專利名稱：基于光子晶體的復(fù)合式生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了一種新型基于光子晶體結(jié)構(gòu)的復(fù)合式生物芯片的制備方法，包括 基片，這種芯片的基片綜合了硬性基片、光子晶體以及膜性基片的優(yōu)點(diǎn)，具有制作 成本相對(duì)較低、高靈敏度、可以批量生產(chǎn)和實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)，可應(yīng)用于生物檢測、 藥物開發(fā)、疾病診斷等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
光子晶體是由兩種或兩種以上，具有不同介電常數(shù)的材料在空間上按照一定的 周期順序所形成的有序結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)對(duì)特定波長的光具有禁止通過的作用，即 光子禁帶。光子禁帶的存在使光子晶體具有優(yōu)異的光操控能力，頻率位于帶隙中的 光波將被光子晶體全反射。從20世紀(jì)90年代中后期開始，光子晶體就因?yàn)槠渚薮蟮?科學(xué)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，受到各國政府、軍方、學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)以及高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)界 的高度重視。光子晶體的優(yōu)異性質(zhì)光學(xué)、光子學(xué)性質(zhì)是其在許多領(lǐng)域中都有應(yīng)用，
例如光子晶體波導(dǎo)、光子晶體激光器以及生物傳感等方面。
在實(shí)際應(yīng)用中，膠體晶體由于制備簡單、價(jià)格低廉而受到了廣泛的青睞。直徑 為亞微米、單分散的無機(jī)或聚合物膠體微球在重力、靜電力或毛細(xì)力的作用下可以 自組裝形成二維或三維的有序排列。常用的亞微米級(jí)的膠體粒子有二氧化硅
(Si02)、聚苯乙烯(PS)以及聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等，此外還有一些單 分散的無機(jī)有機(jī)復(fù)合物粒子和有機(jī)共聚物粒子等。根據(jù)布拉格衍射方程，小球的直 徑大小將影響密堆積膠體晶體的光子禁帶位置。
生物芯片是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子有序地 固化于支持物的表面，組成密集二維的分子陣列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中 靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并 行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量的一種生物檢測的載體。其作 用是連接、吸附或包埋各種探針分子，并提供芯片雜交、洗片和掃描的支持平臺(tái)。 目前使用的生物芯片的基片可以分為三大類
一. 膜性基片主要有尼龍膜，硝酸纖維素膜等。這類基片具有三維立體結(jié)構(gòu)， 并且與生物分子親和力強(qiáng)，雜交技術(shù)成熟。但是由于其背景較強(qiáng)，只能進(jìn)行單
樣本雜交，靈敏度較低，需要用放射性物質(zhì)標(biāo)記。因而應(yīng)用范圍受限。
二. 硬性基片其中玻片使用最多，另外還有塑料片，硅片等。這類基片具有一 定的剛性，熒光背景低，價(jià)格低廉，耐高溫和高離子強(qiáng)度，并且樣品不易擴(kuò)散，雜 交液體積少，因而在生物芯片技術(shù)中使用最廣泛。但其二維平面結(jié)構(gòu)阻礙生物分子 在空間的伸展，易造成空間位阻，所以在低濃度檢測中仍需要改進(jìn)。
三. 復(fù)合型基片這類基片將三維基片的高親和性和玻片的剛性結(jié)合起來，獲得
了很好的使用效果。例如Schleicher& Schuell公司的CAST Slides將帶正電荷尼龍膜 附著在玻片上，形成一種膜結(jié)合玻片。PerkinElimer公司的Hydro gel Coated Slides
將玻片表面包被一種專利的聚合物，大大提高基片與DNA的結(jié)合能力，提高檢測 靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是制作一種基于光子晶體的復(fù)合型生物芯片。這種芯 片具有檢測信號(hào)強(qiáng)、靈敏度高和點(diǎn)樣質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，為生物芯片的研究提供了一個(gè) 高性能的平臺(tái)。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的可以通過以下方案來實(shí)現(xiàn)在普通硬性基片表面利用
