專利名稱：一株高產(chǎn)脂肪酶的解脂亞羅酵母突變株、培養(yǎng)方法及其酶應(yīng)用的制作方法
一株高產(chǎn)脂肪酶的解脂亞羅酵母突變株、培養(yǎng)方法及其酶應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及高產(chǎn)脂肪酶的解脂亞羅酵 母菌林，發(fā)酵培養(yǎng)方法，及其發(fā)酵獲得的脂肪酶或發(fā)酵液在催化脂肪 酸曱酯化反應(yīng)中的用途。背景技術(shù)：
解脂亞羅酵母菌抹又稱解脂耶氏酵母(Kwrow/a /;Xy"ca),屬 半子嚢酵母菌，是非常規(guī)酵母菌之一，已應(yīng)用于生產(chǎn)脂肪酶、單細(xì)胞 蛋白、檸檬酸、異丙基蘋果酸等。它產(chǎn)生的脂肪酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)、 輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
脂肪酶能夠?qū)⒅舅岣视王ゴ呋鉃橛坞x脂肪酸、甘油二酯、 甘油單酯、甘油，此外還能催化醇或酯與甘油酯之間的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)， 脂肪酸與醇之間的酯化反應(yīng)，具有廣泛的應(yīng)用價值，已成為市場上的 第三大工業(yè)用酶。但現(xiàn)有的產(chǎn)脂肪酶的解脂亞羅酵母菌林產(chǎn)酶單位偏 低，工業(yè)化成本偏高。
隨著能源危機(jī)、環(huán)境污染的加劇，生物柴油作為替代能源是以可 再生資源為原料，同時具有環(huán)境污染小的優(yōu)點，成為研究開發(fā)的熱點， 并達(dá)到了一定規(guī)模的實際應(yīng)用。脂肪酶催化生物柴油合成，具有方法 簡單、條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物價值高的優(yōu)點。目前，應(yīng)用于生物 柴油生產(chǎn)的脂肪酶開發(fā)不多。NOVA公司壟斷經(jīng)營的脂肪酶成本高， 不適合催化反應(yīng)器進(jìn)一步放大。因此，在我國乃至世界生物柴油生產(chǎn) 的工業(yè)化過程中，急需獲得酶活單位高，生產(chǎn)成本低廉的工業(yè)化脂肪 酶生產(chǎn)菌林。
本專利使用紫外照射方法對野生型出發(fā)菌抹 進(jìn)行誘變，并將常規(guī)篩選方法加以改進(jìn)，得了高產(chǎn)脂肪酶的突變菌抹LW1。經(jīng)本專利所述方法發(fā)酵得到的發(fā)酵液酶活最高達(dá)到15500u/ml。 該菌株及其培養(yǎng)方法提高了脂肪酶的產(chǎn)生量，適合工業(yè)化生產(chǎn)，能催 化脂肪酸甲酯化等酶法催化生產(chǎn)生物柴油領(lǐng)域。使用專利所述方法得 到的高酶活的發(fā)酵液還可以制成不同酶活的脂肪酶制劑，可以作為產(chǎn) 品向市場銷售，因此具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。
發(fā)明內(nèi)容
[要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的第一個目的是提供一種高產(chǎn)脂肪酶的解脂亞羅酵母菌 抹(7am w/a /*o/>;"ca)LWl ( CGMCC No.2707 ),又稱解脂耶氏酵母。
本發(fā)明的另 一個目的是提供所述高產(chǎn)脂肪酶的解脂亞羅酵母菌 抹LW1的發(fā)酵培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的另 一 目的是提供所述脂肪酶的制備方法。
本發(fā)明的另 一 目的是提供所述脂肪酶與所述發(fā)酵液在其催化脂 肪酸甲酯化方法中的用途。
[技術(shù)方案J 本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明涉及紫外誘變選育得到解脂亞羅酵母菌抹(ramw/a 一ca)LWl 。
根據(jù)本發(fā)明，以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食堂周圍環(huán)境中分離得到的解 脂亞羅酵母野生型為試驗菌抹，通過紫外線誘變的方法，以改良的透 明圏篩選方法進(jìn)行初篩，搖瓶復(fù)篩得到了脂肪酶高產(chǎn)解脂亞羅酵母菌 抹(farrcw/a /// o/y〃ca) LW1 。
