專利名稱：Hmg-1基因核酸原位雜交檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)和疾病診斷領(lǐng)域，更具體地涉及癌癥的基 因檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
根據(jù)國(guó)內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的資料，我國(guó)每年癌癥的新增人數(shù)170萬(wàn)，死 亡人數(shù)近160萬(wàn)，患者600萬(wàn)，全球每年新增癌癥患者800萬(wàn)，死亡人數(shù)接 近800萬(wàn)，患者約有8400萬(wàn)人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可 怕的數(shù)字。
2005年美國(guó)衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等多家單位做了一個(gè) 年度報(bào)告，"認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗"，也就是說(shuō)癌癥死亡率沒(méi)有降低， 其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個(gè)因素是l.腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性；2.腫瘤細(xì)胞 耐藥性；3.抗癌藥物設(shè)計(jì)思路不完善等。同時(shí)，該報(bào)告中亦提出應(yīng)重新審視 現(xiàn)有診治癌癥的措施。前段時(shí)間財(cái)經(jīng)雜志的文章報(bào)道大標(biāo)題中國(guó)在抗癌戰(zhàn) 斗中大潰敗。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的另二個(gè)重要原 因是1.不能做到真正的早期診斷;2.轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制不清楚。依照 傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)影像及和其它生化(如蛋白標(biāo)記物)指標(biāo)來(lái)診斷癌癥， 認(rèn)為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷(更小些有時(shí)無(wú) 癥狀體征)，這一概念值得認(rèn)真討論。影像醫(yī)學(xué)的2公分以下癌塊 屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模瑥募?xì)胞學(xué)角度，l公分的腫 塊約有一億個(gè)腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn) 不止2億個(gè)腫瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2 公分的癌塊，其病理演變過(guò)程相當(dāng)長(zhǎng)，可能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實(shí)的是在這個(gè)過(guò)程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和 單獨(dú)的病灶。臨床上已證實(shí) 一旦形成腫塊的同時(shí)，其他癌細(xì)胞通 過(guò)不同途徑遷移到其他部位克隆生長(zhǎng)； 一旦切除原發(fā)灶后，其他器 官?gòu)?fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成或轉(zhuǎn)移。因此，在臨床上以2公分 以下的腫塊大小來(lái)界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)，這時(shí)已經(jīng)是晚期了， 這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正原因。美國(guó)的健康機(jī)構(gòu)都認(rèn)為早期 診斷是降低死亡率和降到醫(yī)療成本的關(guān)鍵。
癌癥的發(fā)生演變過(guò)程和癌基因得能、抑癌基因的失能以及癌癥 轉(zhuǎn)移基因的得能和癌癥轉(zhuǎn)移抑制基因的失能有關(guān)，也是多基因疾 病。隨著分子生物學(xué)技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，疾病基因組學(xué) 和癌癥基因組學(xué)研究的深入開展，至今，有可能在基因水平上做到 更科學(xué)的早期診斷，特別是在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆時(shí))、 突破血管壁早期轉(zhuǎn)移時(shí)，就能做到早期預(yù)測(cè)診斷。
HMG-1基因是一種致癌基因，它的過(guò)度表達(dá)引起白血病和人 類其它癌癥的發(fā)生。John Hopkins兒童中心研究人員利用遺傳工 程小鼠技術(shù)發(fā)現(xiàn)了 HMG-1的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致兒童和成人白血病及 其它癌癥的發(fā)生。他們使用七只在淋巴組織和白細(xì)胞上過(guò)度表達(dá) HMG-1基因的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)每只小鼠都很快發(fā)展 為人類白血病和淋巴瘤的病例。七只轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶1至28個(gè) HMG-1基因復(fù)制，所有小鼠都在1至8個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)淋巴瘤并死亡。 一只小鼠被成功的繁殖建立了遺傳工程鼠系，子系小鼠也都發(fā)生了 惡性淋巴瘤，多數(shù)情況下淋巴瘤發(fā)生在動(dòng)物的胸腺，脾臟，骨髓， 淋巴結(jié)和外周血與白血病類疾病發(fā)展過(guò)程一致。這些小鼠百分之百 的早期發(fā)生惡性病變的事實(shí)提供的直接證據(jù)，證明過(guò)度表達(dá) HMG-1基因與癌癥之間關(guān)系。同時(shí)在人類白血病的骨髓標(biāo)本中該 基因表達(dá)亦過(guò)度，而HMG-1基因過(guò)度表達(dá)是如何干擾正常細(xì)胞生 長(zhǎng)，導(dǎo)致人類癌癥和白血病發(fā)生，研究人員推測(cè)該基因的蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程有關(guān)。過(guò)度表達(dá)的HMG-1可能與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)移動(dòng) 有關(guān)，有文章報(bào)道嚴(yán)重?zé)齻湍摱狙Y(炎癥)，機(jī)體細(xì)胞的修復(fù) 生長(zhǎng)及炎癥時(shí)細(xì)胞因子遷移時(shí)均有HMG-1表達(dá)過(guò)度的現(xiàn)象。因此， 當(dāng)發(fā)生癌癥和白血病時(shí)，癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞在體內(nèi)遷移和轉(zhuǎn)移， HMG-1基因會(huì)表達(dá)過(guò)度。同樣，腫瘤的病理學(xué)程度不同，HMG-1 基因的表達(dá)量也各不相同，惡性程度高的HMG-1基因的表達(dá)水平 高:輕度是18.2%;中度是60%;重度的是83.3%。以上的信息提示， HMG-1基因的表達(dá)水平與腫瘤的病理演變的程度有關(guān)。
