專(zhuān)利名稱(chēng)：：加強(qiáng)表達(dá)n-乙酰谷氨酸激酶的重組鈍齒棒桿菌及該菌的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：加強(qiáng)表達(dá)N-乙酰谷氨酸激酶的重組鈍齒棒桿菌及該菌的應(yīng)用，本發(fā)明涉及利用L-精氨酸循環(huán)合成途徑中關(guān)鍵酶基因在鈍齒棒桿菌中的加強(qiáng)表達(dá)，以提高L-精氨酸產(chǎn)量，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：L-精氨酸(L-arginine)是人體和動(dòng)物體內(nèi)的半必需堿性氨基酸，是合成蛋白質(zhì)肌酸的重要原料，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝產(chǎn)物，具有多種獨(dú)特的生理和藥理作用。L-精氨酸在臨床醫(yī)藥、食品、化妝品及有關(guān)生物研究領(lǐng)域中用途廣泛。發(fā)酵法是目前L-精氨酸商業(yè)化生產(chǎn)比較有效和經(jīng)濟(jì)的方法。在原核微生物中，L-Arg的合成是從谷氨酸開(kāi)始，經(jīng)歷了8種酶催化而成。首先，谷氨酸的氨基基團(tuán)在由wgA基因編碼的乙酰谷氨酸合成酶的作用下乙?；阴；饔眉茸柚沽俗园l(fā)環(huán)化又阻止了谷氨酸羧基基團(tuán)被修飾形成脯氨酸。此途徑的第5步是乙酰鳥(niǎo)氨酸在酶的作用下脫去乙?；鶊F(tuán)形成鳥(niǎo)氨酸，根據(jù)脫乙?；鶊F(tuán)方式的不同，L-Arg的合成代謝途徑分為2種，一種稱(chēng)之為線形途徑，即乙酰鳥(niǎo)氨酸在由"rgE基因編碼的乙酰鳥(niǎo)氨酸酶的水解作用下形成L-Arg前體物—鳥(niǎo)氨酸；另一種稱(chēng)之為循環(huán)途徑，即乙酰鳥(niǎo)氨酸在由wgJ基因編碼的鳥(niǎo)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下形成鳥(niǎo)氨酸的同時(shí)，乙酰基團(tuán)被轉(zhuǎn)移至谷氨酸形成乙酰谷氨酸，在此途徑中，鳥(niǎo)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出二重功能——既具有乙酰鳥(niǎo)氨酸酶的功能又具有乙酰谷氨酸合成酶的功能，故此途徑又稱(chēng)為經(jīng)濟(jì)循環(huán)途徑，在腸桿菌卩^Esr/2eWCco/z、假單胞銅綠菌卩尸sewt/omo"osaen/gz>asa」及古細(xì)菌中的硫化裂片菌(^"http://0勵(lì)脂0//"^/^以線形途徑生產(chǎn)1^八巧，而迄今研究過(guò)的所有其他原核微生物，包括嗜溫性古細(xì)菌、桿狀脂肪嗜熱菌f^^///w他araf/2emo;Mws」、奈瑟氏淋球菌f"iVe/^m'agowwrZoeae」及桿菌屬，以及真核微生物都采用循環(huán)途徑。有報(bào)道表明，在腸桿菌中，合成L-Arg的第1個(gè)酶——乙酰谷氨酸合成酶是終產(chǎn)物L(fēng)-Arg反饋抑制的靶目標(biāo)；而采用循環(huán)途徑的微生物，被L-Arg抑制的關(guān)鍵酶是合成途徑的第2個(gè)酶——乙酰谷氨酸激酶或第5個(gè)酶一鳥(niǎo)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。谷氨酸棒桿菌中被L-Arg抑制的關(guān)鍵酶是乙酰谷氨酸激酶，此酶不僅被L-Arg反饋抑制亦被其反饋?zhàn)瓒?。隨著我國(guó)醫(yī)藥營(yíng)養(yǎng)水平的提高，對(duì)精氨酸的需求日益增長(zhǎng)，但傳統(tǒng)生產(chǎn)L-Arg的高產(chǎn)菌株大多采用誘變篩選的方法獲得，但此法有盲目性高、工作量大，且存在突變株生理失調(diào)、易退化等局限性；DNA重組技術(shù)出現(xiàn)以后，人們開(kāi)始探索利用DNA重組技術(shù)調(diào)控合成Arg代謝途徑，以達(dá)到提高L-Arg產(chǎn)量的目的。鈍齒棒桿菌(0^y"eZ^cfen'wwcre"Www)是我國(guó)研究者分離到的一種鈍齒狀、無(wú)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌，其突變株在國(guó)內(nèi)氨基酸生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，但對(duì)其遺傳背景的研究還處于空白狀態(tài)。鈍齒棒桿菌Cx^""^wSYPA是本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的高產(chǎn)精氨酸突變菌株。