)，萬(wàn)建青、陳濤等分別成功地在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出重組干擾素基因，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的比率在20% 35%之間，表達(dá)產(chǎn)物具有的抗病毒活性，為基因工程干擾素的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供了可能。 目前，生產(chǎn)動(dòng)物用的干擾素(如豬干擾素)的常見(jiàn)方法有在動(dòng)物體內(nèi)提取、構(gòu)建基因工程菌株表達(dá)生產(chǎn)。其中利用重組菌株表達(dá)生產(chǎn)干擾素，具有表達(dá)量高、抗病毒活性強(qiáng)的
3優(yōu)點(diǎn)。因此，成為了干擾素批量生產(chǎn)的趨勢(shì)。 但是，利用重組菌株表達(dá)生產(chǎn)干擾素，在后期的分離純化過(guò)程中一般都要使用價(jià)值昂貴的單抗柱，純度才能達(dá)到95 %以上；而目前國(guó)產(chǎn)的單抗柱，無(wú)論在產(chǎn)量和質(zhì)量上，都不能滿足廠家的需要，而只能高價(jià)進(jìn)口，增加生產(chǎn)成本。因此，目前需要一種經(jīng)濟(jì)、快速、高效地的純化方法，以用于生產(chǎn)干擾素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種經(jīng)濟(jì)、快速、高效的Y-干擾素純化方法。
因此，本發(fā)明目的在于提供一種Y _干擾素純化方法，步驟包括
(1)重組菌株進(jìn)行發(fā)酵； (2)離心發(fā)酵液(6500rpm，離心15min)取上清，通過(guò)微濾除雜、超濾濃縮；[(Km] (3)濃縮液過(guò)陽(yáng)離子層析柱(CM S印harose柱層析)，以A液(20mM NH4Ac，pH8)和B液(20mM NH4Ac，0. 7M NaCl， pH8)組成的離子強(qiáng)度遞增溶液洗脫，收集第四個(gè)峰；
(4)加入硫酸銨30% (v/v)至稍混濁，離心取上清(7000rpm，離心10min);
(5)過(guò)S印hacryl S-200凝膠層析柱，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)收集目標(biāo)洗脫峰；
(6)過(guò)S印hadex G_75色譜柱，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)收集目標(biāo)洗脫液；
(7)得到純度高于97. 5%的干擾素原液，置于4t:冰箱保存。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在實(shí)施步驟5之前，先去熱原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸緩沖液平衡，上樣。其中，去熱源的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸堿法、其它方法等。其中，優(yōu)選是吸附法。 在另一具體實(shí)施方案中，在實(shí)施步驟6之前，將充分浸泡后的S印hadex G_75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、 pH7. 0的PBS緩沖液平衡，上樣。其中，去熱源的方法優(yōu)選吸附法。 應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明目的不在于提供一種具體的重組菌株來(lái)生產(chǎn)Y干擾素，而是提供對(duì)重組菌株的產(chǎn)物進(jìn)行純化，以獲得高純度的Y干擾素產(chǎn)品。因此所述的重組菌株可包括各種常規(guī)的重組菌株，例如大腸桿菌工程菌、酵母(如畢赤酵母)工程菌、重組病毒。本發(fā)明優(yōu)選酵母工程菌。 應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明目的不在于提供一種特定Y干擾素的純化方法，而是提供常規(guī)Y干擾素類(lèi)型進(jìn)行純化，以獲得高純度的Y干擾素產(chǎn)品。因此所述的Y干擾素可包括各種動(dòng)物用Y干擾素，例如畜用Y干擾素、禽類(lèi)Y干擾素、魚(yú)類(lèi)Y干擾素。本發(fā)明優(yōu)選豬Y干擾素。
術(shù)語(yǔ)"熱原"系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。這里所指的"熱原"，主要是指細(xì)菌性熱原，是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素。致熱能力最強(qiáng)的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽(yáng)性桿菌類(lèi)，革蘭陽(yáng)性球菌則較弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。熱原通常是磷脂多醇與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合物。磷脂多醇是復(fù)合物的活性中心，致熱作用最強(qiáng)。其化學(xué)組成因菌種不同而有所差異。分子量為5乂104 5乂105，分子量越大致熱作用也越強(qiáng)。
去熱原的方法包括 1.高溫法熱原的耐熱性能良好，6(TC加熱lh不被分解破壞，10(TC不降解，但
180°C 3 4h、200。C 60min或250°C 30 45min可使熱原徹底破壞。因此耐熱物品如玻璃
制品、金屬制品、生產(chǎn)過(guò)程中所用的容器和其它用具以及注射時(shí)使用的注射器等，均可采用
此法破壞熱原。但在通常使用的注射劑熱壓滅菌條件下不足以破壞熱原。 2.吸附法熱原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭
性質(zhì)穩(wěn)定、吸附性強(qiáng)兼具助濾和脫色作用，故廣泛用于注射劑生產(chǎn)，但應(yīng)注意吸附藥液所造
成的主藥的損失。 3.超濾法熱原分子量為1Xl(f左右，體積較小，約1 5nm，可以通過(guò)一般濾器和微孔濾膜，但采用超濾法如用3. 0 15nm超濾膜可將其除去。 4.蒸餾法熱原能溶于水但不揮發(fā)，但可隨水蒸氣的霧滴進(jìn)入注射用水中，因此制備注射用水時(shí)，原水中的熱原可經(jīng)蒸餾除去，但需多次蒸餾，，并加有隔沫裝置，單次蒸餾往往效果不理想。
5.酸堿法熱原能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化劑破壞。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、輸液瓶等可用重鉻酸鉀硫酸清潔液或稀氫氧化鈉處理，破壞熱原。
6.其它包括離子交換法、凝膠濾過(guò)法、反滲透法等。
有益效果 本發(fā)明提供的重組菌株表達(dá)干擾素的后續(xù)純化方法，無(wú)需使用價(jià)格昂貴的單抗柱，避免了單抗脫落造成的污染，縮短了純化時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本，最終可得到純度高于97.5%的干擾素原液，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用將會(huì)帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方案 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1 :重組畢赤酵母表達(dá)豬Y _干擾素的純化