本發(fā)明的高產(chǎn)脂肪酶的解脂亞羅酵母菌抹(rs/ToWs ///70//〃ca)LWl，該菌菌抹已于2008年10月14日，寄存于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯 路，編號CGMCCNo.2707,它具有以下微生物學(xué)特性
1)、麥芽汁培養(yǎng)基在28。C下生長48小時后，細(xì)胞呈長橢圓形 假絲酵母狀。
62) 、 PDA固體培養(yǎng)基上的玻片培養(yǎng)物良好的假菌絲體形成。
3) 、無孢子形成。
4) 、劃線培養(yǎng)物灰白，頂端凸起，表面構(gòu)造有褶皺。
5) 、最適培養(yǎng)溫度28°C
6) 、能夠利用的碳源利用葡萄糖、甘油，不利用淀粉、蔗糖。
7) 、 kN03同化作用無
本發(fā)明還涉及所述高產(chǎn)脂肪酶解脂亞羅酵母菌株LW1的誘變選 育方法，其特征在于該方法的步驟如下
A、 制備野生型出發(fā)菌林菌懸液
以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食堂周圍環(huán)境中分離得到的野生型解脂亞羅 酵母為出發(fā)菌林，依次經(jīng)PDA固體培養(yǎng)基在28。C下活化1次，PDA 液體培養(yǎng)基在28。C下活化2次，然后按照以重量計5%接種量接種入 PDA液體培養(yǎng)基，在溫度28。C下培養(yǎng)12h,然后取lml菌液加到10ml 已滅菌的以重量計0.86%NaCl水溶液中，得到野生型菌株菌懸液。 所述的PDA培養(yǎng)基與下述的PDA斜面培養(yǎng)基相同。
所述野生型解脂亞羅酵母培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)裝置是本技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)裝置。例如所述野生型解脂亞羅酵母固體培養(yǎng) 裝置是恒溫培養(yǎng)箱；所述野生型解脂亞羅酵母液體培養(yǎng)裝置例如是恒 溫振蕩搖床。
所述滅菌所使用的設(shè)備是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的設(shè)備，例 如上海申安醫(yī)療器械廠商品名LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器。
B、 紫外線誘變及高產(chǎn)菌抹的選育
采用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法，例如紫外誘變的方法， 將在步驟A)所得到的野生型解脂亞羅酵母出發(fā)菌株菌懸液的活菌數(shù) 調(diào)節(jié)到1.85xl(^個/ml，將所述懸液置于玻璃片上，其懸液層厚度為 0.2cm,讓其在距紫外燈25cm的20瓦紫外燈下照射90秒進(jìn)行紫外 線誘變；紫外線誘變結(jié)束后立即將菌液涂布于PDA固體培養(yǎng)基平板上，在溫度28。C下培養(yǎng)90小時。
所使用紫外燈的波長范圍是250—265nm;在待紫外線誘變的懸 液層表面上的光照度是1850uw/cm2,所述的紫外燈例如是北京昌平 長城空氣凈化設(shè)備工程公司以商品名超凈工作臺銷售的產(chǎn)品。
從誘變后培養(yǎng)的PDA固體培養(yǎng)基平板上挑選單菌落接種于初篩 分離培養(yǎng)基A上，在溫度28。C下培養(yǎng)48小時。
本發(fā)明所述的改良透明圈篩選方法釆取的初篩分離培養(yǎng)基A是 在PDA固體培養(yǎng)基中添加三丁酸甘油酯至終濃度2。/c)(以重量計)、琥 珀酸鈉至終濃度25mg/ml與制霉菌素至終濃度20U/ml 。其中添加的制 霉菌素是一種抗真菌劑，能與真菌細(xì)胞膜中的麥角固醇結(jié)合，引起細(xì) 胞膜透性改變，增進(jìn)菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有利于胞外酶的分泌， 因此利用制霉菌素來篩選高滲透性變異抹可使胞外酶產(chǎn)量進(jìn)一步提 高；另外，在篩選時添加脂肪酶底物結(jié)構(gòu)類似物一一琥珀酸鈉，能解 除代謝產(chǎn)物的反饋抑制，以期通過篩選獲得解除代謝產(chǎn)物反饋抑制作 用的代謝調(diào)節(jié)變異抹來提高酶產(chǎn)量(參見文獻(xiàn)宋欣，曲音波"耐 堿性脂肪酶突變株的選育及其酶學(xué)性質(zhì)的研究"，工業(yè)微生物1999 (29) 12;章文賢，蔣詠梅等，"抗性突變林篩選法選育脂肪酶高產(chǎn) 菌"，工業(yè)孩i生物2001 (31 ) 6)。
