專利名稱：一種融合穿透肽的神經細胞營養(yǎng)因子gdnf的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及融合穿透肽的人源神經營養(yǎng)因子GDNF(GDNF，下同)的表達質粒構建 及其表達純化，其所在的技術領域與生命科學和生物醫(yī)藥技術有關。
背景技術：
人腦神經膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(GDNF，下同)是由腦組織中的神經膠質細 胞產生、分泌的一種有著重要神經生物功能的神經細胞營養(yǎng)因子。GDNF對中樞和外周的 多種神經細胞具有有較廣泛的促進神經元生長和分化的神經營養(yǎng)作用，是目前發(fā)現的對多 巴胺神經元和運動神經元作用最為顯著的一類神經營養(yǎng)因子，尤其對多巴胺神經元作用最 強(Lin LT et al. Science 1993.260(5111) :1130-2 ;Henderson et al. Science 1994， 266(5183) :1062-4)。 國內外對GDNFF的功能進行了廣泛的研究，證明GDNF通過PI3K/Akt通路介導，明 顯緩和6-羥基多巴胺(6-0HDA)誘發(fā)的染色質濃縮和DNA斷裂；啟動一系列抗凋亡信號途 徑而保護神經元，被認為是一種有希望的神經保護治療藥物。 由于血腦屏障的存在，GDNF本身無法經外周血液進入腦組織發(fā)揮冶療功效。近 年國外在動物或人體通過病毒載體的基因治療或導管直接給藥，對GDNF治療中樞神經系 疾病的作用進行研究(Do Thi NA， Sail lour P， Ferrero L， DedieuJF， Mallet J， Pa皿io T.Gene Ther. 2004 Jan 15 ;Patel NK et al， AnnNeurol. 2005 Feb ;57(2) :298-302)表明 GDNF對多種神經系統(tǒng)疾病，包括帕金森氏病、肌萎縮側索硬化癥和缺血性腦損傷有較好臨 床治療效應，是當今國際上治療帕金森氏病的熱門研究領域之一。國內尚末有在活體開展 研究的報道。 不過，這些途徑既增加痛苦和治療成本，也無助于GDNF在臨床上的廣泛應用。因 此，克服大腦的血腦屏障，使GDNF能經外周血液循環(huán)系統(tǒng)穿越血腦屏障進入腦組織，發(fā)揮 其生物活性，達到治療相關神經系統(tǒng)疾病的目的是關健之所在。 近年來，在科學家發(fā)現愛茲病毒HIV的TAT蛋白具有穿透細胞膜和血腦屏障的 功能，并證明融合這種病毒多肽的、具有潛在治療作用的基因產物蛋白質也同樣能夠穿 越血-腦屏障，發(fā)揮其生物功能之后(Ruzza P， et al. ， J P印t Sci. 2004 Jul ;10(7): 423-6.)，己證實有數種多肽也具有類似HIV-TAT的功能，這些多肽有人時鐘基因(clock gene)的N-末序列中的某些氨基酸多肽(Peng T， etal. ， Acta. Biochim. Biophys. Sin (Shanghai). 2004 S??；36(9) :629-36)和由多個賴氨酸(KKKKKKKKK)構成的氨基酸多 肽(Park，J，et al. ，Mol. Cells 2002，April 30 ;13(2) :202-8)等，這類多肽統(tǒng)稱為細胞穿 透月太(penetrating p印tideof cells, PPCs)。。 由于HIV-TAT介導的蛋白質轉導受到預變性以獲得高轉導率和依賴細胞內分子 伴侶HSP90拆疊、才能發(fā)揮其生物學效應的影響以及更重要的是對HIV-TAT的安全性問題 的擔擾，故對這項技術的應用有所限制。 近來，國內外許多研究證明Morris根據天然細胞膜穿透肽特性設計的21個氨