C.c^"加wm利用循環(huán)途徑合成精氨酸，乙酰谷氨酸激酶(NAGK)等是合成途徑中的關(guān)鍵酶，有些可受到產(chǎn)物精氨酸的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簟＠么x工程提高L-精氨酸產(chǎn)量最重要的策略之一就是提高關(guān)鍵酶酶量，借助于基因克隆與表達(dá)技術(shù)，將L-Arg生物合成途徑中的關(guān)鍵酶編碼基因?qū)肷a(chǎn)菌中，通過(guò)增加基因劑量和更換表達(dá)調(diào)控元件，強(qiáng)化表達(dá)，從而達(dá)到提高精氨酸產(chǎn)量的目的。導(dǎo)入的關(guān)鍵酶基因既可以是生產(chǎn)菌自身的內(nèi)源基因，也可是來(lái)自非生產(chǎn)菌的外源基因。鈍齒棒桿菌(Cw7"e6a"w/wmc^""/wm)SYPA是革蘭氏陽(yáng)性工業(yè)用菌株，尚未見(jiàn)鈍齒棒桿菌的遺傳表達(dá)體系的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株加強(qiáng)表達(dá)N-乙酰谷氨酸激酶的重組鈍齒棒桿菌及該菌的應(yīng)用，克隆來(lái)自高產(chǎn)精氨酸突變菌株C."e"WwmSYPA的精氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因wgB，再通過(guò)鈍齒棒桿菌表達(dá)載體構(gòu)建重組鈍齒棒桿菌來(lái)增強(qiáng)其合成途徑中酶的表達(dá)，從而提高發(fā)酵過(guò)程中目的產(chǎn)物L(fēng)-Arg的產(chǎn)量和收率。本發(fā)明的技術(shù)方案一株加強(qiáng)表達(dá)N-乙酰谷氨酸激酶的重組鈍齒棒桿菌，其分類(lèi)命名為鈍齒棒桿菌(Co7j"ek"en'MWSYPA/pJC1-toc-argB，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M208133。所述的重組鈍齒棒桿菌，其構(gòu)建所用的表達(dá)載體pJCl-toc-wgB，采用toe啟動(dòng)子。所述的重組鈍齒棒桿菌，是首次擴(kuò)增了來(lái)自產(chǎn)精氨酸的鈍齒棒桿菌的精氨酸合成途徑關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶編碼基因argB。所述的重組鈍齒棒桿菌，達(dá)到鈍齒棒桿菌自身的合成精氨酸關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶的加強(qiáng)表達(dá)，來(lái)提高發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸的產(chǎn)量。所述重組鈍齒棒桿菌的構(gòu)建方法，將來(lái)自于鈍齒棒桿菌循環(huán)途徑合成精氨酸的關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶NAGK編碼基因"《B，構(gòu)建鈍齒棒桿菌表達(dá)載體pJCl-toc-"巧B;將該表達(dá)載體pJCl-toc-fl^B電轉(zhuǎn)入鈍齒棒桿菌SYPA中，獲得了重組鈍齒棒桿菌(Co，e6acfen.謂crewaf應(yīng))SYPA/pJCl-fac-argB;(1)獲得toc啟動(dòng)子根據(jù)GenBank公布的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因c^序列，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)從質(zhì)粒pAC中擴(kuò)增出o^序列，引物設(shè)計(jì)如下pCm1100F五coRI:5，-CGCG^rrCTTCGAATTTCTGCCATTCATC國(guó)3'pCm1100R歷"dIII:5，-CGC^GCr7GCGGTGCTTTTGCCGTTACG-3'以pAC為模板，以pCmllOOF五coRI和pCmll00R歷"din為引物，PCR獲得含有&oRI與歷"din兩個(gè)酶切位點(diǎn)的ca/片段，與pMD18-T連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-c加，將克隆載體pMD18-T-c^轉(zhuǎn)化至co//JM109受體菌，涂布于含氨芐青霉素Amp、異丙基-P-D-硫代半乳糖苷IPTG、半乳糖類(lèi)似物X-gal的LB瓊脂平板上，37'C培養(yǎng)過(guò)夜后，平板上長(zhǎng)出許多藍(lán)色、白色菌落；隨機(jī)挑取白色克隆，酶切鑒定后測(cè)序，用五coRI與/^'mil11雙酶切得到含有￡"RI與/7/"din兩個(gè)酶切位點(diǎn)的c"/片段，與同樣酶切的pEtac連