由于脂肪酶可分解培養(yǎng)基中的三丁酸甘油酯而產(chǎn)生透明圈，所以 可以從上述初篩分離培養(yǎng)平板上挑選17個水解透明圈大的菌林，在 以重量計5%接種量接入培養(yǎng)基B中，在溫度28。C與200rpm條件下 在搖床上進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，每4小時取樣測定酶活，直至酶活下降，這 樣得到產(chǎn)酶水平最高的高產(chǎn)脂肪酶解脂亞羅酵母菌林LW1 。
所述的培養(yǎng)基B的成分及配比優(yōu)選為以重量計豆粉6%、豆油 4%、葡萄糖1%、 (NH4)2SO40.2%、 KH2P04 0.1%、 MgS04-7H20 0.05 %， pH6.5 。
在本發(fā)明中，所述脂肪酶酶活的測定方法是一敢欖油滴定法，該方法的步驟如下
1 )0.05M NaOH的配制先用無C02水配制5M NaOH儲液； 再準(zhǔn)確稀釋50倍后，稱取IO(TC烘至恒重的鄰苯二曱酸氫鉀0.38g, 溶于80ml無C02水中，采用酸堿滴定的方法標(biāo)定出其準(zhǔn)確濃度，再 推算出儲液濃度；現(xiàn)場使用無C02水將所述的儲液配制成0.05M NaOH溶液；
2 ) 以重量計2%PVA - 1750水溶液的配制準(zhǔn)確稱量PVA -1750，加到蒸餾水中，并用沸水浴加熱使之溶解，然后用三層紗布過 濾，并定容，在溫度4。C下保存；PVA即聚乙烯醇。
3) PVA-橄欖油乳化液底物的配制將橄欖油與在上述步驟 2)得到的以重量計2 % PVA - 1750以1: 3 ( v/v )比例混合，使用實 驗室高速剪切分散乳化機(jī)(上海貝爾特機(jī)電設(shè)備科技有限公司，B25 型，220V， 50Hz) 10000rpm、乳化2-3分鐘，得到PVA-橄欖油乳 化液底物；
4 ) 取5ml在上述步驟3)得到的乳化液底物與4ml 0.1M pH8.0 磷酸鈉緩沖液，把它們加到150ml三角瓶中，再把三角瓶置于恒溫水 浴搖床中，在溫度37。C與130rpm下溫育5min;
5) 取lml適當(dāng)稀釋的在前面制備得到的酶液，加入到上述底 物和緩沖液的混合物中，在溫度37。C與130rpm條件下進(jìn)行反應(yīng) 10min,然后加入15ml無水乙醇終止反應(yīng)；
6 ) 滴力口 4滴酚酞作指示劑，使用步驟l)的0.05M NaOH溶液 滴定酶解產(chǎn)生的脂肪酸，至反應(yīng)液變粉紅色停止。
空白操作如前面所述的方法相同，只是將發(fā)酵液與無水乙醇混合 反應(yīng)10min后加入到所述底物和緩沖液中。
根據(jù)本發(fā)明，所述的酶活定義為在該橄欖油滴定法的測定條件 下，lmin釋放lpmol脂肪酸的酶量為一個酶活單位。
本發(fā)明還涉及所述的解脂亞羅酵母菌抹LW1的培養(yǎng)。所述高產(chǎn)
9脂肪酶解脂亞羅酵母菌纟朱LW1的培養(yǎng)方法如下
A、 斜面培養(yǎng)
將所述解脂亞羅酵母菌抹菌抹LW1取一接種環(huán)菌苔接種于PDA 固體斜面，在初始pH6. 0—pH7. 0與溫度28。C一30。C下恒溫培養(yǎng)12 一72小時。
在PDA固體斜面培養(yǎng)時使用的PDA固體斜面培養(yǎng)基配制方法如 下200g馬鈴薯經(jīng)洗凈去皮切碎后，加水1000ml煮沸半個小時，用 紗布過濾，其濾液再加20g葡萄糖，混勻后用去離子水補(bǔ)充液體體積 至lOOOml，在溫度115。C下滅菌15分鐘，得到PDA液體培養(yǎng)基，往 該P(yáng)DA液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂，待瓊脂溶解、凝固后得到PDA 固體培養(yǎng)基。
所述斜面培養(yǎng)時間根據(jù)菌種生長情況，選擇生長曲線中處于對數(shù) 增長期的菌種。
所述斜面培養(yǎng)使用的儀器是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的儀器， 如試管和茄子瓶。
B、 搖瓶培養(yǎng)
將上述步驟A )斜面培養(yǎng)得到的菌抹取一接種環(huán)菌莒接入發(fā)酵種 子培養(yǎng)基中，在初始pH6. 0—pH7. 0、溫度28。C一30。C下、裝液量1: 5 — 1: 4、搖床轉(zhuǎn)速180—300轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每4一24小 時取樣測定酶活，直至酶活下降。