3基酸多肽PEP-1，具有能直接攜帶有生物活性的蛋白質進入細胞和穿越血腦屏障進入腦組 織，并發(fā)揮生物學效應的功能，又同時具有轉導效率高、對血清不敏感、在生理緩沖液中有 高度的穩(wěn)定性和無毒性等優(yōu)點，因而被認為更適合于蛋白質治療的載體工具(Morris MC.， et al， J. Nat. Biotech. 2001. 19(12) :1173-6 ;董曉等，南方醫(yī)科大學學報2006， 26 (8): 1114 :Choi HS,Free Radic Biol Med. 2006 Oct 1 ;41 (7) :1058-68 :Choi SH,et a,Mol Cells. 2005 Dec 31 ;20(3) :401-8 :Choi HS, et al. ， Free Radic Biol Med. 2006 0ctl ; 41(7) :1058-68. Epub 2006 Jun 15)。 因此，基于以上的研究，構建穿透肽/神經營養(yǎng)因子GDNF融合基因，研制能經血管 輸入、穿越血腦屏障進入腦神經組織發(fā)揮其生物功能的GDNF融合蛋白，成為一種對某些神 經系統(tǒng)疾病具有較好治療作用的生物治療藥物將是可能的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種融合穿透肽的神經細胞營養(yǎng)因子GDNF表達結構及 其表達蛋白質純化的方法。 本發(fā)明的目的之二是提供上述融合穿透肽重組人GDNF蛋白質的應用。
本發(fā)明的目的之一是通過以下技術措施來實現的 1、從人腦組織提取信息核糖核酸(mRNA)，并利用反轉錄酶將mRNA合成互補脫氧 核糖核酸(cDNA)，然后，應用PCR技術，克隆GDNF基因，并將穿透肽PEP-1的編碼脫氧核苷 酸融合到人源神經細胞營養(yǎng)因子GDNF基因的氨基酸末端(N-末端)；
2、將上述GDNF融合基因插入原核蛋白載體，構建成GDNF融合基因表達質粒；
3、將上述GDNF融合基因表達質粒轉化感受態(tài)表達菌，形成含有GDNF融合基因表 達質粒的轉化子； 4、在適當條件下培養(yǎng)轉化子表達菌，并用誘導劑誘導表達菌內的表達質粒GDNF 融合基因的轉錄、并合成該基因編碼的蛋白質產物； 5、通過蛋白質純化技術、Western Blot分析和細胞研究確定GDNF融合蛋白的生 物功能活性。 本發(fā)明所述人GDNF融合基因中的穿透肽是穿透肽TAT、 PEP-1、人時鐘基因N_末 序列中的某些氨基酸多肽和由多個賴氨酸(KKKKKKKKK)構成的氨基酸多肽中的一種。
本發(fā)明所述的表達載體是原核細胞表達載體，也可以是真核表達載體和病毒表達 載體。 本發(fā)明的目的之二是提供所述的人GDNF融合基因表達蛋白質作為制備治療如本 說明書中所描述的某些神經系統(tǒng)疾病治療藥物中的應用，其有效活性成分為人GDNF蛋白 質。 本發(fā)明提供的重組人GDNF融合基因表達結構具有以下特征 1).人源GDNF為成熟型人源GDNF，即其N_末端比野生型人源GDNF缺少從第一到
第五十八位的58個氨基酸，其C末端序列維持不變，； 2).成熟型人GDNF的N-末端融合有由23個氨基酸多肽組成的PEP-1穿透肽 (KET麗ET麗TEWSQPKKKRKV); 3).重組人GDNF融合基因由157個氨基酸組成，包含23個氨基酸組成的穿膜多肽和134個氨基酸構成的成熟型GDNF。 4).重組人GDNF融合基因以N_末端的Ncol和C_末端的Hindi 11連接于原核細 胞表達載體pET-45b (+)，位于T7啟動子的下游，建成重組人GDNF融合基因的表達質粒，并 且轉化的感受態(tài)表達菌是適于原核細胞表達載體pET-45b (+)的表達菌。
因此，所述的表達質粒pET-45b (+) _PEP_1/GDNF具有表達人GDNF融合蛋白的作 用，純化的GDNF融合蛋白具有穿透肽和GDNF 二者功能。


