專利名稱：惡臭假單胞菌gna5菌株及其制備d-氨基葡萄糖酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物領(lǐng)域，具體涉及一種惡臭假單胞菌(/^ewcfowo"oy ;w"^) GNA5菌株及其制備D-氨基葡萄糖酸的方法。
技術(shù)背景D-氨基葡萄糖酸(D-Glucosaminicacid)，化學(xué)名為2-氨基-3, 4， 5, 6-四羥基 己酸，是一種很有前景的調(diào)味料，可以作為具有抗病毒、抗腫瘤效果的手性氨基 酸衍生物等的合成原料。該物質(zhì)生物相容性好，與金屬鉻離子形成的配合物，具 有醫(yī)用降糖作用；與金屬鉑形成的配合物在治療癌癥方面有較好的應(yīng)用前景。除 此之外，D-氨基葡萄糖酸作為一種陽離子配位劑，有望在帶電生物分子的色譜分 離中得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)有報道中D-氨基葡萄糖酸的制備方法有三種化學(xué)氧化法，Pringsheim (Chem. Ges., 48: 680-682.)等報道了采用醋酸汞氧化D-氨基葡萄糖 (D-glucosamine)來制備，但該法氧化程度不易控制，選擇性差，收率低；酶轉(zhuǎn) 化法，Pezzotti等(Carbohydr.Res.，340: 139-141)利用葡萄糖氧化酶耦聯(lián)過氧化 氫酶，以D-氨基葡萄糖為原料制備D-氨基葡萄糖酸，但葡萄糖氧化酶對D-氨基 葡萄糖的催化效率只有葡萄糖的2 %，該研究利用大量增加酶的用量或延長反應(yīng) 時間可有效提高催化效率，經(jīng)過72小時酶反應(yīng)，收率達76 %;微生物法制備D-氨基葡萄糖酸因轉(zhuǎn)化率較高而受到關(guān)注，但發(fā)酵中高濃度底物D-氨基葡萄糖對菌 株及相關(guān)轉(zhuǎn)化酶有一定的抑制，現(xiàn)有報道中發(fā)酵氧化法的底物濃度不超過IO g/L (Jap. Pat: S59-014787.1984-01-25; Appl. Microbiol. Biotechnol.， 66: 253—258)。 其次， 一般來說，產(chǎn)D-氨基葡萄糖酸的菌株具有進一步分解代謝產(chǎn)物的能力，往 往需要添加a-溴代丙酸鈉等抑制劑來促進產(chǎn)物的積累(Jap. Pat S59-014787. 1984-01-25) 。 Moonmangmee等利用高濃度的干燥后G/wco"o&fl"er/r加ewn'!' IFO 3246菌體，有效地克服了底物抑制等現(xiàn)象；轉(zhuǎn)化體系中，底物D-氨基葡萄糖鹽酸 鹽的濃度為100 g/L， G/wco"o6a"w ^a,ewn7 IFO 3246的添加量為0.1g干菌體/g底物，摩爾轉(zhuǎn)化率達到80%以上。由于菌體添加量大，帶來了副反應(yīng)，使得轉(zhuǎn)化 率并不高。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種惡臭假單胞菌(Pwi^omo"oy /7Mric/a) GNA5菌株 并用其制備D-氨基葡萄糖酸的方法，解決氧化發(fā)酵D-氨基葡萄糖制備D-氨基葡 萄糖酸過程中，菌株不能耐受高濃度D-氨基葡萄糖及對產(chǎn)物D-氨基葡萄糖酸代 謝能力強的問題。本發(fā)明以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽為唯一碳源和能源對不同來源的土樣進行篩 選，共選得若干株能快速代謝D-氨基葡萄糖的菌株，再從其中篩選到能夠轉(zhuǎn)化 D-氨基葡萄糖制備D-氨基葡萄糖酸的菌株。其間采用紙層析法檢測不同培養(yǎng)時 間發(fā)酵液中D-氨基葡萄糖酸的生成情況，選取轉(zhuǎn)化率高的菌株 戶Wa GNA5。該菌株已送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為 CCTCCM208138,保藏日期為2008年9月27號。本發(fā)明篩選到的Aew/owo"cw戸Wa GNA5菌株為革蘭氏陰性菌，無芽孢， 桿狀。經(jīng)BIOLOG全自動細菌鑒定儀鑒定，表明該菌株與惡臭假單胞菌 (尸化Wowo"ay/w/Wa)相似度(sim)為0.82，經(jīng)16S rDNA序列分析表明該序 列與菌株惡臭假單胞菌(i^wctowo"os戸Wa) M G-Y2同源性高達99 %。因此， 該菌株為惡臭假單胞菌(尸wWowo"fls/w"^) GNA5。