亞微米(納米粒子)自組裝的辦法制備光子晶體薄膜，然后在光子晶體薄膜上平鋪
一層膜性基片，對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)修飾后，即可應(yīng)用于各種生物分子的檢測。
該方法包括硬性基片的準(zhǔn)備、光子晶體薄膜的制備、膜性基片的連接、基片的
表面處理四個(gè)步驟，
① 硬性基片的準(zhǔn)備將普通硬性基片用洗漆液清洗干凈，用去離子水超聲沖洗 后晾干。根據(jù)需要可以用化學(xué)修飾或等離子體處理的方法，將基片表面修飾上氨基 或羥基等。
② 光子晶體的制備將單分散的二氧化硅或聚苯乙烯等納米微球，加去離子水 稀釋，調(diào)節(jié)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%—2.5%，超聲分散開，形成較穩(wěn)定的膠體乳液。利用自 組裝法在步驟①處理好的基片表面上組裝20um左右厚的光子晶體薄膜。然后，基片 放在80度的烘箱中2h，驅(qū)除分散介質(zhì)，使得粒子之間堆積更緊密牢固。
③ 膜性基片的復(fù)合在光子晶體薄膜表面平鋪一層膜性基片(例如水凝膠)，
利用化學(xué)吸附或正負(fù)電荷之間相互作用等使其牢固結(jié)合。
④基片的表面處理運(yùn)用化學(xué)吸附等方法，將步驟③中形成的復(fù)合基片表面的 膜層部分修飾上能與待測生物分子牢固連接的化學(xué)基團(tuán)。
所述的硬性基片是玻片、硅片或塑料片。
制備光子晶體薄膜的材料是二氧化硅、聚苯乙烯、磁性復(fù)合納米粒子或量子點(diǎn) 復(fù)合納米粒子。
膜性基片為水凝膠、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
有益效果在本發(fā)明中，我們采用了傳統(tǒng)的硬性基片和膜性基片，并引入膠體 光子晶體薄膜。從而使得復(fù)合式生物芯片的性能大大提高，由于光子晶體薄膜僅對(duì) 頻率處在光子禁帶范圍內(nèi)的信號(hào)有增強(qiáng)作用，所以該生物芯片可以對(duì)不同的信號(hào)選 擇性的增強(qiáng)。
這種方法可以為生物芯片技術(shù)中的生物分子反應(yīng)和檢測提供了一個(gè)高性能的平 臺(tái)，而且還可以把光子晶體的應(yīng)用范圍拓展到生物芯片領(lǐng)域中，進(jìn)一步促進(jìn)新型材 料的發(fā)展和應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:
1、 先將普通載玻片用洗滌液洗凈，然后用去離子水超聲沖洗3遍，無塵處晾干
備用o
2、 二氧化硅光子晶體制備方法通過溫控法控制二氧化硅納米粒子的粒徑，例
如若待測信號(hào)為cy3，其發(fā)射波長為570nm，則調(diào)節(jié)油浴溫度至40度，選用快速間隙 式加料法，首先88ml無水乙醇和3.2ml正硅酸乙酯混合液與20ml的氨水和88ml無水乙 醇混合液，加入到燒瓶中，并同時(shí)開始攪拌，轉(zhuǎn)速為350轉(zhuǎn)/分鐘；然后加入16ml氨 水；5—10分鐘后加入176ml無水乙醇和4ml正硅酸乙酯混合液。反應(yīng)3個(gè)小時(shí)后，可 以得到單分散性很好的二氧化硅納米粒子。離心純化后，調(diào)節(jié)其濃度至2.2%，采用 重力沉積法，在步驟l中制得的載玻片上獲得約30um厚的光子晶體薄膜。將基片放 到80度烘箱中加熱2h，使得粒子連接更緊密。最后，用5。/。的APTES酒精溶液浸泡載 玻片半小時(shí)，再用去離子水沖洗3遍，晾干待用。 3、平鋪瓊脂糖膜的方法稱0.4g瓊脂糖，將其溶解于100ml去離子水中，加熱使其 沸騰，在步驟2制得的基片表面上澆注瓊脂糖溶液,每張載玻片2ml ,使其均勻平鋪于
基片表面,待其凝固后置37'C烘干，便制得復(fù)合式生物芯片。
4、基片表面的修飾將復(fù)合基片置于O. 2 mol/L NaI(V溶液中，室溫氧化30 min, 再用蒸餾水洗片3次,每次5 min ,在此基礎(chǔ)上，再將基片浸入到含1%戊二醛0. 01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS， pH7. 4)溶液中，37'C環(huán)境下作用2h后，用去離子水洗片3次，每次5 min,晾干后即可使用。
實(shí)施例2:
1、 塑料片的準(zhǔn)備首先制作尺寸為76.2mn^25.4mm"mm的PS塑料片，然后冷 卻至室溫。用去離子水超聲清洗塑料片，并用氧等離子體對(duì)其表面進(jìn)行氧化處理。