附圖1 :人源神經細胞營養(yǎng)因子GDNF基因cDNA片段(RT-PCR)產物第一泳道為
脫氧核苷酸(DNA，下同)分子量標準；第二和第三泳道為該基因的反向轉錄酶-聚合酶鏈
反應(RT-PCR)產物。箭頭所指為該基因cDNA片段在瓊脂糖電泳上的位置。 附圖2 :PEP-1與人源GDNF基因的融合采用PCR方法，以GDNF基因為模板，應用
編碼PEP-1多肽和GDNF的5'-未端氨基酸的核苷酸引物進行PCR反應，完成PEP-1與人源
神經營養(yǎng)因子GDNF的融合。第一道為DNA分子量標準、第二和第三道為PCR產物(箭頭所指)。 附圖3 :pET-45b (+) -PEP-1/GDNF表達質粒構建應用DNA連接酶將Notl BamHl的PEP-1/GDNF融合基因片段插入用內切酶Notl和BamHl消化的原核細胞表達載體 pET-45b (+)，經轉化感受態(tài)細菌、培養(yǎng)擴增和酶切篩選后確證為pET-45b (+)-PEP-1/GDNF 表達質粒。 附圖4 :pET-45b(+)-PEP-1/GDNF的表達此圖為誘導的表達產物在SDS-PAGE膠 經卡馬氏亮蘭染色后的結果，從左向右起，第一泳道為標準蛋白質分子量標記物；第二泳道 為未誘導的細菌產物；第三、第四泳道分別為不同誘導時間的產物。箭頭所示為表達產物。
附圖5 :pET-45b(+)-PEP-l/GDNF表達產物的Western Blot分析第一泳道為標準 蛋白質分子量標記物；第二泳道為末誘導細菌產物；第三、第四和第五泳道分別為不同誘 導時間的產物。顯示表達產物為符合預期的GDNF基因產物。 附圖6 :PEP-1/GDNF表達產物進入Hela真核細胞的Western Blot分析第一道 為標準蛋白質分子量標記物；第二泳道為對照組；第三和第四道，第六和第七道分別為2小 時和4小時為PEP-1/GDNF表達產物共孵化Hela細胞結果、第五泳道為PEP-1/GDNF表達產 物。 附圖7 :PEP-1/GDNF表達融合蛋白質的分離純化采用非變性聚炳酰胺凝膠分離 蛋白質。第一道為標準蛋白質分子量標記物；第二泳道為對照組為上樣液；第三、第四和第 五道為萄聚糖G50分子篩的收集液；第六、第七和第八道為陽離子交換樹脂拄分離純化的 蛋白液。 附圖8 :純化PEP-1/GDNF融合蛋白的Western Blotting檢測分析第一道為標準 蛋白質分子量標記物；第二泳道為對照組為上樣液；第三至第五道為萄聚糖G50分子篩收 集液；第六至第八道為陽離子交換拄分離純化收集液。 附圖9 :純化的PEP-1/GDNF蛋白對神經細胞生長的影響第一道為不含PEP-1/ GDNF融合蛋白的細胞培養(yǎng)液對SH-SY5Y神經細胞生長的狀況；第二和第三道為含等量 PEP-1/GDNF融合蛋白的細胞培養(yǎng)液在不同培養(yǎng)時問對SH-SY5Y神經細胞生長的影響觀察。
具體實施例方式實施例一 人GDNF基因克隆、基因融合及其表達質粒構建
1).人GDNF基因克隆及其融合基因融合 以備制的人腦組織信息核糖核苷酸(mRNA)為模板，用Poly (T)引物在反向轉錄酶 作用下，合成人腦組織的互補脫氧核糖核苷酸(cDNA);然后以人腦組織cDNA作為模板，用 含有編碼穿透肽PEP-1核苷酸和人GDNF基因N-末端序列核苷酸的P-l-1和P-l-2正向引 物以及人源GDNF基因C-末端核苷酸序列的反向引物進行二次PCR擴增，克隆人源GDNF基 因，并完成其N未端的改建。
a :PEP-1引物設計如下
P-l-1 : 5 ， -tcgagctcaggaggaaacgccatggagaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccg-3 ，
P-l-2 : 5' -cctggtgg3ccg33tggtctc3gccg333333333cgte朋gtgtc3cc3g3te33C333tgg-3'
b.人源GDNF基因反向引物設計如下