迄今為止，沒有文獻報道惡臭假單胞菌(戶^^owo"os戸"^)能夠積累D-氨基葡萄糖酸本發(fā)明在不添加任何抑制劑的情況下，將篩選得到的菌株尸ww^wo"os ;w/Wa GNA5,在含有D-氨基葡萄糖的培養(yǎng)基中氧化發(fā)酵直接積累D-氨基葡萄糖 酸。所述D-氨基葡萄糖可以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或者D-氨基葡萄糖硫酸鹽的形 式添加。D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或D-氨基葡萄糖硫酸酸鹽可先配制成水溶液，再用 NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5 — 7.5，然后添加入培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基中碳氮源的含量《25g/L，其中碳源優(yōu)選糖類，尤其是葡萄糖， 添加量《10g/L;其中的氮源是無機和有機氮，無機氮源可為氯化銨或硝酸銨，含量《5g/L;有機氮源可為酵母粉、尿素、蛋白胨或牛肉膏，添加量《10g/L。添加入培養(yǎng)基中的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或者D-氨基葡萄糖硫酸鹽濃度小于 等于0.4mol/L時，可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率。所述培養(yǎng)基中還包含以下成份緩沖劑磷酸二氫鉀，含量《5g/L; pH調(diào)節(jié) 劑碳酸鈣含量為5-30g/L;生長因子的微量元素鎂鹽，例如可選用七水合硫酸鎂; 發(fā)酵液初始pH為4.5—8.5。菌種接種量(體積百分比) 一般為1%-10%，在100-200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速攪動下， 保持溫度在25-40'C ，發(fā)酵時間一般為40-80小時。本發(fā)明提供另外一種制備D-氨基葡萄糖酸的方法，即采用尸w^fowoww ;w"^ GNA5菌株的靜息細胞轉(zhuǎn)化D-氨基葡萄糖制備D-氨基葡萄糖酸,包括(1) 將P^Mc/o/wo"as;7w"c/a GNA5菌株進行常規(guī)培養(yǎng)，發(fā)酵，獲得靜息細胞；(2) 將D-氨基葡萄糖配制成溶液為生物轉(zhuǎn)化底物；(3)將(1)靜息細胞，加入(2) 的底物溶液進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成D-氨基葡萄糖酸。Aewc/owowosGNA5菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中以葡萄糖作為碳源，發(fā)酵時間 優(yōu)選穩(wěn)定期初期。將獲得的靜息細胞，用低溫的生理鹽水洗去表面殘留物。反應(yīng) 中的D-氨基葡萄糖可以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或者D-氨基葡萄糖硫酸鹽形式添 力口；底物濃度小于等于0.7 mol/L,靜息細胞的加入量0.02—0.2 g/mM底物，轉(zhuǎn) 化反應(yīng)溫度為25-4(TC，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間為1-48小時。綜上所述，本發(fā)明篩選到了 Pwwcfowo"m;7w"fitoGNA5菌株，該菌株能夠耐 受高濃度D-氨基葡萄糖且對產(chǎn)物D-氨基葡萄糖酸代謝能力極弱，能夠通過氧化 發(fā)酵法及靜息細胞轉(zhuǎn)化法制備D-氨基葡萄糖酸，轉(zhuǎn)化率高，是優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。


圖1是分離菌株發(fā)酵液的紙層析圖。其中l(wèi):50mg/LD-氨基葡萄糖和5mg/L D-氨基葡萄糖酸標準品；2:培養(yǎng)基；3:菌株i^w^mo"as/7w/Wfl GNA5的發(fā)酵 液上清；4:菌株GNA7的發(fā)酵液上清。具體實施例實施例1本實驗說明高產(chǎn)D-氨基葡萄糖酸天然生產(chǎn)菌株的篩選程序。篩選培養(yǎng)基配方(g/L)為D-氨基葡萄糖鹽酸鹽10、 CaC03 3、磷酸二氫 鉀l、七水合硫酸鎂0.5、硝酸鈉1、酵母粉0.5， pH7.0。