2、 聚苯乙烯光子晶體制備方法在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將10ml苯乙烯，225ml超純水 和lml的甲基丙烯酸加入三口瓶中，在350r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌。升溫至7(TC，穩(wěn)定后 加入0.32g過硫酸鉀作為引發(fā)劑，反應(yīng)至少10h，即可得到粒徑為245nm左右的聚苯 乙烯微球。離心純化后，用去離子水將微球濃度調(diào)制2-2.5%，超聲分散開。把步驟l 中制得的塑料片固定在提拉儀上，以1.6um/s的速度向上提拉，微球就會(huì)在塑料片表 面自組裝成光子晶體。
3、 水凝膠膜的制備將質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液 稀釋至為4%(體積比)，加引發(fā)劑偶氮異二丁腈(1%，質(zhì)量體積比)混勻后，通入氮 氣2—4min，然后將其平鋪在步驟2制作的基片表面上，靜置20 min。最后，在20。C 下高壓汞燈照射聚合30min，可得復(fù)合式生物芯片。
實(shí)施例3:
1、 硅片的準(zhǔn)備將購買的普通硅片洗凈，并用氧等離子體對(duì)其表面進(jìn)行氧化處理。
2、 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)光子晶體的制備PMMA的制備采用在沸騰 溫度下的無皂懸浮聚合法。首先將40ml的甲基丙烯酸甲酯放入細(xì)頸瓶中，加入0.1ml 的甲基丙烯酸和150ml的超純水，攪拌下加熱至沸騰，沸騰后5分鐘加入引發(fā)劑過二 硫酸鉀，反應(yīng)1.5h。離心純化后，用去離子水將微球濃度調(diào)制2-2.5%，超聲分散開。 把步驟l中制得的硅片固定在提拉儀上，以1.6um/s的速度向上提拉，微球就會(huì)在硅 片表面自組裝成光子晶體。
3、 平鋪瓊脂糖膜的方法同實(shí)施例l所述。
權(quán)利要求
1、一種基于光子晶體的復(fù)合型生物芯片的制作方法，其特征在于該芯片的制作包括硬性基片的準(zhǔn)備、光子晶體薄膜的制備、膜性基片的連接、基片的表面處理四個(gè)步驟，①硬性基片的準(zhǔn)備將普通硬性基片用肥皂水清洗干凈，用去離子水沖洗后晾干；根據(jù)需要可以用化學(xué)修飾或等離子體處理的方法，將基片表面修飾上氨基或羥基；②光子晶體的制備將特定的根據(jù)檢測信號(hào)的位置不同而不同大小的單分散的二氧化硅或聚苯乙烯等納米微球，加去離子水稀釋，調(diào)節(jié)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2％-2.5％，超聲分散開，利用自組裝法在步驟①處理好的基片表面上組裝20-30um厚的光子晶體薄膜；之后，基片放在80度的烘箱中2h，使得粒子之間連接更緊密牢固；③膜性基片的連接在光子晶體薄膜表面平鋪一層膜性基片，利用化學(xué)吸附或正負(fù)電荷之間相互作用使其牢固連接；④基片的表面處理運(yùn)用化學(xué)吸附等方法，將步驟③中形成的復(fù)合基片表面的膜層部分修飾上能與待測生物分子牢固連接的化學(xué)基團(tuán)。
2、 如權(quán)利要求1所述的基于光子晶體的復(fù)合型生物芯片的制作方法，其特征在 于所述硬性基片是玻片，硅片或塑料片。
3、 如權(quán)利要求1所述的基于光子晶體的復(fù)合型生物芯片的制作方法，其特征在 于制備光子晶體薄膜的材料是二氧化硅、或聚苯乙烯、磁性復(fù)合納米粒子或量子 點(diǎn)復(fù)合納米粒子。
4、 如權(quán)利要求l所述的基于光子晶體的復(fù)合型生物芯片的制作方法，其特征在 于膜性基片為水凝膠、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
全文摘要
基于光子晶體的復(fù)合型生物芯片的制作方法包括硬性基片的準(zhǔn)備、光子晶體薄膜的制備、膜性基片的連接、基片的表面處理四個(gè)步驟，①硬性基片的準(zhǔn)備將普通硬性基片用肥皂水清洗干凈，用去離子水沖洗后晾干；將基片表面修飾上氨基或羥基；②光子晶體的制備將特定的根據(jù)檢測信號(hào)的位置不同而不同大小的單分散的二氧化硅或聚苯乙烯等納米微球，在處理好的基片表面上組裝20-30um厚的光子晶體薄膜；③膜性基片的連接在光子晶體薄膜表面平鋪一層膜性基片，利用化學(xué)吸附或正負(fù)電荷之間相互作用使其牢固連接；④基片的表面處理運(yùn)用化學(xué)吸附等方法，將步驟③中形成的復(fù)合基片表面的膜層部分修飾上能與待測生物分子牢固連接的化學(xué)基團(tuán)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101358242SQ20081015707
公開日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月23日
發(fā)明者孫立國, 明 胥, 顧忠澤 申請(qǐng)人:東南大學(xué)