已往對(duì)HMG-1基因的研究都采用高通量基因芯片技術(shù)，而這 些方法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，特別是個(gè)性化的應(yīng)用在 我國(guó)現(xiàn)階段沒(méi)有報(bào)道。
中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1556221公開了"IC53基因及其相關(guān)產(chǎn)物診斷和治療 結(jié)腸癌的用途及一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒"。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1769485公開 了"梓孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測(cè)方法及其試劑盒"。中國(guó)專利 文獻(xiàn)CN1556410公開了"一種魚類病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法"。中國(guó) 專利文獻(xiàn)CN1680597公開了"一種用于定量檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV)的熒光 定量PCR試劑盒"。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN2918435，公開了"一種檢測(cè)肥胖相關(guān) 基因SNP的寡核苷酸芯片及試劑盒"。但是，關(guān)于HMG-1基因的原位雜交 檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)技術(shù)未見報(bào)道。
本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)在單細(xì)胞水平上觀察HMG-1基 因的表達(dá)量和表達(dá)程度，及對(duì)臨床各類癌癥和白血病患者的血液標(biāo) 本進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該基因與癌癥和白血病患者的病理演變和轉(zhuǎn) 移有密切相關(guān)，從HMG-1基因表達(dá)量的變化，早期從基因水平來(lái) 檢測(cè)癌基因的表達(dá)情況，對(duì)臨床癌癥和白血病的病理演變和轉(zhuǎn)移的 診斷有非常重要的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供一種HMG-1基因核酸原位雜交檢測(cè)試劑盒，
其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針?lè)謩e具有序列表
SEQ ID NO: l所示序列，其分別為HMG-1基因的DNA或RNA
序列。其中，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物，所 述的放射性核素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種，所述的非放射 性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素中的 一種，所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑(堿性磷酸酶抗 體，購(gòu)買自羅氏公司)。
本發(fā)明的白血病和癌癥早期HMG-1基因診斷試劑盒應(yīng)用價(jià)值 在于，能在基因水平及早對(duì)白血病和癌癥的發(fā)生做檢測(cè)， 一旦病理 演變到癌前變時(shí)，就采取治療，降低癌癥的死亡率和發(fā)病率。
本發(fā)明還提供一種HMG-1基因原位雜交的檢測(cè)方法，包括以 下步驟
(1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體 的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體； 和
(2) 檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜
交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42"C;核酸雜交的時(shí)間為16—24 小時(shí)。
本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的 血液白細(xì)胞標(biāo)本或其他器官組織細(xì)胞標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血 液標(biāo)本或腫瘤組織細(xì)胞標(biāo)本。
本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，對(duì)象是白血病和癌癥病人。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相
結(jié)合，以HMG-1基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，合成探針是HMG-1基因的DNA 或RNA序列，檢測(cè)的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或腫瘤組織細(xì)胞 的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供HMG-1基因 的半定量或定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上 基因的表達(dá)量，正常人HMG-1基因不表達(dá)，即不顯色，HMG-1基 因在白血病和癌癥病人高表達(dá)，即深顯色，該基因在很多癌癥都有 高表達(dá)，有特異和廣譜性，臨床意義非常重大。
本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑， 增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均 熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、 鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告。 1.儀器操作
1 ).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；
4) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C);
5) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
6) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C);
7) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；
8) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色；