取少量不同來源的土 樣加入到篩選培養(yǎng)基中，在30 'C， 120轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)，裝液量10ml/試管 (25*200 mm)培養(yǎng)5 7天，其間用無菌蒸餾水補充蒸發(fā)損失水分；取富集培 養(yǎng)液O.lml，轉(zhuǎn)接入新鮮的無菌篩選培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接富集培養(yǎng)3代，并采用紙層 析法檢測富集培養(yǎng)液中D-氨基葡萄糖的消耗及D-氨基葡萄糖酸的生成。平板培養(yǎng)基配方(g/L)為葡萄糖IO、磷酸二氫鉀2、 NH4N03 2、七水合 硫酸鎂0.5、酵母粉5、瓊脂18， pH 7.0。將富集培養(yǎng)液稀釋涂布于平板培養(yǎng)基 上，30'C培養(yǎng)1 2天；挑選生長良好、不同形態(tài)的菌落進行畫線分離，獲得單 一菌株。將單一菌株分別接入新鮮的無菌篩選培養(yǎng)基中進行復(fù)篩，其間測定發(fā)酵 液中D-氨基葡萄糖及D-氨基葡萄糖酸的含量，選擇D-氨基葡萄糖消耗快或積累 D-氨基葡萄糖酸能力較強的菌株。從附圖1中可以看到，菌株GNA5的氧化發(fā)酵培養(yǎng)液中有D-氨基葡萄糖酸 存在，且D-氨基葡萄糖的斑點較小較淡，說明菌株GNA5能夠轉(zhuǎn)化D-氨基葡萄 糖制備D-氨基葡萄糖酸，且具有較高的轉(zhuǎn)化能力，至此，篩選到目標菌株。采 用BIOLOG全自動細菌鑒定儀鑒定及16S rDNA序列分析，表明該菌株為 Psez^/om.oway/7wrida， 命名為尸jewc/o/wowas jowrit/a GNA5 。上述篩選過程中，培養(yǎng)液中的D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖酸采用紙層析 法檢測，方法如下展開劑為乙醇冰醋酸水=6:1:1 (體積比)；取富集培養(yǎng) 液或者純菌株的發(fā)酵液2pl，用微量進樣器點樣于濾紙上；紙層析結(jié)束后吹干濾紙，噴灑0.2 %茚三酮溶液并在95 'C加熱5分鐘顯色。底物D-氨基葡萄糖與產(chǎn) 物D-氨基葡萄糖酸的斑點均呈紫紅色，比移值(Rf)分別為0.65和0.21。實施例2本實驗說明利用尸化wdowo"as戸Wa GNA5菌株氧化發(fā)酵制備D-氨基葡萄 糖酸的方法。(1) PwWowomw ; w^/fl GNA5菌株在培養(yǎng)基A中氧化發(fā)酵制備D-氨基葡 萄糖酸。培養(yǎng)基的A配制1.將D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或D-氨基葡萄糖硫酸鹽配制成濃度為0.9 mol/L的濃溶液，采用過濾滅菌法除菌(選用0.22jim膜)。2. 配制培養(yǎng)基的其余部分(g/L):葡萄糖5、磷酸二氫鉀1、七水合硫酸鎂 0.5、碳酸鈣20、尿素3、酵母粉2，初始pH-6.5。之后，在121'C滅菌15分鐘。3. 將步驟1和2所得溶液在無菌環(huán)境下混合，使D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或D-氨基葡萄糖硫酸鹽的終濃度為0.35 mol/L。/^w^wKJwcw pwrififcr GNA5菌株在培養(yǎng)基A中氧化發(fā)酵，其接種量為4% (體 積百分數(shù))，培養(yǎng)溫度為3(TC，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘。發(fā)酵70小時可制備34.1g/L D-氨基葡萄糖酸，摩爾轉(zhuǎn)化率為49.87%。培養(yǎng)基A配制中步驟l的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或D-氨基葡萄糖硫酸鹽濃溶 液，也可以用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5—7.5，然后再過濾滅菌。(2) 尸wwrfowo"oyGNA5菌株在培養(yǎng)基B中氧化發(fā)酵。 培養(yǎng)基B的配制1. 將D-氨基葡萄糖鹽酸鹽/ D-氨基葡萄糖硫酸鹽配制成濃度為0.9 mol/L的 濃溶液，采用過濾滅菌法除菌(選用0.22pm膜)。2. 配制培養(yǎng)基的其余部分(g/L):葡萄糖5、尿素5、磷酸二氫鉀2、七水 合硫酸鎂0.5、碳酸鈣10, pH=7.0。之后，在121'C滅菌15分鐘。3. 將步驟1和2所得溶液在無菌環(huán)境下混合，使D-氨基葡萄糖鹽酸鹽/ D-氨 基葡萄糖硫酸鹽的終濃度為0.14mol/L。