在搖瓶培養(yǎng)時使用的發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成如下以重量計豆粉 4%—9%、豆油2%—6%、葡萄糖1%—3%、 (NH4)2SO40.1%—0.4%、 KH2P04 0.1%—0.4%、 MgSO4.7H2O0.05%—2% ， pH6.0—pH6.5。
C、 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
向1-2個茄子瓶斜面培養(yǎng)得到的菌種中分別加入30—100ml無菌 水，刮下菌苔，接種于IOOL發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，溫度28。C一30。C、初 始pH6.1—pH6.5、罐壓0.5—1.0大氣壓與通空氣1: 1 — 1: 2 ( v/m )的發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)90—140小時；發(fā)酵過程中通過改變以下條件 提高發(fā)酵酶活將轉(zhuǎn)速由180轉(zhuǎn)/分逐漸提高到300轉(zhuǎn)/分；調(diào)節(jié)通氣 量由1: 1 (v/m)逐漸增大到1: 2 ( v/m );根據(jù)發(fā)酵情況補(bǔ)入以重量 計1%—5°/。的豆油。發(fā)酵到97.5小時，其酶活達(dá)到最高，產(chǎn)酶水平達(dá) 到15500U/ml，其檢測結(jié)果參見附圖1。
在發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)時使用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下以重量計豆粉 4%—15%、豆油4%—12%、 (NH4) 2SO40.10/0—0.4%、 KH2PO40.1% _0.4%、 MgS04.7H20 0.05%—2%, CaC03 1%—5%，消泡劑(甘油 聚醚)1%—5%, pH6.0—pH6.5。
所述酶活測定方法是前面描述的橄欖油滴定法。
所述的發(fā)酵罐是本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的發(fā)酵罐，例如鎮(zhèn)江格瑞 生物工程有限公司銷售的發(fā)酵罐。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法是根據(jù)產(chǎn) 酶情況，逐步將轉(zhuǎn)速由180rpm提升至240rpm提高產(chǎn)酶水平。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法是根據(jù)產(chǎn) 酶情況，通過分批流加石友源即分批補(bǔ)加以重量計1%—5%豆油的方式 來提高產(chǎn)酶水平。
本發(fā)明還涉及高產(chǎn)脂肪酶解脂亞羅酵母菌株LW1發(fā)酵液制備脂 肪酶酶粉。所述的高產(chǎn)脂肪酶解脂亞羅酵母菌抹LW1發(fā)酵液制備脂肪 酶酶粉的方法，其特征在于該方法的步驟如下
將上述方法2得到的高產(chǎn)脂肪酶解脂亞羅酵母菌株LW1發(fā)酵液 在3000轉(zhuǎn)/min下離心10min,取其上清液。向上清液中加入其體積 3-4倍的95%、-18°C乙醇，加完全部乙醇后，在水箱冷凍室于溫度-18。C 一-20。C下冷卻0.5—1小時，然后在2000轉(zhuǎn)/分下離心2—10分鐘， 傾出上清液，得到的沉淀物用95%冷乙醇洗滌，其乙醇用量是所述上 清液體積的1/4—1/2，再離心，重復(fù)洗滌操作2-3次，直到傾出的上 清液成為淺黃色，然后用溫度-18。C的丙酮洗滌，其丙酮用量是乙醇體積的1/2—l倍，再離心，重復(fù)洗滌操作2-3次，直至丙酮上清液基
本無色，真空脫除丙酮，得到脂肪酶酶粉，測得脂肪酶酶粉水解酶活
在20000u/g—30000u/g。
所述的離心機(jī)是本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的離心機(jī)，例如上海安亭 科學(xué)儀器廠制造的飛鴿牌離心機(jī)。
本發(fā)明涉及解脂亞羅酵母菌抹LW1發(fā)酵液在催化脂肪S吏反應(yīng)中 的用途。