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后在卡那霉素和氯霉素抗性LB平板篩選得到轉(zhuǎn)化子，獲得質(zhì)粒pEtac-cat;根據(jù)pEtac的全序列及C^的序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增-^^"/-基因；引物設(shè)計(jì)PtacF5'-AAAACrGC4GGGAGCTTATCGACTGCACG醫(yī)3'PT7R戶(hù)"I:5'-AAAACrGC4GATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3'以pEtac-c^為模板，PtacF尸Wl，PT7R/^/I為引物，高保真PCR獲得基因片段-toc-pramofe^^-r7^m'"ator-，與同樣酶切的pJCl連接轉(zhuǎn)化，涂布卡那霉素抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證，即獲得重組質(zhì)粒pJCl-toc-c""(2)構(gòu)建鈍齒棒桿菌表達(dá)載體pJCl-toc-"rgB:根據(jù)GenBank中公布的谷氨酸棒桿菌編碼乙酰谷氨酸激酶基因wgB核苷酸序列設(shè)計(jì)引物如下上游引物Pl:5'-CGCGTCGACGGTCATCAGTGACGGTTGC-3'下游引物P2:5'畫(huà)CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAG-3'以C.cm^wm基因組DNA為模板，反應(yīng)體系為取DNA模板1pL，10xExPCR緩沖液5pL，上、下游引物各1(iL，dNTPs4(^L，ExTaqDNA聚合酶0.5pL，總反應(yīng)體積為50^L;PCR擴(kuò)增參數(shù)為94'C變性1.5min，55'C復(fù)性1min，72'C延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)；所得片段膠回收后與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化￡."/^]^1109，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；提取質(zhì)粒酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-wgB，并測(cè)序；將pMD18-T-wgB雙酶切，膠回收wgB片段，將其與經(jīng)相同酶切線性化的表達(dá)載體pJCl-toc連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pJCl-tac-a《B;(3)獲得重組鈍齒棒桿菌SYPA/pJCl-tac-argB提取質(zhì)粒pJCl-tac-argB，用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化鈍齒棒桿菌SYPA，涂布于含1(^g/mL卡那霉素的含葡萄糖LB平板，36h后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，即獲得重組鈍齒棒桿菌SYPA/pJCl-tac-argB。用所述重組鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的方法出發(fā)菌株為重組鈍齒棒桿菌SYPA/pJCl-tac-argB;培養(yǎng)基組成搖瓶種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖30，玉米漿20，(NH4)2S0420，KH2PO4l，MgS04*7H200.5，尿素1.5，pH7.07.2，121。C滅菌20min，裝液量20mL/250mL;搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖150，玉米槳4，(NH4)2S0420，KH2P041.5，MgS047H200.5，F(xiàn)eSO47H200.02，MnSO4H200.02，生物素8XIO國(guó)5，L-組氨酸5X1(T4，CaC0330;pH7.07.2,121。C滅菌10min，20mL/250mL三角瓶；罐上發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖150，玉米漿4,(NH4)2S0420，KH2P041.5，MgS047H200.5，F(xiàn)eS047H200.02，MnS04H200.02，生物素8X10-5,L-組氨酸5X10—4，氨水控制pH7.07.2，121。