尸ww^ww"aj /n^'必GNA5菌株在培養(yǎng)基B中氧化發(fā)酵，其接種量為6°/。(體 積百分數(shù))，培養(yǎng)溫度為3(TC,搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘。發(fā)酵48小時可制備25^0-氨基葡萄糖酸，摩爾轉(zhuǎn)化率為91.33%。培養(yǎng)基B配制中步驟l的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或D-氨基葡萄糖硫酸鹽濃溶 液，也可以用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5—7.5，然后再過濾滅菌。(3) D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖酸的檢測方法本實驗中，D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖酸采用高效液相色譜法(HPLC) 定量檢測。發(fā)酵液在6000轉(zhuǎn)/分鐘，4'C條件下離心15min后，獲得上清液，用 于HPLC分析。釆用戴安(Dionex)高效液相色譜儀，色譜條件色譜柱為Shodex AsahipakNH2P-50 4E氨基柱；流動相為乙腈0.01 M醋酸銨=40:13 (體積比)； 流速，0.5mL/min;檢測器，RI-101示差折光檢測器；柱溫，30 °C。實施例3本實驗說明利用尸wtwfowo"氾； wft'fl a GNA5菌株的靜息細胞制備D-氨基葡 萄糖酸的方法。發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)為葡萄糖7、尿素7、玉米漿2 (v/L)、磷酸二 氫鉀2、蛋白胨5、七水合硫酸鎂0.5， pH=7.0。將惡臭假單胞菌(尸wwdo/no"似 GNA5菌株以10% (體積百分數(shù))的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫 度為3(TC，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，當(dāng)發(fā)酵時間達8小時，在無菌條件下，向培 養(yǎng)液中加入無菌的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽/D-氨基葡萄糖硫酸鹽，使其終濃度為25 mM/L。當(dāng)發(fā)酵時間為24小時，停止發(fā)酵。將發(fā)酵液在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4'C條件 下離心15 min，獲得初步的靜息細胞。將該靜息細胞用4'C的濃度為50mM， pH7. 0 的磷酸緩沖液懸浮后再次以同樣的條件離心，重復(fù)兩次，可獲得轉(zhuǎn)化用的靜息細 胞。在靜息細胞中，按照0. 1 g細胞/mM底物添加生物轉(zhuǎn)化底物(相當(dāng)于0.045g 干細胞/g D-氨基葡萄糖鹽酸鹽)，在30'C下振蕩反應(yīng)10小時，生成D-氨基葡萄 糖酸，轉(zhuǎn)化率達到90%。實施例4本實驗說明利用尸wwAwo"w /wWa GNA5菌株制備的產(chǎn)物的純化與結(jié)構(gòu)驗證。將發(fā)酵液在6000轉(zhuǎn)/分鐘，4。C條件下離心15min后，獲得上清液；在此上 清液中加入等體積的乙醇，在4 'C冰箱內(nèi)放置過夜，抽濾得白色結(jié)晶狀物質(zhì)。 將該白色結(jié)晶狀物質(zhì)溶于水，再次乙醇沉淀獲得高純度的產(chǎn)物。對高純度的產(chǎn)物 進行核磁共振譜(1H-NMR、 13C-NMR)分析，以D-氨基葡萄糖酸標準品(純度〉 97%)核磁共振譜為參照。本研究所制結(jié)晶產(chǎn)物的核磁共振波譜圖與日本東京化成株式會社提供的97 。/。純度的D-氨基葡萄糖酸標準品圖譜完全一致，表明Ae"c/omowas戸rtc/a GNA5 氧化D-氨基葡萄糖所得產(chǎn)物為D-氨基葡萄糖酸。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化D-氨基葡萄糖制備D-氨基葡萄糖酸的菌株，其特征在于該菌株是惡臭假單胞菌GNA5菌株，已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號CCTCCM208138。
