專利名稱：：黃尾鰤腹水病毒的實(shí)時(shí)定量rt-pcr快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物病原的檢測技術(shù)，涉及一種采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction,簡稱RT-PCR)技術(shù)檢測魚類黃尾獅腹水病毒的方法——黃尾獅腹水病毒的實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測方法。
背景技術(shù)：
：黃尾螄腹水病毒隸屬于雙片段RNA病毒科(Birnaviridae)、水生雙片段RNA病毒屬(Aquabimavirus),于1985年首次從黃尾鯽(Seriolaquinqueradiata)分離到。該病毒可以感染艫魚、真鯛、日本比目魚、琥珀魚、黃尾鯽等魚類，目前也已經(jīng)從貝——日本珍珠貝中分離到黃尾鯽腹水病毒。黃尾鯽腹水病毒是嚴(yán)重影響海水養(yǎng)殖魚類的一種傳染性疾病的病原，對亞洲海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局與韓國海洋水產(chǎn)部于2005年發(fā)布的《中韓進(jìn)出口活水生動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫協(xié)議》中規(guī)定，中國出口到韓國的鱸魚、真鯛、大菱鲆、牙鲆等主要海水養(yǎng)殖魚類必須進(jìn)行黃尾鯽腹水病毒的檢驗(yàn)檢疫。在一些海水養(yǎng)殖和海洋魚類消費(fèi)的主要國家中，也將該病作為重要的檢疫對象。目前魚類病毒的檢測方法主要包括細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)、免疫學(xué)診斷技術(shù)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三大類。細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)主要包括采用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、組織病理切片及電鏡觀察，其操作繁瑣，檢測周期長，且靈敏度低；免疫學(xué)診斷技術(shù)主要包括免疫熒光檢測、免疫點(diǎn)雜交，其方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，但方法相當(dāng)繁瑣，不適宜對大量樣品進(jìn)行檢測；分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),比較快速、靈敏，但是需要瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察結(jié)果，溴化乙錠是致癌物，對人體和環(huán)境有危害，并且交叉污染問題比較嚴(yán)重；另外PCR只能進(jìn)行定性檢測，不能對病毒進(jìn)行定量檢測。黃尾鯽腹水病毒的檢測方法目前主要采用細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和國際貿(mào)易的迅速發(fā)展迫切需要建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的黃尾獅腹水病毒的檢測方法，以盡快檢測病原體，打破國外技術(shù)壁壘，為國家貿(mào)易服務(wù)。定量PCR技術(shù)目前己被廣泛應(yīng)用于檢測水生生物病原體，如對蝦白斑綜合癥病毒、魚傳染性造血器官壞死病毒、副溶血弧菌等，據(jù)檢索，目前尚未見采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測黃尾鯽腹水病毒的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種黃尾鯽腹水病毒的實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測方法，以克服現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和國際魚類貿(mào)易提供一種快速、簡便、高效、實(shí)用的檢測方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的主要原理是采用熒光探針法實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，反應(yīng)體系中包括一對PCR引物和一條熒光探針，熒光探針可以與靶序列特異性的結(jié)合，熒光探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，5'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的能量由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移而被淬滅基團(tuán)吸收，因此反應(yīng)體系中檢測不到熒光信號；在PCR反應(yīng)過程中，引物和探針都與模板結(jié)合，Taq酶發(fā)揮5'-3'外切核酸酶活性，將熒光探針切斷從而使熒光報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，因此產(chǎn)生可以檢測到的熒光信號。隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增加，釋放出來的熒光信號不斷增加，熒光信號強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系，儀器記錄熒光信號強(qiáng)度，最終計(jì)算出循環(huán)閾值(Thresholdcycle,簡稱Ct值)。Ct值是指熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，Ct值與模板的初始拷貝數(shù)成反比，初始拷貝數(shù)越多，Ct值越??