專利名稱：人垂體泌乳素腺瘤細胞的純化培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學科學技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人垂體泌乳素腺瘤 細胞的純化及培養(yǎng)方法。
垂體腺瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤之一，其中發(fā)病率最高的是泌乳素腺
瘤，占40% 60%。泌乳素腺瘤的臨床表現(xiàn)包括內(nèi)分泌癥狀和占位癥狀， 前者主要由高泌乳素血癥引起，包括閉經(jīng)、泌乳、不孕、性功能障礙 等，后者如頭痛、惡心、嘔吐、視力下降等。對該病的發(fā)病機理、生 物學特性、藥物篩選等研究有賴于腫瘤細胞的純化培養(yǎng)，而目前文獻 中所見到的純化培養(yǎng)方法眾多，如利用垂體腺瘤細胞和成纖維細胞的 營養(yǎng)依賴和貼壁時間不同來分離，需要約6天時間，長時間的純化過 程不利于下一步實驗。也有外文文獻報道采用"低張裂解液"去除紅 細胞以純化培養(yǎng)人垂體泌乳素腺瘤細胞。但這些方法都不能得到令人 滿意的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、細胞純度高的人垂體泌乳素
腺瘤細胞的純化培養(yǎng)方法。實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采取的技術(shù)方案是 操作標本為人垂體泌乳素腺瘤組織，采取"溫和酶消化-過濾"去除成 纖維細胞，以"紅細胞裂解液"去除紅細胞。除去成纖維細跑和紅細 胞這兩種細胞，剩下的即為人垂體泌乳素腺瘤細胞。其操作步驟是-
(1) 、將手術(shù)切除的腫瘤組織無菌條件下置于培養(yǎng)液中^
(2) 、去餘血凝塊，將組織塊剪成小塊； (3〉、用胰酶進行消化，隔時間吹打一次；
(4) 、經(jīng)細胞篩過濾，終止消化；
(5) 、加入紅細胞裂解液，重懸細胞；
(6) 、除紅細胞裂解液，加入含胎牛血清的Medium 199培養(yǎng)液；
(7) 、吸培養(yǎng)液加入血細胞計數(shù)板，計數(shù)；
(8) 、按每孔lXKf個細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入培養(yǎng)液
2ml。置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液。 本發(fā)明操作簡便，可以同時去除成纖維細胞和紅細胞，所得到的 垂體腺瘤細胞采取免疫細胞化學的方法進行驗證，細胞純度高，細胞 純度接近100%。
具體實施例方式
本發(fā)明的操作標本為人垂體泌乳素腺瘤組織，采取"溫和酶消化-過濾"去除成纖維細胞，以"紅細胞裂解液"去除紅細胞。除去成纖 維細胞和紅細胞這兩種細胞，剩下的即為人垂體泌乳素腺瘤細胞。其 操作步驟是
(1) 、將手術(shù)切除的腫瘤組織無菌條件下置于培養(yǎng)液中，0 4t:保
存，所說的培養(yǎng)液其配比是Medium 199培養(yǎng)基中加入胎牛 血清至血清濃度為20%，加入青鏈霉素雙抗至濃度為 100U/ml;
(2) 、去除血凝塊，將組織塊剪成5 10mm3小塊；
(3) 、利用0.25W胰酶在37'C下消化15分鐘，每5分鐘吹打一次；
(4) 、經(jīng)270目細胞篩過濾，終止消化；
(5) 、加入紅細胞裂解液，重懸細胞，所說的紅細胞裂解液含A液. 0.16M NH4C1 和 B 液 0.17MTris， A液90ml+B液10ml,調(diào) pH7.2，濾膜除菌；
(6) 、除去紅細胞裂解液，加入含20%胎牛血清的Medium 199培 養(yǎng)液；
(7) 、吸9y l上一步得到的細胞懸液加入血細胞計數(shù)板，計數(shù)；
(8) 、按每孔1Xl(f個細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入培養(yǎng) 液2ml，置于濕化的、37'C、 5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔 天換液。
本發(fā)明所得的垂體泌乳素腺瘤細胞具有以下特征
a. 所得細胞大小及形態(tài)均一；
b. 垂體泌乳素腺瘤細胞為圓形，直徑約12 P沮；
c. 依細胞密度不同，可能在培養(yǎng)數(shù)小時后細胞互相交聯(lián)形成網(wǎng)狀
或團塊；
d. 采用免疫細胞化學的方法可以檢測胞漿內(nèi)的泌乳素分泌顆粒。
權(quán)利要求
1、一種人垂體泌乳素腺瘤細胞的純化培養(yǎng)方法，其特征在于本發(fā)明的操作標本為人垂體泌乳素腺瘤組織，采取“溫和酶消化-過濾”去除成纖維細胞，以“紅細胞裂解液”去除紅細胞，除去成纖維細胞和紅細胞這兩種細胞，剩下的即為人垂體泌乳素腺瘤細胞。
全文摘要
本發(fā)明是一種人垂體泌乳素腺瘤細胞的純化培養(yǎng)方法，其特征在于采取“溫和酶消化-過濾”去除成纖維細胞，以“紅細胞裂解液”去除紅細胞，除去這兩種細胞，剩下的即為人垂體泌乳素腺瘤細胞，其操作步驟是(1)、將腫瘤組織置于培養(yǎng)液中；(2)、將組織塊剪成小塊；(3)、用胰酶進行消化；(4)、經(jīng)細胞篩過濾，終止消化；(5)、加入紅細胞裂解液，重懸細胞；(6)、除紅細胞裂解液，(7)、吸培養(yǎng)液加入血細胞計數(shù)板，計數(shù)；(8)、按每孔1×10⁶個細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；本發(fā)明操作簡便，可以同時去除成纖維細胞和紅細胞，所得到的垂體腺瘤細胞采取免疫細胞化學的方法進行驗證，細胞純度高，細胞純度接近100％。
文檔編號C12N5/09GK101381704SQ20081015813
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者于春江, 煒 孫, 孟慶虎, 曲春城, 王志剛, 王成偉, 江 趙 申請人:孟慶虎