專利名稱：兩個鑒定水稻香米基因fgr的基因標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及兩個鑒別水稻香米基因/gr的基因標記方法，屬于農業(yè)生物技術工程技 術領域，可用于水稻香米基因/^的分子標記輔助育種和新的香米基因的篩選。
二背景技術：
隨著人們生活水平的提高，人均稻米消費量的減少，消費者對稻米的品質要求也 越來越高。帶有香味的優(yōu)質大米愈來愈受消費者的青睞。其銷售價格要比普通米高出 許多，這主要是優(yōu)良的香稻品種具有令人愉快的香味。由于香米在巿場上的地位，各 國育種工作者一直十分重視香米品種的選育。在香米育種中，十分關鍵的問題是對香 味性狀的準確鑒定，育種家常釆用感官鑒定的方法以提高香米選擇的效率，然而這些 方法在對大的群體進行選擇時具有一定的局限性。例如，育種家經常釆用的咀嚼法， 咀嚼樣品多時誤差較大，而且香味以粒為單位分離，有的單株上既有香粒也有非香粒， 鑒定結果難以準確可靠。KOH法雖然提高了鑒定的準確性，但較費時費工，且在鑒定 綠色營養(yǎng)器官時易受強烈的葉綠素氣味的干擾。因此，如何準確、快速、簡單地對香 味進行鑒定一直是香米育種中的難題之一。近年來，隨著各種分子標記的發(fā)展，許多 研究者利用與香米基因連鎖的標記對香米進行輔助選擇，這種方法在一定程度上提高 了選擇的速度，且操作簡單。但這些標記都是香米基因的連鎖標記，因此不能達到100% 的準確性。
水稻香味基因的分子標記定位方面的研究報道較多，但都是對第8染色體上的/gr 基因的不同范圍的定位。李欣等利用秈型和粳型標記基因系分別對武進香秈及武進香 粳進行了香味基因染色體定位，發(fā)現香味基因與位于第八染色體的白綠葉基因存在連 鎖關系，它們之間的重組值約為(37.55±2.86)%。 Dong等同樣用RFLP分子標記將香味基 因定位在第八染色體上。金慶生等利用RAPD和RFLP將香味基因定位于第八染色體上， 后來將香味基因標記在RFLP標記jar500和c222之間，遺傳圖距分別為15.8和27.8cM。
李金華等將控制粵豐B香味基因定位在GR01和SSR233之間，遺傳距離分別為3.3和 5.7cM。 Chen等利用三個香米材料配制的4個組合，最終將香味基因/y定位在第八染色 體上的69kb范圍內。
Bradbury等(《Plant Biotechnology Joumal》2005, (3): 363-370 )對米香基因區(qū)域
的17個基因進行序列測定，發(fā)現控制甜菜醛脫氫酶(BADH2)的基因^^M在香和非香水
稻品種中存在明顯差別。與非香品種相比，香稻品種在萬^Z/^編碼區(qū)的第7個外顯子中
出現了一個8bp的缺失和3bp的變異，結果導致翻譯提前終止，產生無功能的截短
BADH2蛋白。Weiweishi等(Mol Breeding 2008， 22:185-192)通過對24份香米品種的
測序分析，發(fā)現了Badh2的一個新的等位基因，即和非香米品種相比，第7外顯子正常
而第2外顯子存在著7個bp的缺失。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明針對上述情況，利用水稻香米基因/gr與非香米基因在第2和 第7外顯子上存在的差異，獲得了/gr基因的2個基因標記，利于這兩個標記進行香米 育種的輔助選擇可以保證100%的準確率。
技術方案-.