；利用己知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制備出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品的Ct值，可以對樣品中的黃尾獅腹水病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先設(shè)計(jì)特異性引物序列和熒光探針序列，然后提取待測樣品的RNA，之后配制實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系并按照反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)利用體外轉(zhuǎn)錄含有目的擴(kuò)增片段的核糖核酸(Ribonucleicacid，簡稱RNA)作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；最后根據(jù)定量PCR儀得到的待測樣品的Ct值來判定待測樣品中是否含有黃尾鯽腹水病毒并進(jìn)行定量。本發(fā)明所述的設(shè)計(jì)特異性引物序列和熒光探針序列選取黃尾鯽腹水病毒的衣殼蛋白基因保守序列，利用已有的PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物序列和熒光探針序列，為正向引物..5'-GGCTGATCTCACGGAAATACG-3':反向引物5'-GTCCCATTCAGGGCATACAGA-3';熒光探針5'-FAM-TCCAGAGCTCAACCCTACCCGCTG-TAMRA-3'。熒光探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)6-羧基熒光素(6-Carboxyfluorescein,簡稱FAM)，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)6-羧基四甲基羅丹明(6-Carboxytetramethylrhodamine，簡稱TAMRA)，擴(kuò)增片斷長度為70bp。本發(fā)明所述的提取待測樣品的RNA:采用傳統(tǒng)的TRIZOL法或者商業(yè)化的RNA提取試劑盒提取待測樣品的RNA，之后用核酸分析儀進(jìn)行OD26o/OD28()檢測。本發(fā)明所述的配制實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系并按照反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系由以下成分組成12.5jiL2x實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)液，l-2^L10tunol/L正向引物，l-2nLl(Himol/L反向引物，0.5-lpL10nmol/L熒光探針，l-2^L100ng/nL待測樣品的RNA，補(bǔ)充雙蒸水至反應(yīng)體系總體積為25hL。在PCR反應(yīng)管中配制好反應(yīng)體系后，將反應(yīng)管放到定量PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?8°C-52°C反應(yīng)30-60min;95'C反應(yīng)10min;之后95。C反應(yīng)15sec-30sec，57'C-63'C再反應(yīng)30sec-lmin;進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明所述的制備體外轉(zhuǎn)錄含有目的擴(kuò)增片段的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量PCR反應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線首先將PCR產(chǎn)物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體4'C過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑PCR產(chǎn)物鑒定陽性后測序，根據(jù)測序結(jié)果將篩選的陽性克隆接種到含氨芐青霉素的溶菌肉湯培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，制備質(zhì)粒脫氧核糖核酸純化后，經(jīng)過NcoI酶切后，利用T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄制備RNA模板，乙醇沉淀后于紫外分光光度計(jì)測定OD26o定量，并梯度稀釋，為6xl0氣6xl(^拷貝/^L;將梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)；由定量PCR儀得到標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值(Thresholdcycle,循環(huán)閾值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和Ct值，儀器自動(dòng)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明所述的根據(jù)待測樣品的Ct值來判定待測樣品中是否含有黃尾鯽腹水病毒并進(jìn)行定量若待測樣品的Ct值536.0，則判定待測樣品中含有黃尾鯽腹水病毒，而其病毒含量通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線由定量PCR儀自動(dòng)計(jì)算；若待測樣品的Ct值〉36.0，則判定待測樣品中不含有黃尾鯽腹水病毒。本發(fā)明適用于對黃尾鯽腹水病毒進(jìn)行快速檢測，可廣泛應(yīng)用于魚類特別是鱸魚、真鯛等養(yǎng)殖場的疫病監(jiān)控及進(jìn)出口水生動(dòng)物貿(mào)易中黃尾獅腹水病毒的檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括1.檢測快速、效率高采用一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)，即反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，大大減少交叉污染和加樣誤差，并節(jié)約了時(shí)間；該檢測方法在反應(yīng)結(jié)束后，可立即通過儀器軟件進(jìn)行結(jié)果判定，不需要瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色觀察結(jié)果，減少了環(huán)境污染和樣品交叉污染，從核酸提取到結(jié)果判定僅需要4小時(shí)；一次可以進(jìn)行96個(gè)樣品的檢測，具有高效性。2.