C滅菌10min，裝液量3L/5L發(fā)酵罐；培養(yǎng)條件種子培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基平板中挑取鈍齒棒桿菌單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，150r/min，3(TC培養(yǎng)15h;搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)后，按5%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中置往復(fù)式搖床，110r/min，30。C培養(yǎng)96h;5L發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝液量3L，接種量5%10%，31°C，轉(zhuǎn)速600r/min，通氣量3L/min，用氨水連續(xù)流加控制pH為7.07.2，培養(yǎng)96h。本發(fā)明以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(c"f)作為報(bào)告基因，成功構(gòu)建了含有toc啟動(dòng)子的鈍齒棒桿菌表達(dá)系統(tǒng)，并對(duì)其在大腸桿菌和鈍齒棒桿菌中的啟動(dòng)子活性進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌和鈍齒棒桿菌中toc啟動(dòng)子均具有啟動(dòng)子功能，且在不誘導(dǎo)的條件下也存在一定的本底表達(dá)。s其中argB可替換為循環(huán)途徑中的其他關(guān)鍵酶的編碼基因包括wgC,wgD,本發(fā)明的有益效果成功構(gòu)建了攜帶有來(lái)源于鈍齒棒桿菌SYPA精氨酸合成關(guān)鍵酶基因"rgB的表達(dá)質(zhì)粒pJCl-to。w^等，并電轉(zhuǎn)入鈍齒棒桿菌SYPA。挑取了8個(gè)鈍齒棒桿菌轉(zhuǎn)化子C.c(pJCl-tac-wgB)并通過(guò)搖瓶發(fā)酵挑選出精氨酸產(chǎn)量最高的轉(zhuǎn)化子C.c2，對(duì)N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)進(jìn)行了酶活和發(fā)酵特性做了初步分析。C.c2中NAGK的酶活為44.5U/g，與出發(fā)菌株C.crew"fwmSYPA中NAGK的酶活31.2U/g相比提高了約42.6%;L-精氨酸產(chǎn)量達(dá)35.8g/L與出發(fā)菌株C.cre"^wmSYPA的29.8g/L相比提高了約23.4%。通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)發(fā)酵液中氨基酸的定量分析，證明了NAGK的過(guò)量表達(dá)大大的促進(jìn)了前體物質(zhì)谷氨酸的利用率并促使谷氨酸的代謝流大量流向精氨酸生成的途徑，提高精氨酸的產(chǎn)量。圖l重組質(zhì)粒pJCl-tac-cat的構(gòu)建。圖2質(zhì)粒pEtac-cat的酶切驗(yàn)證圖；1:rDNA/HindIIImarker;2:pEtac-cat/EcoRl+HindIII雙酶切；3:pEtac-28a/EcoRl+HindIII雙酶切；4:catPCR產(chǎn)物；5:DL2000Marker。圖3質(zhì)粒pJCl-toc-caf的酶切驗(yàn)證圖；l:rDNA/HindIIImarker;2:pJCl/pJCII單酶切；3:-taC"prawoter-cat-T7terminator-PCR產(chǎn)物；4:pJCl-tac-cat/PstI單酶切；5:DL2000Marker。圖4啟動(dòng)子強(qiáng)度的初步確定；Ctac(b)，'誘導(dǎo)前C.C.(pJCl-tac-cat/);Ctac(a):8誘導(dǎo)后C.C.(pJCl-toc-cW)。圖5重組質(zhì)粒pJCl-toc-wgB的構(gòu)建。圖6質(zhì)粒pJCl-toc-wgB的酶切驗(yàn)證圖；1、DNAMarkerDL2000;2、argBgene;3pJC1-tac/5<amHI+Sa/I;4、pJCl-tac-argB/5ofmHI;5、pJCl-tac-argB/B畫(huà)HI+Sa/I;6、XDNA/歷"dl11。圖7發(fā)酵精氨酸過(guò)程參數(shù)隨時(shí)間的變化；(A)菌體生長(zhǎng)曲線；(B)發(fā)酵精氨酸累積曲線；(C)糖的消耗曲線。生物材料樣品保藏一株加強(qiáng)表達(dá)N-乙酰谷氨酸激酶的重組鈍齒棒桿菌，其分類(lèi)命名為鈍齒棒桿菌(Cwj"Wac'ten'wwSYPA/pJC，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2008年9月22日，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M208133。