5， _tcaagcttcagatacatccacaccttt_3， 第二次PCR擴增產物經tailing反應，加上腺嘌呤(T)后，連接至T-easy載體，轉
化細菌后，擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。 2).含人GDNF融合基因原核細胞表達質粒的構建 用適當的內切酶，即Notl和BamHl分別消化上述含克隆的人PEP_1_GDNF融合基 因片段的T-easy載體和原核細胞表達載體pET_45b (+) DNA，用瓊脂糖電泳分離，并進行純 化；純化后的人PEP-1/GDNF融合基因片段和原核細胞表達載體pET_45b (+)DNA在連接酶 作用下進行拼接；轉化細菌后，擴增、抽提、純化，經內切酶消化DNA確定成功構建的含人 pET-45b (+) -PEP-1/GDNF融合基因原核表達質粒。 實施例二 表達質粒pET-45b (+) _PEP_1/GDNF在原核菌內的表達 1).感受態(tài)表達菌轉化取1 2微克pET-45b (+) -PEP-1/GDNF原核表達質粒DNA
加入在冰上解凍的感受態(tài)表達菌BL21 (DE3)PlysS，進行混合，置于冰上孵化30分鐘后；然
后，在42t:水浴42秒鐘，置于冰上1分鐘；再加上900微升LB細菌培養(yǎng)液，于37。C搖床震
蕩培養(yǎng)1小時；取適量培養(yǎng)液涂布于含適當抗生素的培養(yǎng)板上，于37t:培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜，
直至有菌株生長。 2).人GDNF融合基因在原核細胞BL21 (DE3) PlysS內的表達從培養(yǎng)板板上挑選 單個菌株，于含有適當抗生素的5毫升LB培養(yǎng)液中生長過夜；于第二日上午取500微升 細菌培養(yǎng)液至50毫升的LB培養(yǎng)液中、于37t:搖床震蕩培養(yǎng)約4小時；當0. D/550值達到 0. 5時，加入適量誘導劑IPTG，誘導人PEP-1/GDNF融合基因的表達；3_4小時后，離心菌體， 菌體經超聲破碎后收集上清液，應用12% SDS-PAGE(聚丙酰胺膠)分離蛋白質；分離后， 一塊膠進行染色，觀察目的蛋白表達情況、另一塊膠將蛋白經電轉移至醋酸纖維膜上，進行 Western blot免疫反應，確定是預期的產物。
實施例三人PEP-1/GDNF表達產物穿透細胞膜功能研究 1). PEP-1/GDNF融合基因表達產物的制備表達菌經誘導表達后，離心表達菌，棄上清液，在菌體中加入不含血清真核細胞培養(yǎng)液，充分懸浮；經超聲破碎包涵體、復性后，取可溶性表達產物上清液，經0.2i;的濾膜過濾，并濾液中加入10%的血清和適量抗生素，備用； 2). PEP-1/GDNF融合蛋白穿膜功能研究 a.穿膜試驗真核細胞Hela培養(yǎng)過夜，第二天用PBS緩沖液洗滌Hela細胞三次后，加入上述PEP-1/GDNF融合蛋白濾液，分別共培養(yǎng)2小時和4小時；然后，去除上述濾液，用足量PBS緩沖液洗Hela細胞三遍； b.PEP-l/GDNF融合蛋白穿膜效果檢驗離心收集上述Hela細胞，經超聲破碎、離心，收集細胞上清溶，進行電泳分離、轉移；然后，進行Western blot分析，結果顯示PEP-1/GDNF融合基因表達產物具有穿膜功能。