本發(fā)明還涉及所述的解脂亞羅酵母菌林LW1發(fā)酵液在催化脂肪 酸反應(yīng)中的用途，其特征在于將脂肪酸與曱醇按等摩爾比加入，其中 曱醇每隔5h—10h加入一次，分3—6次加入，酯化體系中脂肪酶用量 為每克脂肪酸1000-2000U，在溫度28-45。C與180-200轉(zhuǎn)/分的空氣浴搖 床中進(jìn)行反應(yīng)15-40小時，得到的產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜進(jìn)行檢測確認(rèn)是脂 肪酸曱酯，酯化率70-95%。
檢測脂肪酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的氣相色語法是在下述條件下進(jìn)行的
島津GC2010氣相色譜儀，色譜柱，DB-lHT30 x 0.25 x 0.1;氬火 焰檢測器；分流比30: 1，柱流量1.50ml/min,氮?dú)獯祾吡髁?0.0ml/min, 進(jìn)樣口溫度380。C,保留時間25min,柱箱溫度365。C，采用程序升溫 20°C/min, 4min; 15°C/min, 3min; 20°C/min， 7min， j呆留時間30min。 檢測器溫度是385。C。
本發(fā)明還可以使用其它的氣相色譜儀進(jìn)行檢測，但其檢測條件可 以根據(jù)該儀器的情況作適當(dāng)調(diào)整。
本發(fā)明還涉及由所述高產(chǎn)脂肪酶解脂亞羅酵母菌抹LW1發(fā)酵液 制備脂肪酶酶粉在催化脂肪酸反應(yīng)中的用途。以所述方法得到的脂肪 酶酶粉在催化脂肪酸曱酯化反應(yīng)中的用途，其特征在于將脂肪酸與曱 醇按等摩爾比加入，其中曱醇每隔2h—10h力口入一次，分3—6次加入， 酯化體系中用酶量為每克脂肪酸1000-3000U， 28-45°C, 180-200轉(zhuǎn)/ 分的空氣浴搖床中進(jìn)行反應(yīng)6-30小時，得到的產(chǎn)物經(jīng)氣相色鐠進(jìn)行檢測確認(rèn)是脂肪酸曱酯，酯化率70°/。一95%。
所述曱醇流加時間根據(jù)反應(yīng)中使用的發(fā)酵液或酶粉酶活情況具 體調(diào)節(jié)。
所述空氣浴搖床是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的設(shè)備，如江蘇太倉市實驗室
設(shè)備廠生產(chǎn)的THZ-C恒溫振蕩器。
所述的脂肪酸選自C12—C18飽和或不飽和脂肪酸。 優(yōu)選地，所述的脂肪酸選自C16—C18不飽和脂肪酸。 更優(yōu)選地，所述的脂肪酸選自油酸或棕櫚油。
采用本發(fā)明方法得到的脂肪酸曱酯可以廣泛地用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)作為生
物柴油使用。
[有益效果
本發(fā)明提供了脂肪酶高產(chǎn)解脂亞羅酵母菌抹LW1及其培養(yǎng)方 法，并將采用該方法獲得的脂肪酶應(yīng)用于催化化學(xué)反應(yīng)。釆用本發(fā)明 所述的方法，100L發(fā)酵罐培養(yǎng)97.5小時，以橄欖油為底物，產(chǎn)酶水 平為15500U/ml。 ^使用該方法獲得的脂肪酶發(fā)酵液以1500U/g脂肪酸 用量，催化油酸甲醇酯化反應(yīng)30小時轉(zhuǎn)化率在75%以上，使用該菌 抹制得的脂肪酶酶粉以2500U/g脂肪酸用量，催化油酸曱醇酯化反應(yīng) 30小時轉(zhuǎn)化率在90%以上。本發(fā)明為該酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖1解脂亞羅酵母LW1發(fā)酵罐培養(yǎng)酶活及pH監(jiān)測圖。 圖2解脂亞羅酵母突變林脂肪酶發(fā)酵液催化油酸曱醇酯化反應(yīng) 氣相檢測圖
黑色線條為脂肪酸曱酯色譜圖，粉色線條為對照的脂肪酸色譜圖 圖3.解脂亞羅酵母突變抹的脂肪酶酶粉催化脂肪酸曱酯化 A.對照的脂肪酸色譜圖，B.酯化后的脂肪酸曱酯色譜圖具體實施方式
實施例1將從農(nóng)大食堂周圍環(huán)境中分離的野生型解脂亞羅酵母依次經(jīng)
PDA固體培養(yǎng)基在28。C下活化1次，PDA液體培養(yǎng)基在28。C下活化 2次，然后按照以重量計5%接種量接入PDA液體培養(yǎng)基，在28。C下 培養(yǎng)12h，然后取lml菌液加到已滅菌的10ml的以重量計0.86%NaCl 水溶液中，得到出發(fā)菌抹的菌懸液。
