專利名稱：：鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列及其方法。
背景技術(shù)：
：赤霉病是小麥生產(chǎn)上重要的一種流行性病害。該病害主要分布在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)，長(zhǎng)江上游和華南冬麥區(qū)也常發(fā)生。該病害發(fā)生后一般減產(chǎn)10-20%,嚴(yán)重時(shí)達(dá)80-90%。它的危害嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量，同時(shí)病菌產(chǎn)生的一系列真菌毒素可引起人畜中毒。在我國(guó),亞洲鐮孑包菌(Fwran'wm)和禾谷鐮孑包菌(Fwsan'wmgraw/"earaw)是小麥赤霉病的主要致病菌。亞洲鐮孢菌主要分布在我國(guó)南方地區(qū)，而禾谷鐮孢菌主要分布在北方地區(qū)。這兩個(gè)小種非常相近，根據(jù)多個(gè)基因序列差異對(duì)亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的鑒定較麻煩，利用已報(bào)道引物對(duì)GzTri7/fl和GzTri7/rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Zhangetal.,2007,MycologicalResearch,967-975),不能給出擴(kuò)增產(chǎn)物或得到161-bp產(chǎn)物為亞洲鐮孢菌，得到172326-bp產(chǎn)物為禾谷鐮孢菌，該對(duì)引物無(wú)法區(qū)分亞洲鐮孢菌和其它病菌真菌。因此，需要重新建立一套新的體系，即能快速檢測(cè)，又能準(zhǔn)確鑒定這兩個(gè)不同的小種。該體系的建立將對(duì)兩個(gè)小種的快速檢測(cè)、分布研究及小麥赤霉病的防治具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列，該引物特異性高，利用該引物序列能快速、準(zhǔn)確地鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌。一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列，包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:l所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO:2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO:4所述的堿基序列。已有研究可知，亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌在遺傳背景上存在較大差異，通過(guò)對(duì)3個(gè)亞洲鐮孢菌菌抹(Fal,Fa2,Fa3)和3個(gè)禾谷鐮孢菌菌抹(Fgl,Fg2,Fg3)的cy/5L4基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的菌株間共存在69處核苷酸差異，其中16個(gè)核苦酸引起氨基酸變化。根據(jù)兩個(gè)菌系c少/5/J基因序列的差異，我們?cè)O(shè)計(jì)了上述兩組引物。第一組引物的正向引物3，末端堿基T與亞洲鐮孢菌菌株的特異堿基T配對(duì)，第一組引物的反向引物3，末端堿基G和倒數(shù)第二個(gè)堿基T分別與亞洲鐮孢菌菌林特異堿基CA配對(duì)。同理，第二組引物的正向引物3，末端堿基T與禾谷鐮孢菌(菌抹的特異堿基T配對(duì)，第二組引物的反向引物3，末端堿基A和倒數(shù)第二個(gè)堿基C分別與禾谷鐮孢菌菌抹特異堿基TG配對(duì)。利用第一組引物對(duì)亞洲鐮孢菌菌抹的DNA進(jìn)行擴(kuò)增可以得到292-bp的片斷，利用第二組引物對(duì)禾谷鐮孢菌菌抹的DNA進(jìn)行擴(kuò)增可以得到352-bp的片斷，利用任何一組引物對(duì)其它真菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，不能擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述引物鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的方法，包括以下步驟a、提耳又待;險(xiǎn)測(cè)菌的DNA;b、以待檢測(cè)菌的DNA為模板，使用第一組引物和第二組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c、PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用EB進(jìn)行顯色，當(dāng)凝膠上顯現(xiàn)292-bpDNA條帶時(shí)，說(shuō)明待檢測(cè)菌為亞洲鐮孢菌。當(dāng)凝膠上顯現(xiàn)352-bpDNA條帶時(shí)，說(shuō)明待檢測(cè)菌為禾谷鐮孢菌。當(dāng)凝膠上未顯現(xiàn)條帶時(shí)，則說(shuō)明待檢測(cè)菌為其它病菌真菌。本發(fā)明提供的兩組引物和方法能快速鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌，檢測(cè)引物具有很高特異性，且整個(gè)PCR和電泳過(guò)程僅需2h。因此，本發(fā)明的引物和檢測(cè)方法可用來(lái)快速、準(zhǔn)確、全面檢測(cè)引起小麥赤霉病的主要病原菌。圖1為本發(fā)明引物的序列圖2為引物特異性檢測(cè)中各菌抹DNA擴(kuò)增后的凝膠電泳圖；圖3為檢測(cè)不同地方子囊殼DNA擴(kuò)增后的凝膠電泳圖。具體實(shí)施方式所選用的菌林尖孑包錄孑包菌(Fusw/顯o平/。r應(yīng))、燕麥錄孑包菌(Fflve"acewm)、銳頂鐮孢菌(F)、半凈果鐮孢菌(F^附/fedww)、串J朱鐮孑包菌swZ)g/W/"(3ra)、黃色鐮孑包菌(Fcw/won潔)以及5個(gè)亞洲鐮孑包菌(Fwsan'wwas她c訓(xùn))菌抹(Fal,,Fa2,Fa3，F(xiàn)a4,Fa5)和5個(gè)禾谷嫌孑包菌(Fw5W7'謂gramz'wear膽)菌抹(Fgl,Fg2,Fg3，F(xiàn)g4，F(xiàn)g5)。上述菌林均為常見(jiàn)的植物病原真菌，是本發(fā)明所需的試驗(yàn)材料，對(duì)菌抹沒(méi)有特異性要求，可以通過(guò)常規(guī)的分離純化方法得到。提取DNA用接種針從PDA平板上刮取菌絲(100mg)，置于1.5-mLEppendorf管中，加500DNA提取裂解液(200mMTris-HCl，50mMEDTA，20mMNaCl,l%SDS,pH8.0)，用電鉆驅(qū)動(dòng)玻棒充分研磨，振蕩混勻，室溫靜置10min;13200r/min4。C,離心5min;取上清液約400pL于新的1.5-mLEppendorf管中，力。750)xL無(wú)水乙醇，混和混勻，13200r/min4°C，離心5min,棄上清；沉淀用70%乙醇洗滌，室溫放置干燥5-10min,溶于30(iL無(wú)菌水中，-201:保存?zhèn)溆?。