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CW作為報(bào)告基因的鈍齒棒桿菌遺傳表達(dá)體系的構(gòu)建根據(jù)GenBank公布的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cW序列，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)從質(zhì)粒pAC中擴(kuò)增出c^序列。引物設(shè)計(jì)如下pCml100F￡coRI:5，-CGCG^rrCTTCGAATTTCTGCCATTCATC-3，pCm1100R倫dIII:5,畫(huà)CGCA4GC77iGCGGTGCTTTTGCCGTTACG-3'以質(zhì)粒pAC為模板，以pCmllOOF五coRI和pCmllOOR///"dIII為引物，反應(yīng)體系為取DNA模板1pL，10xExPCR緩沖液5pL，上、下游引物各1pL，dNTPs4pL，ExTaqDNA聚合酶0.5pL，總反應(yīng)體積為50|JL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94。C變性1.5min，55'C復(fù)性1min，72""C延伸1min，30個(gè)循環(huán)；PCR獲得含有五coRI與/f/"din兩個(gè)酶切位點(diǎn)的c^片段，與pMD18-T連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-cafRl+歷"dIII)。將克隆載體pMD18-T-c^(￡coRI+歷"dIII)轉(zhuǎn)化至五.co//JM109受體菌，涂布于含氨芐青霉素Amp、異丙基-P-D-硫代半乳糖苷IPTG、半乳糖類(lèi)似物X-gal的LB瓊脂平板上，37'C培養(yǎng)過(guò)夜后，平板上長(zhǎng)出許多藍(lán)色、白色菌落。隨機(jī)挑取白色克隆，酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，用EcoRI與//z'"dIII雙酶切得到含有五coRI與///"dill兩個(gè)酶切位點(diǎn)的caf片段，與同樣酶切的pEtac連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后在卡那霉素和氯霉素抗性LB平板篩選得到轉(zhuǎn)化子，獲到質(zhì)粒pEtac-cW。圖2所示為重組質(zhì)粒pEtac-a^酶切驗(yàn)證結(jié)果。根據(jù)pEtac的全序列及CW的序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增-toc-cW-基因。引物設(shè)計(jì)如下PtacF尸WI:5'-AAAACrGC4GGGAGCTTATCGACTGCACG-3'PT7R尸WI:5'-AAAACrGC4GATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3'以pEtac-c^為模板，PtacF尸Wl，PT7R/^I為引物，反應(yīng)體系為取DNA模板1|iL，10xExPCR緩沖液5|iL，上、下游弓l物各1|iL，dNTPs4pL,ExTaqDNA聚合酶0.5(iL，總反應(yīng)體積為50|aL;PCR擴(kuò)增參數(shù)為94'C變性1.5min，57'C復(fù)性1min，72°〇延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)；PCR獲得基因片段-toc-/ramo^-c^-77^Tm'"Wor-，與同樣酶切的pJCl連接轉(zhuǎn)化，涂布卡那霉素抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證，即獲得重組質(zhì)粒pJCl-toc-c^(圖1)?；?qū)⑺没蚱?toe-pramofer-caf-77fenm'"ator-以相同方法連接pMD18-T載體后測(cè)序。然后用尸WI單酶切-tac畫(huà);ra/wofer-c^畫(huà)r7fem2/"ator-后，備用，使得不必每次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以簡(jiǎn)化操作。圖3所示為重組質(zhì)粒pJCl酶切驗(yàn)證結(jié)果。重組質(zhì)粒pEtac-c^經(jīng)五coiI與i^w/in雙酶切后獲得約650bp和5622bp的DNA片段，分別與cw基因片段和質(zhì)粒pEtac的大小一致。重組質(zhì)粒pJCl-toc-c^經(jīng)/VI酶切后獲得約1098b的DNA片段，大小與PCR獲得的-too/rawofer-cW-r7^Tm'"她r-片段一致。