可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量通過體外轉(zhuǎn)錄制備RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，可以對逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行對照，這樣建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線更直接、準(zhǔn)確；再通過樣品的Ct值，可以對待測樣品中的黃尾鯽腹水病毒進(jìn)行定量，準(zhǔn)確度高，做到了真正意義上的定量檢測。3.特異性強(qiáng)特異性引物和熒光探針只與黃尾鯽腹水病毒特異性地結(jié)合，與彈狀病毒科的其他病毒都沒有交叉反應(yīng)。4.檢測范圍廣，靈敏度高在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為6xl(^6xl(^拷貝之間，都有擴(kuò)增反應(yīng)，檢測范圍可達(dá)6個(gè)數(shù)量級；檢測限達(dá)60個(gè)RNA拷貝，靈敏度高。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例l以患病鱸魚樣品為例，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法定量檢測黃尾鯽腹水病毒。自黃海沿岸某養(yǎng)殖場取五尾鱸魚作為檢測樣品，該樣品具有感染黃尾鯽腹水病毒的典型臨床癥狀，體表和鰭充血，腹部膨脹，內(nèi)有腹水。本實(shí)施例具體檢測步驟包括(1)設(shè)計(jì)特異性引物序列和熒光探針序列在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/中搜索黃尾獅腹水病毒的序列，利用已有的DNALASERGENE7.1軟件分析比較各個(gè)基因序列的保守性，結(jié)果表明黃尾鯽腹水病毒的衣殼蛋白基因序列比較保守；因此，以衣殼蛋白基因?yàn)槟繕?biāo)基因，利用PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物序列和熒光探針序列。設(shè)計(jì)過程中要求引物的退火溫度(meltingtemperature,簡稱Tm)在57'C-63'C之間，兩條引物的Tm值相差2°C以內(nèi)，且不形成引物二聚體，熒光探針的Tm值比引物高8'C-10'C。設(shè)計(jì)的特異性引物序列和熒光探針序列如下正向引物5'-GGCTGATCTCACGGAAATACG-3';反向引物5'-GTCCCATTCAGGGCATACAGA-3';熒光探針5'-FAM-TCCAGAGCTCAACCCTACCCGCTG-TAMRA-3'。擴(kuò)增片斷長度為70bp。設(shè)計(jì)好特異性引物序列和熒光探針序列后，通過TAKARA商業(yè)公司，采用P-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行特異性引物和熒光探針的合成與熒光標(biāo)記。熒光探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。(2)提取待測樣品的RNA采用RNA提取試劑盒(TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer3.0)，按照說明書進(jìn)行RNA的提取。具體步驟為取50mg的取鱸魚的腎、脾、腦等組織勻漿，放入到1.5ml離心管中，加入500nLSolutionA，劇烈振蕩混勻室溫放置5分鐘。加入125pLSolutionB和125nLDBbuffer,充分混勻后，12,000rpm離心5分鐘。將試劑盒中的SpinColumn安置于Collectiontube(2ml)上，將離心后的850pL上清液轉(zhuǎn)移到SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。加入500nL的RinseA至SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。加入500|tiL的RinseB至SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。再加入500pL的RinseB至SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入30200pL的滅菌蒸餾水或者Elutionbuffer,室溫靜置l分鐘。12,000rpm離心1分鐘，即得到待測樣品的RNA。用核酸分析儀進(jìn)行定檢測，結(jié)果表明樣品核酸的OD26o/OD28o在1.8-2.0之間，調(diào)整RNA濃度為100ng/pL。G)配制實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系并按照反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)在PCR反應(yīng)管中加入12.5pL2x實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)液，1lOpmol/L正向引物、lpL10pmol/L反向引物，0.5nLlOpmol/L熒光探針，l^LlOOng^iL待測樣品RNA，9pL雙蒸水，使得反應(yīng)體系總體積為25pL。采用美國產(chǎn)的ABI7900HT型定量PCR儀器進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?8-C反應(yīng)40min;95°C反應(yīng)10min;之后95'C反應(yīng)15sec，58°C再反應(yīng)40sec并進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。(4)制備含有目的擴(kuò)增片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線按照常規(guī)分子克隆操作方法，首先PCR產(chǎn)物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用TAKARA公司的凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體4°C過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑PCR產(chǎn)物鑒定陽性后送TAKARA公司測序，根據(jù)測序結(jié)果將篩選的陽性克隆接種到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，制備質(zhì)粒DNA純化后，經(jīng)過Ncol酶切后，利用T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄制備RNA模板，乙醇沉淀后于核酸分析儀測定OD260定量，測定濃度為6xl()S拷貝4iL。