實施例四PEP-1/GDNF表達融合蛋白的分離、純化及其檢測 1). PEP-1/GDNF表達融合蛋白的分離、純化表達PEP-1/GDNF融合基因的工程菌37t:經誘導表達4小時后，分離包涵體；包涵體經充分洗滌和8M尿素溶解、復性，離心后，取其上清液備用。應用柱上復性方法，先后使用萄聚糖G50分子篩和陽離子交換樹脂拄分離、純化表達的蛋白； 2).純化的PEP-1/GDNF融合蛋白的檢測隨后應用15%非變性聚丙酰胺膠電泳PEP-1-GDNF表達蛋白，并電轉移至膜上，按常規(guī)實驗條件，用鼠GDNF抗體進行Westernblotting檢測，結果顯示純化的為人GDNF融合蛋白。 實施例五PEP-1/GDNF融合蛋白質對SH-SY5Y神經細胞生長的影響每組取約50萬個傳代細胞培養(yǎng)，待貼壁生長12小時后，在新鮮培養(yǎng)液中加入等量PEP-1/GDNF蛋白，分別培養(yǎng)12和24小時，收集細胞計數，并與在新鮮培養(yǎng)液中未加PEP-1/GDNF蛋白的對照組細胞計數比較，分析PEP-1/GDNF蛋白對神經細胞生長的影響，結果表明PEP-1/GDNF蛋白有促進SH-SY5Y神經細胞生長的作用。序列表Individual ApplicantStreet :廣州國際企業(yè)孵化器A區(qū)610房City :廣州市State :廣東省Country :中國PostalCode :510633PhoneN咖ber :020-32290208FaxN咖ber :020-32290208EmailAddress :shangwu_w@yahoo. com〈110>LastName :王〈110>FirstName :尚武〈110〉Middlelnitial :〈110〉Suffix :Application Project
7
------------------- 〈120〉Title :—種融合穿透肽的神經細胞營養(yǎng)因子GDNF 〈130>AppFileReference : 〈140>CurrentAppNumber :1 〈141〉CurrentFilingDate :2008-11-13 Sequence -------- 〈210>1 〈211>504 〈212>DNA 〈213〉GDNF人工序列 〈400〉 1
txgagctcag gaggaaacgc catggagaaa gaaacctggt gggaaacctg gtggaccgaa 60 tggtctcagc cgaaaaaaaa acgtaaagtg tcacc,ta aacaaatggc agtgcttcct 120 agaagagagc ggaatcggca ggctgcagct gccaacccag agaa'ttccag aggaaaa欲t 180
cggagaagcc agaggggcaa aaaccggggt tgtgtcttaa ctgcaataca tttaaatgtc 240
actgacttgg gtctgggcta tgaaaccaag gaggaactga tttttaggta ctgcagcggc 300
tcttgcgatg cagctgagac aacgtacgac aaaatattga aaaacttatc cagaaataga 360
aggctggtga gcgacaaagt agggcaggea tgttgcagac ccatcgcctt tgatgatga.c 420
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〈210>2 〈211>157 〈212>PRT 〈213>GDNF人工序列 〈400>2MetGluLysGluThrTrpTrpGluThrTrpT卬ThrGluTrpSerGlnProLysLysLys 5 10 15 20
25
30
35
40
45 50 55 60
AsnArgGlyCysValLeuThrAlalleHi sLeuAsnValThrAspLeuGlyLeuGlyTyr
65 70 75 80
GluThrLysGluGluLeuIlePheArgTyrCysSerGlySerCysAspAlaAlaGluThr
85 90 95 100
105
110
115
125 130 135
LeuValTyrHisIleLeuArgLysHisSerAlaLysArgCysGlyCysIle 145 150 155