10) .取出封片鏡檢。
本核酸原位雜交的流程圖是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知的雜交探針的 制作、標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、結(jié)果檢測(cè)分析的全過(guò)程。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例肝癌病人的HMG-1基因表達(dá)圖。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例白血病癥病人HMG-1基因表達(dá)圖片。
圖3是本發(fā)明實(shí)施例中正常人HMG-1基因表達(dá)圖片。
具體實(shí)施例方式
下面將根據(jù)流程圖過(guò)程，展開實(shí)施的步驟，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。 應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例用于說(shuō)明而非限定本發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變 或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例1
按照常規(guī)方法制備本實(shí)施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以 HMG-1基因?yàn)闄z測(cè)目的基因設(shè)計(jì)的雜交探針、標(biāo)記物，其中
本實(shí)施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。
試劑盒組成:
消化液100pL/管l管/盒無(wú)色透明液體
保護(hù)液100pL/管l管/盒無(wú)色透明液體
預(yù)雜交液1300pL/管2管/盒無(wú)色透明液體
正義雜交液10pL/管l管/盒無(wú)色透明液體
反義雜交液10pL/管l管/盒無(wú)色透明液體
封閉液1000pL/管l管/盒無(wú)色透明液體
堿性磷酸酶抗體l管/盒無(wú)色透明液體
顯色劑A175pL/管l管/盒黃色液體
顯色劑B320pL/管1管/盒無(wú)色透明液體
緩沖液I 10x90mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液II 10x80mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液ni iox20mL/瓶3瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體
緩沖液IV 10x90mL/瓶l瓶/盒淺黃色或無(wú)色透明液體固定液 90mL/瓶 l瓶/盒 無(wú)色透明液體
陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本 6片/盒
上述試劑成分說(shuō)明(所有試劑購(gòu)自SIGMA)
1. 消化液:20mg/mL蛋白酶K, 100mg蛋白酶K，加DEPC-H20 5mL;
2. 保護(hù)液0.2g的glycine加入ImL的lx緩沖液I;
3. 預(yù)雜交液lx緩沖液II7.5mL 50xD 3mL
10mg/ml yest t-RNA 750uL
11 mg/ml SALMON TESTES DNA 682uL
0.04M EDTA 3mL
50% formamide 15mL
4. 封閉液0.03g的bloking (購(gòu)買自羅氏公司)加入ImL lx緩沖
液III;
5. lOx緩沖液I: (PH7.1-7.4) NaCl 80g
Na2HP04.12H20 360g KC1 2g KH2P04 2g
加三蒸水至IL,并高壓滅菌；
6. lOx緩沖液II: (PH7.0) NaCl 175.3g
檸檬酸鈉88.2g HC1幾滴
加三蒸水至1L,并高壓滅菌；
7. 緩沖液III: (PH7.9) Tris 121.1g
NaCl 87.66gHC160mL左右
加三蒸水至1L，并高壓滅菌；
8. 緩沖液IV:
lMTris-HCl(PH9.5): Tirs 121.1g加HC1 3ml左右，加水900mL，調(diào)PH 至9.5，加水至1L，并高壓滅菌；
1MNaCl: NaCl 58.44加水至1L，并高壓滅菌； 0.5MMgCl2: 101.65gMgCl2.6H20加水至1L，并高壓滅菌；
9. 固定液多聚甲醛40g加lx緩沖液I至1 L,稍加熱(約50-60度)攪 拌至溶解；
10. 顯色劑A: NBT lg加70。/。DMF11.44mL;
11. 1顯色劑B: BCIP lg加100%DMF30mL。
實(shí)施例2
標(biāo)本處理:
1) .用10ml的離心管，裝4.5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3 ml抗凝血緩慢 加入含有淋巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液^:1.5)的離心管中,2000r/min 離心10 min
2) .吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的lx緩沖 液I,混勻，1500g/min離心10 min
3) .棄上清.沉淀加入約兩倍的lx緩沖液I，混勻，15Q0g/min離心10min
4) .棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液， 滴在玻片上推片,自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機(jī)制片。)3 ml血， 可以做4張片子。
5) .用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用lx緩沖液I洗5min。 每缸可以放16片。
6) 標(biāo)本可保存在-2(TC ，或繼續(xù)做實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3
將試劑盒中試劑配制成使用濃度
1) .將10x緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液I ;
2) .將20x緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2x緩沖液I1;
按1:100稀釋成0.2x緩沖液II;按1:200稀釋成0.1 x緩沖液II;
3) .將iox緩沖液ni用三蒸水按i'.io稀釋成ix緩沖液in;
4) .10x緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成x緩沖液IV (取1#， 2#， 3#各 lOmL,加水至100mL既可)。
實(shí)施例4
實(shí)驗(yàn)步驟
1) .取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本兩 張(每次實(shí)驗(yàn)做一對(duì)陽(yáng)性對(duì)照)。
2) .在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加lx緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。 37。C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37。C處理12 min,再用 lx緩沖液I洗5min.