以上結(jié)果證明重組質(zhì)粒pJCl-toc-c^構(gòu)建正確。提取質(zhì)粒pJCl-toc-c^，用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化鈍齒棒桿菌SYPA，涂布于含20嗎/mL卡那霉素的含葡萄糖LB平板，約36h后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取若干菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒。質(zhì)粒的酶切結(jié)果及線性化大小都與目的質(zhì)粒一致。實(shí)施例2:以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因c^H乍為報(bào)告基因的鈍齒棒桿菌遺傳表達(dá)體系的初步評(píng)價(jià)挑取在含20pg/mL卡那霉素的平板生長(zhǎng)的鈍齒棒桿菌菌落接種LB培養(yǎng)基，于3(TC搖床培養(yǎng)至OD6o。達(dá)到0.6后，加入IPTG至終濃度為20|imol/L，誘導(dǎo)4h。將誘導(dǎo)后的菌體接種于不同濃度的氯霉素抗性平板上，培養(yǎng)生長(zhǎng)，初步確定啟動(dòng)子的強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前后的重組子pJCl-toc-^能在氯霉素抗性平板上生長(zhǎng)，而對(duì)照(不含重組質(zhì)粒pJCl-to"加)不能在氯霉素抗性平板上生長(zhǎng)。說(shuō)明toc啟動(dòng)子在鈍齒棒桿菌中具有啟動(dòng)子的功能。且toc啟動(dòng)子在鈍齒棒桿菌中有本底表達(dá)。接下來(lái)，將誘導(dǎo)前后的CX.(pJCl-加-^)分別接種于不同濃度的氯霉素抗性平板上，初步測(cè)定各啟動(dòng)子的強(qiáng)度。圖4所示，為C.C(pJCl-tac-c^)的表達(dá)量。為了更準(zhǔn)確的確定啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，進(jìn)一步對(duì)C.C.(pJCl-toc-c^)所表達(dá)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的酶活進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如表l所示，比活力的總趨勢(shì)與平板實(shí)驗(yàn)是一致的，toc啟動(dòng)子在誘導(dǎo)前有本底表達(dá)，誘導(dǎo)后的表達(dá)量更高。表l不同菌株的CAT比活力<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例3:C.cwmmw合成精氨酸的關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)在鈍齒棒桿菌中的克隆與表達(dá)根據(jù)GenBank中公布的谷氨酸棒桿菌編碼乙酰谷氨酸激酶基因wgB核苷酸序列設(shè)計(jì)引物如下上游引物PI:5'-CGCGTCGACGGTCATCAGTGACGGTTGC-3'下游引物P2:5'-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAG-3'(五coRI)以Ccrew^wm基因組DNA為模板，反應(yīng)體系為取DNA模板1jxL，10xExPCR緩沖液5[iL，上、下游引物各1iiL，dNTPs4(iL，ExTaqDNA聚合酶0.5nL，總反應(yīng)體積為50(iL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94。C變性1.5min，55t:復(fù)性1min，72"C延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)；所得片段膠回收后與克隆載體pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化五.co/"M109，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-wgB，并測(cè)序。將pMD18-T-wgB雙酶切，膠回收wgB片段，將其與經(jīng)相同酶切線性化的表達(dá)載體pJCl-toc連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pJCl-toc-wgB，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布卡那霉素抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證，即獲得重組質(zhì)粒pJCl佳-，B(圖5)。