兩個鑒定水稻香米基因/gr的基因標記引物，其特征在于
InDel-E2正向引物序列GGGAGGCGCTGAAGAGGA
InDel-E2反向引物序列GGGTAGTCACCACCCTACCTTG
InDel-E7正向引物序列ATACCCCATCAATGGAAAT
InDel-E7反向引物序列GAAAAGGACAACATTGAGAA 上述用于鑒定水稻香米基因/^的基因標記方法為 (1)水稻品種基因組DNA的提?。?br> (2 )用權利要求1所述引物對水稻基因組DNA進行PCR擴增；
PCR擴增反應體系為BU-Taq 2xMaster PCR Mix 5jxL , Primer ( 4pmol/L ) 2攀,模板DNA (約15ng&L) 2pL,滅菌雙蒸水lpL;反應總量10pl。 PCR反 應在MJReseachPTC-200熱循環(huán)儀上進行，反應程序包括94。C預變性5min,每 個循環(huán)94。C變性30 sec， 52.2。C退火30 sec, 72。C延伸lmin,共35個循環(huán)，最后 72。C延伸7min, 12。C保存。
(3)反應產物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色。
電泳結果如果有100bp或者196bp的單條譜帶，則為/gr基因純合體的水稻品 種；如果有l(wèi)OObp和107bp或者196bp和204bp兩條譜帶，則為/gr基因雜合體的 水稻品種；如果有107bp或者204bp—條譜帶，則為不含/gr基因的水稻品種。 有益效果
本發(fā)明利用分子生物學的方法獲得2個水稻香米基因/gr的基因標記，該標記的優(yōu) 點具體歸納如下
(1) 尋找新的香米基因材料不僅可以進一步研究香米的致香機制，同時也可以拓寬香 稻育種的遺傳背景，選育出高產、穩(wěn)產、香味濃郁的優(yōu)質香米品。然而傳統(tǒng)的等位性 分析不僅工作量大而且周期長，利用本發(fā)明的標記可以簡單快速的鑒定與/gr不等位的 新的香米基因。
(2) 本發(fā)明所獲得的基因標記是依據/gr基因內部產生的堿基缺失，因此不存在遺傳 的交換，也不需要表型的進一步驗證。
(3) 育種中香米性狀的觀察必須等到種子成熟以后才能進行，而利用本發(fā)明的標記可 以在苗期判斷其香米的基因型，為有效選育香米水稻品種提供依據。同時本發(fā)明的標 記為共顯性標記，因此可以鑒定出/gr基因純合體的水稻品種，大大提高了品種選育效率。
四

圖l香米基因/gr與非香等位基因第2外顯子序列對比 圖2香米基因/gr與非香等位基因第7外顯子序列對比 圖3. InDel-E2(a圖)和InDel-E7(b圖)對24份供試材料電泳檢測圖 (l-24泳道分別54170,金陵香糯，蘇滬香粳，R405,香稻，紅香粳，廣陵香糯，香 血糯，香血糯(大)，香粳lll,香選46，香粳75,太湖香粳，蘇香粳l號，香粳49, 武香99-8,武香粳9號，蘇御糯，大華香粳，武香粳14, R405/Dular的雜種Fl, 54170/ 鎮(zhèn)稻88的雜種F!，曰本晴，9311。除日本晴，9311外其余均為香米品種(系)或香 與非香的FJ
五、 具體實施方法 (1 )供試材料
試驗材料包括20份香米品種(品系)、2份非香米品種和2份香米與非香米的F" 20份香米品種(品系)包括54170、金陵香糯、蘇滬香粳、R405、香稻、紅香粳、
廣陵香糯、香血糯、香血糯(大)、香粳111、香選46、香粳75、太湖香粳、蘇香粳1 號、香粳49、武香99-8、武香粳9號、蘇御糯、大華香粳、武香粳14。非香米品種為 曰本晴和9311。 Fi分別為R405和Dular、 54170和鎮(zhèn)稻88的雜交種。
(2) 香米基因/gr基因標記的獲得
根據Bradbury等和Weiwei shi等的報告結果，利用prime premier 5.0將香米基因 /gr第2外顯子7bp的缺失(圖1 )和第7外顯子8bp的缺失(圖2 )分別設計成InDel 標記，分別命名為InDel-E2、 InDel-E7。
(3) DNA提取
在水稻分蘗期或孕穗期取l克左右水稻葉片，利用SDS方法提取DNA。 DNA提取參照Dellapporta等(1983 )的方法，略有修改，具體步驟如下
① 取200-300 mg新鮮水稻葉片(-2(TC保存的葉片)，在-2(TC預冷研缽中用液氮研磨 成粉末。
② 轉移到1.5 ml離心管中。
③ 加入600ul SDS提取液搖勾，65°C ,溫洛30 min,振蕩3-4次。
加入1/4體積(約100 ul) KAc,搖勻。
⑤加入1/2體積(約300-400 ul)的氯仿:異戊醇(體積比24: 1)，振蕩器上充分搖勻 (120rpm， 30min)。
室溫下6000-8000rpm離心15min,取上清。
⑦ 加入2倍體積(700ul左右)-2(TC預冷的無水乙醇、搖勻，-20。C自由沉淀20min。
⑧ 室溫下12000rpm離心6min,棄上清，沉淀用等體積(400 ul左右)70%乙醇洗滌 10min。