(1)重組菌株進(jìn)行發(fā)酵； (2)離心發(fā)酵液(6500rpm，離心15min)取上清，通過(guò)微濾除雜、超濾濃縮；
(3)濃縮液過(guò)陽(yáng)離子層析柱(CM S印harose柱層析)，以A液(20mM NH4Ac， pH8)和B液(20mM NH4Ac，0. 7M NaCl，pH8)組成的離子強(qiáng)度遞增溶液洗脫，收集第四個(gè)峰；
(4)加入硫酸銨30% (v/v)至稍混濁一離心取上清(7000rpm，離心10min);
(5)先去熱原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸緩沖液平衡，過(guò)S印hacryl S-200層析柱，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)收集目標(biāo)洗脫峰，其中通過(guò)吸附法進(jìn)行去熱原；
(6)將充分浸泡后的S印hadex G-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7. 0的PBS緩沖液，過(guò)S印hadex G-75色譜柱，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)收集目標(biāo)洗脫液，其中通過(guò)吸附法進(jìn)行去熱原； (7)得到純度高于97. 5%的干擾素原液，置于4。C冰箱保存。
實(shí)施例2 :豬Y -干擾素的活性測(cè)試 對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)豬Y _干擾素的后續(xù)純化結(jié)果(取3批)進(jìn)行檢測(cè) (1)生物活性檢測(cè)采用半數(shù)細(xì)胞抑制病變法，應(yīng)用VSV-MDBK系統(tǒng)。參照《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版。 (2)SDS-PAGE測(cè)產(chǎn)品的純度分離膠15%，濃縮膠5%，上樣量10ii g，考馬斯亮藍(lán)250染色。 (3)HPLC分析產(chǎn)物純度采用C18柱，柱長(zhǎng)250mmX4. 6mm，以0_70%乙腈-0. 1%
TFA做線性梯度洗脫。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1 : 表1
產(chǎn)品批號(hào)123
生物活性(IU/mL)6. 78X1066. 39X1064. 98X106
SDS-PAGE檢測(cè)純度(％ )97. 697. 897. 6
HPLC檢測(cè)純度(% )100100100 由表l數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明所得到的三批豬Y-干擾素的純度均高于97. 5%，且活性均達(dá)到106IU/mL以上。 通過(guò)上述實(shí)施例，我們發(fā)現(xiàn)所純化的Y干擾素具有預(yù)期的活性，并且本發(fā)明的純化方法無(wú)需使用價(jià)格昂貴的單抗柱，避免了單抗脫落造成的污染，縮短了純化時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本，最終可得到純度高于97.5%的干擾素，具有廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)。
權(quán)利要求
一種生產(chǎn)γ-干擾素的純化方法，步驟包括(1)重組菌株進(jìn)行發(fā)酵；(2)離心發(fā)酵液(6500rpm，離心15min)取上清，通過(guò)微濾除雜、超濾濃縮；(3)濃縮液過(guò)陽(yáng)離子層析柱(CM Sepharose柱層析)，以A液(20mM NH4Ac，pH8)和B液(20mM NH4Ac，0.7M NaCl，pH8)組成的離子強(qiáng)度遞增溶液洗脫，收集第四個(gè)峰；(4)加入硫酸銨30％(v/v)至稍混濁，離心取上清(7000rpm，離心10min)；(5)過(guò)Sephacryl S-200凝膠層析柱，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)收集目標(biāo)洗脫峰；(6)過(guò)Sephadex G-75色譜柱，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)收集目標(biāo)洗脫液；(7)得到純度高于97.5％的干擾素原液，置于4℃保存。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中在實(shí)施步驟5之前，先去熱原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸緩沖液平衡，上樣。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中去熱原的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸堿法、其它方法等，優(yōu)選是吸附法。
4. 權(quán)利要求l所述的方法，其中在實(shí)施步驟6之前，將充分浸泡后的S印hadex G-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7. 0的PBS緩沖液平衡，上樣。
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其中去熱原的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸堿法、其它方法等，優(yōu)選是吸附法。
6. 權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的重組菌株大腸桿菌工程菌、酵母(如畢赤酵母)工程菌、重組病毒，優(yōu)選酵母工程菌。
7. 權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的y干擾素畜用y干擾素、禽類(lèi)y干擾素、魚(yú)類(lèi)y干擾素，優(yōu)選豬y干擾素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)高純度γ-干擾素的純化方法，生產(chǎn)步驟包括發(fā)酵、粗提發(fā)酵液、陽(yáng)離子層析柱純化、硫酸銨純化、Sephacryl S-200層析柱純化、Sephadex G-75色譜柱純化等，其中在層析之前先去熱原。本發(fā)明方法無(wú)需要單克隆抗體層析柱，能經(jīng)濟(jì)、快速、高效地獲得純度高于97.5％γ-干擾素，在γ-干擾素的生產(chǎn)和研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P21/04GK101759768SQ20081015434
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者李旭東, 王麗娟, 蘇建東 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司