如圖6所示，pJCl-toc-a^B酶切驗(yàn)證結(jié)果。重組質(zhì)粒pJCl-toc-a^B經(jīng)酶切后獲得約1000bp的DNA片段，大小與PCR獲得的片段一致。以上結(jié)果證明重組質(zhì)粒pJCl-toc-wgB構(gòu)建正確。提取質(zhì)粒pJCl-toc-a^B，用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化鈍齒棒桿菌，涂布于含10pg/mL卡那霉素的含葡萄糖LB平板，約36h后長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取若干菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒。質(zhì)粒的酶切結(jié)果及線性化大小都與目的質(zhì)粒一致，證明鈍齒棒桿菌重組菌CC.(pJC1-toc-wgB)構(gòu)建成功。獲得重組鈍齒棒桿菌C.C.(pJCl-tac-a^B)后，對(duì)其進(jìn)行NAGK的表達(dá)研究。挑選一C.C(pJCl-toc-a^B)轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株C.tTe"aft/mSYPA接種于LB加0.5%葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，以10%的接種量再轉(zhuǎn)接于LB加0.5%葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)9h后收集菌體，測(cè)得重組NAGK酶活為44.5U/g，出發(fā)菌株NAGK酶活為31.2U/g，提高約42.6%，結(jié)果如表2所示。說(shuō)明質(zhì)粒pJCl-toc-"rgB在C.SYPA成功表達(dá)。表2重組酶活力分析<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例4:重組菌與出發(fā)株C.cre朋^mSYPA的發(fā)酵產(chǎn)精氮酸特性比較:發(fā)酵條件如上本發(fā)明的技術(shù)方案所述。挑取了8個(gè)重組鈍齒棒桿菌轉(zhuǎn)化子C.c(pJCl-tac-a^B)和出發(fā)菌株C.cmwfwmSYPA同時(shí)搖瓶發(fā)酵，將8個(gè)轉(zhuǎn)化子分別命名為Cx(1-8)，每個(gè)轉(zhuǎn)化子做3個(gè)發(fā)酵平行，振蕩培養(yǎng)96h后，測(cè)定其精氨酸產(chǎn)量，其中轉(zhuǎn)化子C.c2產(chǎn)量最高，較出發(fā)菌株C.we""^mSYPA產(chǎn)酸水平提高了約21.4%，具體結(jié)果如表3所示。表3重組鈍齒棒桿菌轉(zhuǎn)化子的精氨酸產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>選擇重組鈍齒棒桿菌C.c2和出發(fā)菌株C.cre"WwmSYPA同時(shí)上發(fā)酵罐培養(yǎng)96h，在不同時(shí)間分別取樣分析對(duì)比兩者的發(fā)酵特性。發(fā)酵結(jié)果如圖7所示，由圖7(A)可以看出在相同的培養(yǎng)條件下，C.c2和出發(fā)菌株C.c^""ft^SYPA的生長(zhǎng)曲線基本一致，從開(kāi)始測(cè)定的8h到40h為菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從40h到96h為菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期也是精氨酸生產(chǎn)的關(guān)鍵時(shí)期，96h之后菌體開(kāi)始衰退，進(jìn)入了生長(zhǎng)衰亡期，此時(shí)發(fā)酵液的粘稠度明顯增大，出現(xiàn)了菌體大量自溶現(xiàn)象。但由圖7(A)可以看出，C.c2的生長(zhǎng)情況較出發(fā)菌株稍差。圖7(B)是精氨酸的生產(chǎn)曲線，Cc2在40h以?xún)?nèi)精氨酸的產(chǎn)量與出發(fā)菌株并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，可能是由于在菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不是精氨酸的大量生成時(shí)期，且重組菌Cx2生長(zhǎng)速度較慢的原因。進(jìn)入菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期后由圖可以看出精氨酸大量合成，重組菌C.c2產(chǎn)精氨酸的優(yōu)勢(shì)也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，在88h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高，較出發(fā)菌株C.cre"WMmSYPA的最高產(chǎn)量提高約23.4%。