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋，分別得到濃度為6xl06、6xl05、6xl04、6xl03、6xl02、6xl01拷貝4;L的標(biāo)準(zhǔn)品，以6個(gè)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟(3)相同，只是將反應(yīng)體系中的待測樣品RNA替換為標(biāo)準(zhǔn)品。ABI7900HT型定量PCR儀在反應(yīng)過程中自動(dòng)收集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后，利用儀器自帶的SDS2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，見表l。表l標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與Ct值的關(guān)系，定量PCR儀的SDS2.1分析軟件自動(dòng)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即樣品的RNA濃度(X)與Ct值的關(guān)系為Ct=-3.271gX+37.48，相關(guān)系數(shù)R2=0.9963，(5)根據(jù)待測樣品的Ct值判定待測樣品中黃尾獅腹水病毒的含量并進(jìn)行定量標(biāo)準(zhǔn)品濃度最低為60個(gè)拷貝時(shí)，其Ct值的平均值為35.20，因此建立檢測的判定標(biāo)準(zhǔn)為以<^值=36作為臨界值，若待測樣品的Ct值^36.0，則判定樣品中含有黃尾鯽腹水病毒，并根據(jù)其Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；若待測樣品的Ct值〉36.0，則判定樣品中不含有黃尾鯽腹水病毒。經(jīng)定量RT-PCR檢測，五尾鱸魚待測樣品的Ct值分別為19.09322、21.08242、25.60087、22.49328、31.00698(見表2)，Ct值都小于36.0，判定樣品都含有黃尾鰣腹水病毒；再根據(jù)待測樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，SDS2.1分析軟件定量計(jì)算出鱸魚樣品中的黃尾鯽腹水病毒拷貝數(shù)，見表2。表2五尾艫魚樣品的黃尾鰣腹水病毒的定量RT-PCR檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2分析外觀健康的真鯛樣品是否感染黃尾獅腹水病毒。真鯛樣品采自黃海南岸某養(yǎng)殖場，共六尾，外觀正常，無黃尾鯽腹水病毒的癥狀，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測真鯛樣品體內(nèi)是否攜帶黃尾鯽腹水病毒。本實(shí)施例具體檢測步驟包括(1)設(shè)計(jì)特異性引物序列和熒光探針序列同實(shí)施例1。(2)提取待測樣品的RNA采用傳統(tǒng)的TRIZOL法進(jìn)行核酸的提取。具體步驟為取待測樣品的腦、腎、脾等組織進(jìn)行勻漿，加入600nLTRIZOL，顛倒混勻，再加入200pL氯仿，混勻器上震蕩混勻5sec。于4'C12000rpm離心15min。吸取上清液500^L，加入400pL異丙醇，-20。C放置30分鐘。12000rpm離心15min，倒去上清；然后加入600|^75°/。乙醇，洗滌沉淀，于12000rpm離心5min，輕輕倒去上清。將RNA沉淀室溫干燥3min后，加入20pL雙蒸水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA。2000rpm離心5sec，在冰上保存?zhèn)溆?。之后用核酸分析儀進(jìn)行檢測，結(jié)果表明樣品核酸的OD260/OD280在1.8-2.0之間，調(diào)整RNA濃度為lOOng4iL。(3)配制實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系并按照反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)在PCR反應(yīng)管中加入12.5pL2x實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)液，1.5^L10pmol/L正向引物、1.5pLlOpmol/L反向引物，0.510nmol/L熒光探針2ixL待測樣品RNA,7pL雙蒸水，反應(yīng)體系總體積為25pL。采用ABI7900HT型定量PCR儀器進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?8'C反應(yīng)40min;95'C反應(yīng)10min;之后95。C反應(yīng)20sec，58°C再反應(yīng)50sec共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。(4)制備含有目的擴(kuò)增片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線同實(shí)施例1。(5)根據(jù)儀器軟件得到的待測樣品的Ct值來判定待測樣品中的黃尾獅腹水病毒并定量經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測，儀器給定的六尾真鯛樣品的Ct值都大于36.0，判定外觀正常的真鯛樣品都不含有黃尾螄腹水病毒。實(shí)施例3分析從某國進(jìn)口的外觀健康的大菱鲆是否感染黃尾鯽腹水病毒。本實(shí)施例具體檢測步驟包括(1)設(shè)計(jì)特異性引物序列和熒光探針序列同實(shí)施例l。(2)提取待測樣品的RNA:同實(shí)施例2。(3)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)同實(shí)施例2。(4)制備含有目的擴(kuò)增片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線同實(shí)施例l。