3) .用0.2%的保護(hù)液(保護(hù)液lml力B lx緩沖液I99ml即為使用濃度)洗 10min,三蒸水洗5min,以上過(guò)程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥。
4) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片:蓋上蓋玻片,蓋緊保濕盒，放 在42。C恒溫水浴箱中3h以上。
5) .取出玻片,棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內(nèi),用70%,90%，95%的乙醇 各洗2min，自然干燥
6) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張， 一張加正義雜交液20ul/片， 另一張加反義雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42'C恒溫水浴 箱中16-24h。
7) .取出玻片，棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內(nèi)
在42'C恒溫水浴箱中用2x緩沖液II洗兩次,每次15min在42"C恒溫水浴箱中用0.2x緩沖液II洗一次,每次15min 在42"C恒溫水浴箱中用O.lx緩沖液n洗兩次，每次15min
8) .用lx緩沖液m洗30s,取出玻片,自然干燥
9) .將玻片放入保濕盒內(nèi),加0.5%1封閉液(lml封閉液加5ml1 x緩沖液III) 100ul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。
10) .取出玻片，用lx緩沖液m洗30s，自然干燥
11) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8mllx緩沖液 m)100ul/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min
12) .取出玻片，用lx緩沖液III洗3次，每次15min
13) .lx緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73.3ul,顯色劑B157.5ul加到 30mllx緩沖液IV中，混勻),室溫避光12h以上
14) .用三蒸水洗5min,自然干燥，(用甘油加10%的lx緩沖液I混勻)封片
鏡檢
實(shí)施例5
結(jié)果判斷
在光鏡下計(jì)數(shù)100-300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染上紫色細(xì)胞的百分比。 陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。 所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對(duì)照應(yīng)無(wú)色。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是以HMG-1基因?yàn)槟康幕蚝铣傻?核酸探針用地高辛標(biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、 RNA和寡核苷酸探針，不 但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過(guò)程 中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待 測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的 存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。從而獲得癌癥的 診斷信息。 一個(gè)試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實(shí)施例6
白血病人IO名，淋巴瘤癌病人5名，正常對(duì)照組10名。抽所 有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細(xì)胞)做原位雜交。結(jié)果表示， 所有癌癥患者HMG-1基因有過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞染色；正常對(duì)照組 HMG-1基因不表達(dá)，細(xì)胞無(wú)染色。具體結(jié)果請(qǐng)見圖1是淋巴瘤癌 病人的HMG-1基因表達(dá)圖，圖2是白血病癥病人HMG-1基因表 達(dá)圖片，圖3是正常人HMG-1基因表達(dá)圖片。
本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測(cè)癌胚蛋白標(biāo)志物，以及 影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上(癌變前期或 癌細(xì)胞增殖)檢測(cè)HMG-1基因異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢査及其它 檢査未發(fā)現(xiàn)占位性癌塊病灶之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前， 亦未形成腫塊之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給 臨床癌癥病患一個(gè)真正的早期診斷。這樣才有可能實(shí)施癌癥的早期 診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根除癌癥惡疾。
此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)， 同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍 使用和推廣。序列表
SEQUENCE LISTING <110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司
<120> HMG-l基因核酸原位雜交檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法與應(yīng)用 <130〉 /
<150> 200710171733.1 <151> 2007-11-30
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<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211> 648
<212> DM
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgggcaaag. g.agatcctaa gasigccgaga cggaaaatgt catcatatgc attttttgtg 60
caaacttgtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag 120
ttttctaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagagaa aggaaaattt 180
gaagatatgg caaaagcgga caaggcccgt tatgaaagag aaatgaaaac ctatatccct 240
cccaaagggg agacaaaaaa gaagttcaag gatcccaatg cacccaagag gcctccttcg 300
gccttcttcc tcttctgctc tgagtatcgc ccaaaaatca aaggagaaca tcctggcctg 360
tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac 420
aagcagcctt atgaaaagaa ggctgaaaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct 480
gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa 540
agcaaga纖agaaggaaga ggaggaaggt gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600
gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648
權(quán)利要求
1. 一種HMG-1基因核酸原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQ ID NO1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的雜交探 針序列如SEQIDNO: 1所示的RNA序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的標(biāo) 記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的放射性 核素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素中的一 種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的非放射 性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8. —種HMG-1基因的原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法 包括以下步驟a、 將權(quán)利要求1或2所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA 接觸，形成雜交復(fù)合體；b、 檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于a步驟中形成 雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16 —24小時(shí)，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或其他器官組織細(xì)胞 標(biāo)本，優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或腫瘤組織細(xì)胞標(biāo)本。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在制備檢測(cè)癌癥早期疾病 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種癌癥早期的原位雜交檢測(cè)試劑盒，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中所述的雜交探針序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明還提供了一種HMG-1基因的原位雜交檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟a.將試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b.檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。本發(fā)明另外還提供了試劑盒在制備檢測(cè)癌癥早期疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)；本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101429551SQ20081017960
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司