將上述所得到的出發(fā)菌抹菌懸液的活菌數(shù)調(diào)節(jié)到1.85 x 106個/ml ， 將所述懸液置于玻璃片上，其懸液層厚度為0.2cm,讓其在距紫外燈 25cm的20瓦紫外燈下照射90秒進(jìn)行紫外線誘變；紫外線誘變結(jié)束 后立即將菌液涂布于PDA固體培養(yǎng)基平板上，在溫度28。C下培養(yǎng)90 小時。
從誘變培養(yǎng)的PDA固體培養(yǎng)基平板上挑選單菌落接種于初篩分 離培養(yǎng)基上，即在PDA固體培養(yǎng)基中添加三丁酸甘油酯至終濃度2% (以重量計)、琥珀酸鈉至終濃度25mg/ml與制霉菌素至終濃度 20U/ml。 28°C,培養(yǎng)48小時。
從上述初篩分離培養(yǎng)平板上挑選17個水解透明圈大的菌抹，以 單菌落接入搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基中(以重量計豆粉6%、豆油4%、葡萄糖 1%、 ( NH4 )2S04 0.2%、 KH2P04 0.1%、 MgS04-7H20 0.05 % , pH 6.5。) 28 °C, 200rpm進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。
復(fù)篩時每隔4小時取一次樣，檢測脂肪酶酶活。17個初篩得到 的菌株，分別培養(yǎng)至125小時，得一抹產(chǎn)脂肪酶最高的突變抹，命名 為LW1,其最終酶活2850u/ml。所述酶活是釆用本申請說明書中描 述的橄欖油滴定法測定的。
實施例2
將解脂亞羅酵母突變抹LW1在茄子瓶內(nèi)培養(yǎng)24小時后，向其中 加入50ml滅菌蒸餾水，洗下菌苔，直接接種于IOOL發(fā)酵罐中，在溫 度28。C、初始pH6.5、罐壓0.7個大氣壓與通空氣1: 1 (v/m)的發(fā) 酵條件下培養(yǎng)。發(fā)酵到63小時，將發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速由180轉(zhuǎn)/分提高到240 轉(zhuǎn)/分，此時罐壓增加到l.O個大氣壓，通氣量由1: 1 (v/m)提高到1: 2(v/m),培養(yǎng)100小時，釆用本申請說明書中描述的橄欖油滴定 法測定的酶活達(dá)到8250u/ml。 實施例3
將解脂亞羅酵母突變株LW1在茄子瓶內(nèi)培養(yǎng)24小時后，向其中 加入50ml滅菌蒸餾水，洗下菌苔，直接接種于100L發(fā)酵罐中，28 。C、初始pH6.5、罐壓0.6大氣壓與通空氣1: 1 (v/m)的發(fā)酵培養(yǎng)， 發(fā)酵到55小時時酶活增長速度緩慢，補(bǔ)入以重量計2%的豆油，轉(zhuǎn)速 由180轉(zhuǎn)/分提高到240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)到75小時時，又補(bǔ)入以重量計 2%的豆油，此時罐壓升高到l.O個大氣壓，培養(yǎng)到97.5小時，采用 本申請說明書中描述的橄欖油滴定法測定的酶活達(dá)到15500u/ml。
實施例4
將實施例3得到的解脂亞羅酵母突變株LW1發(fā)酵液稀釋為酶活 4000u/ml的酶液。催化油酸曱醇酯化反應(yīng)(反應(yīng)體系酶用量4000U, 2.82g油酸，405iLil曱醇，其中曱醇每間隔10h加入上述體積的三分 之一即135|al, 30°C, 190rpm) 30小時。反應(yīng)產(chǎn)物采用下述條件進(jìn) 行氣相色譜檢測
島津GC2010氣相色譜儀，色譜柱，DB-1HT 30x 0.25 x 0.1;氫 火焰^r測器；分流比30: 1，柱流量1.50ml/min,氮?dú)獯祾吡髁?10.0ml/min,進(jìn)樣口溫度3 80。C,保留時間25min,柱箱溫度365 。C, 采用程序升溫20。C/min， 4min; 15°C/min, 3min; 20°C/min, 7min, 保留時間30min。檢測器溫度是385°C。檢測得到油酸曱酯含量 75.17%。
實施例5
將實施例1誘變得到的解脂亞羅酵母突變抹LW1在發(fā)酵罐上發(fā) 酵，得到的發(fā)酵液酶活12000u/ml，在3000轉(zhuǎn)/min下離心10min,取 其上清液；往該上清液中加入其體積3倍的95% -18°C乙醇，加完全 部乙醇后，在冰箱冷凍室于溫度-20。C下冷卻0.5小時，然后在2000 轉(zhuǎn)/分下離心4分鐘，傾出上清液，得到的沉淀物用95%冷乙醇洗滌，其乙醇用量是所述上清液體積的1/4,再離心，重復(fù)洗滌操作2次，