2. —種用權(quán)利要求1所述菌株制備D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于將所 述的惡臭假單胞菌GNA5菌株置于含有D-氨基葡萄糖的培養(yǎng)基中氧化發(fā)酵直接 積累D-氨基葡萄糖酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的培 養(yǎng)基中碳氮源的含量小于等于25g/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的 碳源為糖類物質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的 糖為葡萄糖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的培 養(yǎng)基的D-氨基葡萄糖以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或者D-氨基葡萄糖硫酸鹽的形式添 加。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述的 D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或者D-氨基葡萄糖硫酸鹽先配制成水溶液，再用NaOH調(diào) 節(jié)pH至6.5—7.5，然后添加入培養(yǎng)基。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法,其特征在于所述的培 養(yǎng)基中的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或者D-氨基葡萄糖硫酸鹽濃度小于等于0.4 mol/L。
9. 一種用權(quán)利要求1所述菌株制備D-氨基葡萄糖酸的方法，包括(1) 將權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌GNA5菌株，在培養(yǎng)基中進行常規(guī) 培養(yǎng)，獲得靜息細胞；(2) 將D-氨基葡萄糖配制成溶液，作為生物轉(zhuǎn)化底物；(3) 將(1)所得靜息細胞加入(2)的底物溶液中進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成D-氨基葡萄糖酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于步驟(1)中惡臭假單胞菌GNA5菌株發(fā)酵用的培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法，其特征在于所述生 物轉(zhuǎn)化底物中的D-氨基葡萄糖以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽或者D-氨基葡萄糖硫酸鹽 的形式添加。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備D-氨基葡萄糖酸的方法,其特征在于步驟(3) 中底物濃度小于等于0.7 mol/L,靜息細胞的加入量為0.02—0.2 g/mM底物，轉(zhuǎn) 化反應(yīng)溫度為25-40'C,轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間為1-48小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及惡臭假單胞菌GNA5菌株及其制備D-氨基葡萄糖酸的方法，利用篩選并保藏的惡臭假單胞菌(Pseudomonad putida)GNA5菌株(即CCTCCM208138)，通過氧化發(fā)酵或者靜息細胞轉(zhuǎn)化法，可以高效地將D-氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-氨基葡萄糖酸。本發(fā)明解決了微生物轉(zhuǎn)化D-氨基葡萄糖制備D-氨基葡萄糖酸的過程中，菌株不能耐受高濃度D-氨基葡萄糖及對產(chǎn)物D-氨基葡萄糖酸代謝能力強的問題。
文檔編號C12N1/20GK101407773SQ20081015622
公開日2009年4月15日 申請日期2008年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日
發(fā)明者萬永敏, 何冰芳, 斌 吳, 笑 孟, 柏中中, 歐陽平凱, 靜 袁 申請人:南京工業(yè)大學(xué)