上述?種真菌以及待檢測(cè)的亞洲鐮孢菌菌林和禾谷鐮孢菌菌抹的DNA均采用上述方法提取。引物合成如圖1所示，根據(jù)3個(gè)亞洲鐮孢菌菌抹和3個(gè)禾谷鐮孢菌菌抹中c;^5L4基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)引物Fa-F/Fa-R和Fg-F/Fg-R。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述序列可以通過(guò)常^5L方法合成，也可以委托專業(yè)生物試劑公司合成，本發(fā)明的引物由上海博彩合成。引物特異性驗(yàn)證以上述提取的8種真菌的DNA為模板，用Fa-F/Fa-R和Fa-F/Fa-R兩組S1物進(jìn)行PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)均包含一個(gè)陰性對(duì)照(用無(wú)菌水代替DNA模板)。25反應(yīng)體系1(iLDNA模板(約0.4ng)，引物各0.2pmolI—1,dNTP0.2pmoir',MgCl22mmoll:lx緩沖液(北京東勝公司生產(chǎn))，聚合酶1.5U個(gè)單位，雙蒸水補(bǔ)足至25^L。反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性3min,94。C變性30s，55。C退火30s,72°C延伸30s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5min。PCR產(chǎn)物用1.5。/。的瓊脂糖在1xTAE緩沖液中電泳后，用EB顯色拍照。如圖3所示，5個(gè)禾谷鐮孢菌菌株(Fgl，F(xiàn)g2，F(xiàn)g3,Fg4,Fg5)均能擴(kuò)增到352-bp的條帶，5個(gè)亞洲鐮孢菌菌林(Fal，F(xiàn)a2，F(xiàn)a3，F(xiàn)a4,Fa5)均能擴(kuò)增到292-bp的條帶，其它病原真菌都沒(méi)有擴(kuò)增到任何條帶。由此可見(jiàn)，上述兩組引物的特異性很高，適合鑒定亞洲鐮孢菌菌抹和禾谷鐮孢菌。檢測(cè)不同地區(qū)亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的分布/人江蘇省海安市A(大爿/H真)、江蘇省海安市B(海安鎮(zhèn))、江蘇省靖江市和河南省漯河市的小麥地中收集子囊殼(每塊地約100mg)。將子嚢殼置于1.5-mLEppendorf管中，加入,1DNA提取緩沖液(1-2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，200mMTris-HCl,50mMEDTA,200mMNaCl,1%SDS和ddH20,pH8.0)，用尖頭玻棒安裝在常用的電工手電轉(zhuǎn)上研磨1min,再向離心管中加入400pl的提取緩沖液蝸旋混勻后，室溫靜置10min;將上述混合液4°C,15,000rpm條件下離心5min，再將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，然后加入750pl無(wú)水乙醇，混勻后4。C，15,000rpm條件下離心2min,棄上清；將沉淀的DNA用70。/。乙醇洗滌，室溫干燥后溶于50^tl無(wú)菌水，即為提取的DNA;將上述的DNA溶液用UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物回收試劑盒(上海生工生產(chǎn))過(guò)柱純化。利用Fa-F/Fa-R和Fa-F/Fa-R兩組引物對(duì)上述田間樣品提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照，PCR反應(yīng)體系同上所述。如圖3所示，江蘇海安市大公鎮(zhèn)和海安鎮(zhèn)及江蘇靖江市的子嚢殼DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到292-bp片段，說(shuō)明這三個(gè)地方只存在小種亞洲鐮孢菌，河南省漯河市子嚢殼DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到352-bp和292-bp兩種片段，說(shuō)明該地區(qū)同時(shí)存在亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌兩個(gè)小種。SEQUENCELISTING<110>浙江大學(xué)<120>鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列及其方法<130><160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉18<212>DNA<213>亞洲嫌孑包菌(Fusariumasiaticum)<400>1cagcttcctcgaagacct18<210>2<211>21<212>DNA<213>亞洲鐮孑包菌(Fusariumasiaticum)<400>2ggaccgtaaatttcttcagtg21<210>3<211>20<212>DNA<213>禾谷鐮孑包菌(Fusariumgraminearum)<400>3tatcccttatgggtcttggt20<210>4<211>21<212>DNA<213>禾谷嫌孑包菌(Fusariumgraminearum)<400>4ggaccgtaaacttcttctgca2權(quán)利要求1、一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列，其特征在于包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的堿基序列。2、一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌方法，包括以下步驟a、提取待4企測(cè)菌的DNA;b、以待檢測(cè)菌的DNA為模板，使用第一組引物和第二組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c、PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用EB進(jìn)行顯色，觀測(cè)凝膠中DNA條帶大小，擴(kuò)增得到292-bpDNA條帶為亞洲鐮孢菌，擴(kuò)增得到352-bpDNA條帶為禾谷鐮孢菌。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列及其方法，包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的堿基序列。本發(fā)明引物序列特異性高，能夠用于快速鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌。文檔編號(hào)C12N15/11GK101440402SQ200810163248公開(kāi)日2009年5月27日申請(qǐng)日期2008年12月11日優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日發(fā)明者馨劉,尹燕妮,蔣金花,馬忠華申請(qǐng)人:浙江大學(xué)