直到傾出的上清液成為淺黃色，然后用溫度-18。C的丙酮洗滌，其丙 酮用量是乙醇體積的1/2,再離心，重復(fù)洗滌操作2次，直至丙酮上 清液基本無色，真空脫除丙酮，得到脂肪酶酶粉。采用本申請說明書 中描述的橄欖油滴定法測得酶粉水解酶活為24000u/g。
取上述酶粉0.2g催化油酸曱醇反應(yīng)體系(反應(yīng)體系酶用量 5000U， 2.82g油酸，405 nl曱醇，其中曱醇每間隔10h加入上述體積 的三分之一即135iul， 30°C, 190rpm)， 30h后，將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)氣相色 譜檢測。
檢測方法如實施例4所述，檢測得到油酸曱酯含量是89.18%。 實施例6
將實施例1誘變得到的解脂亞羅酵母突變林LW1以實施例3所 述方法在發(fā)酵罐上發(fā)酵，得到的發(fā)酵液酶活15500u/ml。再以實施利 5中所述的酶粉制備方法得到脂肪酶酶粉。測得酶粉水解酶活為 30000u/g。
取上述酶粉催化棕櫚油曱醇反應(yīng)體系，棕櫚油與甲醇按等摩爾比 加入，其中甲醇每隔6h加入一次，分4次加入，酶用量為每克脂肪酸 3000U, 30°C, 180轉(zhuǎn)/分的空氣浴搖床中進(jìn)行反應(yīng)24小時，得到的產(chǎn) 物經(jīng)實施例4描述的氣相色譜檢測，脂肪酸甲酯含量是90.16%。
權(quán)利要求
1、一種高產(chǎn)脂肪酶的解脂亞羅酵母突變株(Yarrowialipolytica)LW1，其保藏編號為CGMCC No.2707。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)脂肪酶解脂亞羅酵母菌株LW1的 培養(yǎng)方法，其特征在于該方法的步驟如下A. PDA固體斜面培養(yǎng)基配制如下200g馬鈴薯經(jīng)洗凈去皮切 碎后，加水1000ml煮沸半個小時，用紗布過濾，其濾液再加20g葡 萄糖，混勻后用去離子水補(bǔ)充液體體積至1000ml，在溫度115。C下滅 菌15分鐘，得到PDA液體培養(yǎng)基，往該P(yáng)DA液體培養(yǎng)基中加入15g 瓊脂，待瓊脂溶解、凝固后得到PDA固體培養(yǎng)基；B. 發(fā)酵種子培養(yǎng)基配制如下將以重量計豆粉4%—9%、豆油 2% —6%、葡萄糖1%—3%、 (NH4)2SO40.1%—0.4%、 KH2P04 0.1% 一0.4%、 MgS04'7H20 0.05%—2 %配制成pH6.0—pH 6.5的發(fā)酵種子培養(yǎng)基；C. 發(fā)酵培養(yǎng)基配制如下將以重量計豆4分4%—15%、豆油4% —12%、 (NH4)2SO40.1%_0.4%、 KH2P04 0.1%—0.4%、 MgS04-7H20 0.05%—2% ， CaC03l% —5°/。，消泡劑(甘油聚醚)1% —5%配制成 pH6.0—pH6.5的發(fā)酵培養(yǎng)基；D. 培養(yǎng)條件與方法(i) 斜面培養(yǎng)將所述解脂亞羅酵母菌林菌林LW1取一接種環(huán)菌莒接種于PDA 固體斜面，在初始pH6. 0—pH7. 0與溫度28°C—30。C下恒溫培養(yǎng)12 一72小時；(ii) 搖瓶培養(yǎng)將上述步驟A )斜面培養(yǎng)得到的菌株取一接種環(huán)菌苔接入發(fā)酵種 子培養(yǎng)基中，在初始pH6. 0—pH7. 0、溫度28。C—30。C下、裝液量1:5_1: 4、搖床轉(zhuǎn)速180—300轉(zhuǎn)/分條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每4一24小時 取樣測定酶活，直至酶活下降； (iii)發(fā)酵罐培養(yǎng)向l-2個茄子瓶斜面培養(yǎng)得到的菌種中分別加入30—100ml無菌 水，刮下菌苔，接種于IOOL發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，溫度28。C一30。C、初 始pH6.1—pH6.5、罐壓0.5—1.0大氣壓與通空氣1: 1 — 1: 2 ( v/m ) 的發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)卯一140小時，得到所述菌株LW1發(fā)酵液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在發(fā)酵過程中將轉(zhuǎn) 速由180轉(zhuǎn)/分逐漸提高到300轉(zhuǎn)/分，或調(diào)節(jié)通氣量由1: 1 (v/m) 逐漸增大到1: 2 (v/m),或在發(fā)酵過程中補(bǔ)入以重量計1%—5%的 豆油提高發(fā)酵酶活。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述解脂亞羅 酵母菌抹LW1發(fā)酵液酶活是15500U/ml以上。