由圖7(C)可知C.c2和出發(fā)菌株C.cre"WwmSYPA的耗糖情況基本沒(méi)有差別，因此碳源的代謝流向可能是引起重組菌的生長(zhǎng)差異和產(chǎn)精氨酸差異的重要原因。實(shí)施例5:重組鈍齒棒桿菌C.c2與出發(fā)菌株C.c^"W"rnSYPA發(fā)酵液氨基酸色譜儀分析根據(jù)L-精氨酸合成的代謝網(wǎng)絡(luò)，影響L-精氨酸合成的主要節(jié)點(diǎn)是丙酮酸和谷氨酸節(jié)點(diǎn)。谷氨酸是精氨酸合成的前體物質(zhì)，是合成L-精氨酸9步直鏈反應(yīng)的第一反應(yīng)物，它的積累量和流量分配直接關(guān)系到積累L-精氨酸的量，但同時(shí)谷氨酸也是脯氨酸合成支路的前體，因此谷氨酸和脯氨酸的積累量是我們研究NAGK的過(guò)量表達(dá)對(duì)精氨酸代謝影響的重要參照。將上述C.c2及C.cre"a&mSYPA發(fā)酵罐培養(yǎng)88h后發(fā)酵液于12000r/min離心10min，取上清液稀釋50倍后用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)發(fā)酵液中氨基酸定量測(cè)定，表4為谷氨酸、脯氨酸和精氨酸的定量測(cè)定結(jié)果。表4谷氨酸、脯氨酸和精氨酸的定量測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表4可知C.c2發(fā)酵液中谷氨酸和脯氨酸的含量分別比原始菌株C.cre加似mSYPA發(fā)酵液中的谷氨酸和脯氨酸的含量降低了80.3%和57.8%，而精氨酸的產(chǎn)量卻比C.cre加^mSYPA提高了23.4%。因此根據(jù)以上數(shù)據(jù)可以看出，在Cc2中過(guò)量表達(dá)產(chǎn)精氨酸關(guān)鍵酶NAGK大大加強(qiáng)了前體谷氨酸的利用率，且讓谷氨酸的代謝流大量流向精氨酸的合成途徑同時(shí)削弱了脯氨酸的合成，從而達(dá)到提高精氨酸產(chǎn)量的目的。實(shí)施例6:重組鈍齒棒桿菌質(zhì)粒穩(wěn)定性研究對(duì)重組鈍齒棒桿菌C.c2進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)定，每隔24h取樣直到發(fā)酵結(jié)束，試驗(yàn)結(jié)果表明到發(fā)酵結(jié)束質(zhì)粒穩(wěn)定性為95%，質(zhì)?；颈３址€(wěn)定。如表5所示。表5重組鈍齒棒桿菌Cc2質(zhì)粒穩(wěn)定性研究<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1、一株加強(qiáng)表達(dá)N-乙酰谷氨酸激酶的重組鈍齒棒桿菌，其分類(lèi)命名為鈍齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum)SYPA/pJC1-tac-argB，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM208133。全文摘要加強(qiáng)表達(dá)N-乙酰谷氨酸激酶的重組鈍齒棒桿菌及該菌的應(yīng)用，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的一株加強(qiáng)表達(dá)N-乙酰谷氨酸激酶NAGK的重組鈍齒棒桿菌，其分類(lèi)命名為鈍齒棒桿菌SYPA/pJC1-tac-argB，保藏編號(hào)為CCTCCNOM208133；將來(lái)自于鈍齒棒桿菌循環(huán)途徑合成精氨酸的關(guān)鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶編碼基因argB，構(gòu)建鈍齒棒桿菌表達(dá)載體pJC1-tac-argB；將該表達(dá)載體pJC1-tac-argB電轉(zhuǎn)入鈍齒棒桿菌SYPA中，獲得了重組鈍齒棒桿菌SYPA/pJC1-tac-argB；過(guò)量表達(dá)N-乙酰谷氨酸激酶大大加強(qiáng)了前體谷氨酸的利用率，讓谷氨酸的代謝流大量流向精氨酸的合成途徑，同時(shí)削弱了脯氨酸的合成，達(dá)到提高精氨酸產(chǎn)量的目的，精氨酸的產(chǎn)量比C.crenatumSYPA提高了23.4％。文檔編號(hào)C12N9/12GK101381698SQ20081015513公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者張曉梅,徐美娟,竇文芳,許正宏,許泓瑜,饒志明申請(qǐng)人:江南大學(xué)