(5)根據(jù)儀器軟件得到的待測樣品的Ct值來判定待測樣品中的黃尾鯽腹水病毒并定量經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測，儀器給定的大菱鲆樣品的Ct值大于36.0，判定外觀正常的大菱鲆樣品不含有黃尾鯽腹水病毒。核苷酸序列表<110>山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>黃尾獅腹水病毒的實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測方法<160>4<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer—bind<222>(1)…(21)<223>根據(jù)定量RT-PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增黃尾螄腹水病毒的正向引物。<400>1ggctgatctcacggaaatacg21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer—bind<222>(1)...(21)<223〉根據(jù)定量RT-PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增黃尾鯽腹水病毒的反向引物。<400>2gtcccattcagggcatacaga21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer—bind<222>(l)...(24)<223>根據(jù)定量RT-PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增黃尾鯽腹水病毒的熒光探針。<400>3tccagagctcaaccctacccgctg24<210>4<211>70<212>RNA<213>人工序列<220><222>(1)…(70)<223>定量RT-PCR反應(yīng)的目的擴(kuò)增片段序列<400>4ggcugaucucacggaaauacgacguccagagcucaacccuacccgcuggucuguaugccc60ugaaugggac70權(quán)利要求1、一種黃尾鰤腹水病毒的實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測方法，其特征在于首先設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針序列，然后提取待測樣品的RNA，之后配制實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系并按照反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)利用體外轉(zhuǎn)錄含有目的擴(kuò)增片段的核糖核酸作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后根據(jù)待測樣品的Ct值進(jìn)行結(jié)果判定，其中所述的特異性引物序列和熒光探針序列如下正向引物5′-GGCTGATCTCACGGAAATACG-3′；反向引物5′-GTCCCATTCAGGGCATACAGA-3′；熒光探針5′-FAM-TCCAGAGCTCAACCCTACCCGCTG-TAMRA-3′。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃尾鯽腹水病毒的實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測方法，其特征在于實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系由以下成分組成12.5^iL2x實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)液，l-2^iL10pmol/L正向引物，l-2^iL10pmol/L反向引物，0.5-ljiL10(imoI/L熒光探針，l-2^L100ng/|LAL待測樣品的RNA,補(bǔ)充雙蒸水至25pL。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃尾鯽腹水病毒的實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測方法，其特征在于實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?8-C-52t:反應(yīng)30-60min;95°C反應(yīng)10min;之后95。C反應(yīng)15sec-30sec，57°C-63°C再反應(yīng)30sec-lmin，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃尾鯽腹水病毒的實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測方法，其特征在于結(jié)果判定依據(jù)為若待測樣品的Ct值^36.0，則判定待測樣品中含有黃尾鰣腹水病毒，其病毒含量通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線由定量PCR儀器軟件自動(dòng)計(jì)算；若待測樣品的Ct值〉36.0，則判定待測樣品中不含有黃尾鯽腹水病毒。全文摘要本發(fā)明公開了一種黃尾鰤腹水病毒的實(shí)時(shí)定量RT-PCR快速檢測方法，該方法利用正向引物、反向引物和熒光探針并以體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的雙重對照，可以對黃尾鰤腹水病毒進(jìn)行定性、定量檢測。本發(fā)明具有快速，準(zhǔn)確、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場以及檢驗(yàn)檢疫部門對魚類病毒的快速檢驗(yàn)檢疫，也可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景廣泛。文檔編號C12Q1/68GK101532063SQ200810160609公開日2009年9月16日申請日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者凌宗帥,葒劉,濤孫,岳志芹,張?zhí)?彪徐,方紹慶,瓊李,肖西志,巍趙,辛學(xué)謙,鄧明俊申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心