@棄70%乙醇，DNA沉淀風干后，溶解于200ulTE(l/10),4'C保存?zhèn)溆谩?用0.8%的瓊脂糖電泳檢測DNA樣品質量。
(4) PCR反應及電泳檢測
PCR擴增反應體系為BU-Taq 2xMaster PCR Mix 5pL , Primer ( 4pmol/L ) 2.0|iL,
模板DNA (約15ng/pL) 2pL,滅菌雙蒸水l|aL;反應總量lOpl。 PCR反應在MJ Reseach PTC-200熱循環(huán)儀上進行，反應程序包括94。C預變性5 min,每個循環(huán)94°C 變性30 sec, 52.2。C退火30 sec, 72。C延伸lmin,共35個循環(huán)，最后72。C延伸7min, 12'C保存。反應產物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色。
(5) 電泳檢測結果
利用InDel-E2對24份供試材料進行基因型檢測。第2外顯子缺失的香米材料能擴 增出100bp的DNA條帶，第2外顯子不缺失的香米材料和非香米材料能擴增出107bp 的DNA條帶，該位點雜合的F,能同時擴增出100和107bp的DNA條帶(圖3a)。圖3a 所示20份香米材料中54170、金陵香糯、蘇滬香粳、香粳lll、香選46、蘇香粳l、 香粳49、武香99-8、武香粳9號、大華香粳號和武香粳14擴增出100bp的DNA條帶， 說明這些香米品種在第2外顯子都存在著7bp的堿基缺失，其余9份香米材料、R405 和Dular的雜種Fl、日本晴、9311都擴增出107bp的DNA條帶，54170和鎮(zhèn)稻88雜種F1 同時擴增出100和107bp的DNA條帶。
利用InDd-E7對24份供試材料進行基因型檢測。第7外顯子缺失的香米材料能擴 增出196bp的DNA條帶，第7外顯子不缺失的香米材料和非香米材料能擴增出204bp 的DNA條帶，該位點雜合的F1能同時擴增出196和204bp的DNA條帶(圖3)。圖3b 所示20份香米材料中R405、香稻、紅香粳、廣陵香糯、香血糯、香血糯(大)、香粳75、 太湖香粳和蘇御糯擴增出196bp的DNA條帶，說明這些香米品種在第7外顯子都存在 著8bp的堿基缺失，而這9份材料在第2外顯子都不存在缺失。第2外顯子缺失的11 份香米材料、54170和鎮(zhèn)稻88雜種Fi、曰本晴、9311都擴增出204bp的DNA條帶，R405 和Dular的雜種F！同時擴增出196和204bp的DNA條帶。
權利要求
1、兩個鑒定水稻香米基因fgr的基因標記引物，其特征在于InDel-E2正向引物序列GGGAGGCGCTGAAGAGGAInDel-E2反向引物序列GGGTAGTCACCACCCTACCTTGInDel-E7正向引物序列ATACCCCATCAATGGAAATInDel-E7反向引物序列GAAAAGGACAACATTGAGAA
2、 權利要求l所述兩個鑒定水稻香米基因/gr的基因標記方法，其特征是 (1)水稻品種基因組DNA的提??；(2 )用權利要求1所述引物分別對水稻基因組DNA進行PCR擴增； (3)對PCR擴增產物進行電泳，如果有100bp或者196bp的單條譜帶，則為/gr基 因純合體的水稻品種；如果有100bp和107bp或者196bp和204bp兩條譜帶，則為/gr 基因雜合體的水稻品種；如果有107bp或者204bp—條譜帶，則為不含/gr基因的水稻品種。
3、 根據權利2所述的兩個鑒定水稻香米基因/gr的分子標記方法，其特征是 所述步驟(2 )的PCR擴增反應體系為BU-Taq 2xMaster PCR Mix 5(iL , Primer(4pmol/L)2.0pL,模板DNA(約15ng4tL)2^L，滅菌雙蒸水l^L;反應總量lOnl。 PCR反應在MJ Reseach PTC-200熱循環(huán)儀上進行，反應程序包括94'C預變性5 min,每個循環(huán)94'C變性30sec, 52.2。C退火30 sec, 72。C延伸lmin,共35個循環(huán)， 最后72。C延伸7min, 12。C保存。所述步驟(3)反應產物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻香米基因fgr的基因標記方法，屬于農業(yè)生物工程技術領域。利用水稻香米基因fgr與非香米基因相比在第2外顯子存在7個bp的缺失或在第7外顯子存在8個bp的缺失，設計合成了InDel標記InDel-E2和InDel-E7，由于這兩個標記為基因本身的標記，因此和香米基因fgr表現為共分離。本發(fā)明能準確鑒定水稻種質資源或香米育種群體中是否含有fgr基因，并能進一步區(qū)分fgr基因的純合體和雜合體，預測后代基因型，大大提高香米基因的選擇效率和鑒定效率，加速香米材料的育種進程。
文檔編號C12N15/11GK101363060SQ20081015640
公開日2009年2月11日 申請日期2008年10月9日 優(yōu)先權日2008年10月9日 公開號200810156404.發(fā)明者仲維功, 杰 楊, 軍 王, 陳志德 申請人:江蘇省農業(yè)科學院