5、 使用權(quán)利要求2所述方法得到的解脂亞羅酵母菌株LW1發(fā)酵液 制備脂肪酶酶粉的方法，其特征在于該方法步驟如下將根據(jù)權(quán)利要求2所述方法得到的高產(chǎn)脂肪酶解脂亞羅酵母菌 抹LW1發(fā)酵液在3000轉(zhuǎn)/min下離心10min,取其上清液。向上清液 中加入其體積3-4倍的95%、 -18。C乙醇，加完全部乙醇后，在冰箱 冷凍室于溫度-18。C一-20。C下冷卻0.5—1小時，然后在2000轉(zhuǎn)/分下 離心2—10分鐘，傾出上清液，得到的沉淀物用950/o冷乙醇洗滌，其 乙醇用量是所述上清液體積的1/4—1/2，再離心，重復(fù)洗滌操作2-3 次，直到傾出的上清液成為淺黃色，然后用溫度-18。C的丙酮洗滌， 其丙酮用量是乙醇體積的1/2—1倍，再離心，重復(fù)洗滌操作2-3次， 直至丙酮上清液基本無色，真空脫除丙酮，得到脂肪酶酶粉。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述方法得到的脂肪酶酶粉，其特征在于該 脂肪酶酶粉的水解酶活是20000u/g—30000u/g。
7、 使用權(quán)利要求2所述方法得到的解脂亞羅酵母菌林LW1發(fā)酵液在催化脂肪酸曱酯化反應(yīng)中的用途，其特征在于將脂肪酸與曱醇按等摩爾比加入，其中曱醇每隔5h—10h加入一次，分3—6次加入，酯化 體系中脂肪酶用量為每克脂肪酸1000-2000U, 28-45°C， 180-200轉(zhuǎn)/ 分的空氣浴搖床中進(jìn)行反應(yīng)15-40小時，得到的產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜進(jìn)行 檢測確認(rèn)是脂肪酸曱酯，其酯化率70-95%。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述方法得到的脂肪酶酶粉在催化脂肪酸反應(yīng) 中的用途，其特征在于將脂肪酸與曱醇按等摩爾比加入，其中甲醇每 隔2h—10h加入一次，分3—6次加入，酯化體系中脂肪酶用量為每克 脂肪酸1000-3000U， 28-45°C, 180-200轉(zhuǎn)/分的空氣浴搖床中進(jìn)行反應(yīng) 6-30小時，得到的產(chǎn)物經(jīng)氣相色語進(jìn)行檢測確認(rèn)是脂肪酸甲酯，其酯 化率70%—95%。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用途，其特征在于所述的脂肪酸選 自C12—C18飽和或不飽和脂肪酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一株經(jīng)過紫外誘變方法得到的解脂亞羅酵母脂肪酶高產(chǎn)菌株LW1(CGMCC No.2707)，并提供該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法、脂肪酶提純、催化脂肪酸甲酯化的方法。解脂亞羅酵母CGMCC No.2707在100L發(fā)酵罐上經(jīng)過補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)97.5h，產(chǎn)酶水平為15500U/ml，所制得的脂肪酶酶粉活力為30000U/g。獲得的脂肪酶酶粉或發(fā)酵液可直接應(yīng)用于催化脂肪酸甲酯化反應(yīng)。在脂肪酸與甲醇等摩爾比加入，體系中用酶量為每克脂肪酸1000-3000U時，30h轉(zhuǎn)化率在90％以上。
文檔編號C12N1/16GK101440350SQ20081017211
公開日2009年5月27日 申請日期2008年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者關(guān)國華, 孟永宏, 徐志文, 穎 李, 李月娟, 王貴利 申請人:秦皇島領(lǐng)先科技發(fā)展有限公司