120 140
權利要求
一種融合穿透肽的神經細胞營養(yǎng)因子GDNF，其主要特征為a). GDNFN為成熟型GDNF，其N-末端缺失從第一到第五十八位的58個氨基酸，其C末端序列不變；b). 成熟型GDNF的N-末端融合穿透多肽；c). 所述GDNF親本來源于人；
2. 根椐權利要求1的一種GDNF融合基因，含有下列氨基酸序列a) .人GDNF的成熟親本多肽的氨基酸序列；b) .融合GDNF由157個氨基酸組成，包括23個氨基酸組成的穿透多肽和134個氨基酸 構成的成熟型GDNF ;
3. 根椐權利要求1，所述GDNF的N-末端融合穿透肽，穿透肽由21個氨基酸，即由 KET麗ET麗TEWSQPKKKRKV氨基酸組成的PEP-1穿透肽。
4. 根椐權利要求1，所述穿透肽不限于上述穿透肽，也可以是人時鐘基因 (clockgene)、穿透肽(VKRVSRNKSEKKRRG)、艾滋病毒HIV-1的TAT穿透肽或多個賴氨酸 (KKKKKKKKK)構成的穿透肽中的一種。
5. 根椐權利要求1，人GDNF基因N-未端的構建方法，即以人GDNF基因為模板，應用 合成的、編碼穿透肽PEP-1核苷酸和人GDNF基因N-末端序列核苷酸的正向引物P-l-1和 P-l-2以及人GDNF基因C-末端核苷酸序列的反向引物，進行二步法的PCR擴增，完成其N 未端的改建，即GDNF與PEP-1穿透肽的融合；a. PEP-1引物設計如下 P-l-1 :5' -tcgagctcaggaggaaacgccatggagaaagaaacctggtgggaaacctggtggaccg-3' P-l-2 :5' -cctggtgg3ccg33tggtctc3gccg333333333cgte朋gtgtc3cc3g3te33C333tgg-3'b. 人GDNF基因反向引物物設計如下 5' _tcaagcttcagatacatccacaccttt_3，PCR擴增產物經tai 1 ing反應，加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉化細菌后，擴增、 抽提、純化，經DNA測序確定。
6. 根椐權利要求1，含上述表達結構的原核表達質粒pET45b-PEP-l-GDNF轉化感受態(tài) 表達菌BL21 (DE3)plysS形成的工程菌，但不限于本發(fā)明所述的表達載體pET45b和感受態(tài) 表達菌種，也包括所有pET表達系列載體和其他原核表達載體系列以及BL21 (DE3)系列的 感受態(tài)表達菌和其他原核細胞感受態(tài)表達菌。
7. 根椐權利1、權利2和權利3，穿透肽GDNF融合基因的表達序列結構在原核細胞和/ 或真核細胞的蛋白表達產物。
8. 根椐權利1、權利2和權利3，穿透肽GDNF融合基因表達結構在腺病毒 (Adenoviruse)、腺相關病毒(AAVs)或其它病毒載體系統(tǒng)的應用。
9. 椐權利1、所述穿透肽GDNF融合基因表達蛋白產物在臨床上治療相關疾病，如缺血 性腦損傷，肌萎縮側索硬化和帕金森氏病等相關神經系統(tǒng)疾病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了構建一種融合穿透肽的神經細胞營養(yǎng)因子GDNF表達結構方法、以及表達蛋白產物的純化及其意義，其主要特征為1).GDNF親本為人源成熟型；2).GDNF的N-末端融合有21氨基酸組成的PEP-1穿透肽；和3)構建的穿透肽GDNF融合基因表達質粒的表達產物具有穿膜功能及GDNF的生物功能，可在臨床上治療相關疾病中得以應用。
文檔編號C12N15/62GK101775072SQ20081017676
公開日2010年7月14日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權日2008年11月17日
發(fā)明者朱雅南, 王尚武 申請人:王尚武;朱雅南