專(zhuān)利名稱(chēng)：一種活菌種誘變非真空離子注入方法
技術(shù)領(lǐng)域：
人工射線菌種誘變，活菌種誘變非真空離子注入方法。
背景技術(shù)：
目前，輻射菌種誘變包括伽瑪射線輻照菌種誘變、電子射線輻照菌種誘變、微波輻 照菌種誘變、X射線輻照菌種誘變、紫外光照射菌種誘變、中子輻照菌種誘變、離子注入菌種 孢子誘變和太空航天菌種誘變等?？熘凶虞椪者@種射線，屬于非帶電粒子，伽瑪射線和快中 子的穿透力都非常強(qiáng)，它們很少停留在菌種內(nèi)部，只是對(duì)菌種的組織，及細(xì)胞內(nèi)的DNA造成 輻射損傷產(chǎn)生少量變異。電子射線輻照、微波輻照、X射線輻照、紫外光照射特點(diǎn)均是無(wú)靜止 質(zhì)量，其射線輻照在菌種內(nèi)無(wú)質(zhì)量停留，只是對(duì)菌種的組織造成輻射損傷和電離損傷，產(chǎn)生 遺傳性變異幾率比較低。航天菌種誘變，是利用太空的宇宙射線(多種帶電粒子及伽瑪射、 中子等)及微重力等綜合因素，菌種在適當(dāng)?shù)奶諚l件下會(huì)產(chǎn)生變異，可選育培養(yǎng)出新菌 種。但是，航天菌種誘變成本太高，是陸地輻射育種成本的上千倍；再有航天菌種誘變存在 許多不確定性，由于宇宙風(fēng)和太陽(yáng)黑子的隨機(jī)性，菌種接受宇宙射線的劑量難以控制，何種 射線或帶電粒子引起的變異，很難測(cè)定，不確定性的因素使航天菌種誘變的效果難以重復(fù)。 科學(xué)界提出新的研究方法分別應(yīng)用各種帶電粒子，以不同的能量、不同的劑量對(duì)菌種進(jìn)行 輻射注入，離子注入既有輻射損傷變異，又有質(zhì)量沉積參加DNA分子鏈的斷裂重組，這可使 菌種產(chǎn)生永久性變異，從中選出人類(lèi)感興趣的特性品種。研究自然界生命產(chǎn)生及生物進(jìn)化， 追逆到原始大氣由于雷電、火山爆發(fā)、地殼放射性元素的衰變，可產(chǎn)生各種能量的運(yùn)動(dòng)離子 或粒子，如C+離子注入水，可形成甲酸、乙酸，N+離子注入水可形成氨水，而C+離子注入氨水 可形成三種氨基酸。實(shí)驗(yàn)證明，N、 C、 H、 0、 02—、 CO、 C02、 CH4等離子、粒子注入水可形成豐富 有機(jī)分子；離子注入在生命化學(xué)起源中發(fā)揮了重要作用。 離子束作為一種新技術(shù)應(yīng)用于生物菌種改良的研究是由我國(guó)科學(xué)家在上世紀(jì) 八十年代開(kāi)創(chuàng)的。離子束具有質(zhì)量、能量雙重誘變效應(yīng)的特征不同于以往的射線輻射，離子 注入引發(fā)的生物效應(yīng)，既有能量沉積，動(dòng)量傳遞；又有元素質(zhì)量沉積。離子注入與Y射線、 X射線束、微波、紫外光明顯不同。注入離子與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子 與生物大分子發(fā)生一系列碰撞，生物大分子獲得能量時(shí)，生物基因鍵斷裂，DNA分子擊出原 位，留下斷鍵或缺陷；注入元素有一定幾率同基因斷鍵或DNA被打出的缺位相結(jié)合，伴隨各 種元素的生化反應(yīng)，產(chǎn)生基因突變和DNA及染色體變異；離子注入有機(jī)分子，只要實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 中有氮參與，都有一定的幾率形成帶有氨基的有機(jī)分子，有一定幾率形成氨基酸；注入離子 和靶細(xì)胞的電荷交換，可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和膜電位的改良；離子束打 入生物體產(chǎn)生的Braag峰，具有較強(qiáng)的電離作用，還能產(chǎn)生活性高的自由基間接損傷作用， 因此它對(duì)生物體的作用可導(dǎo)致較高的突變率；另外由于注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能 量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，通過(guò)這種電、能、質(zhì)的聯(lián)合作用，將強(qiáng)烈影響生物 細(xì)胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜； 再者突變體的遺傳性能比較穩(wěn)定，回復(fù)突變率低。
離子束生物工程，就是將人們希望的離子注入到遺傳物質(zhì)上，使原子分子移位、重 排，最終按化學(xué)反應(yīng)規(guī)律重組DNA分子結(jié)構(gòu)；或者，利用離子束加工細(xì)胞，在細(xì)胞壁形成可 修復(fù)的小孔，改變細(xì)胞內(nèi)孔底電位，促進(jìn)外源基因(組)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)在新的背景條件下 的遺傳轉(zhuǎn)化。從細(xì)胞和分子層次上建立模型研究離子與生物體相互作用不僅為離子束在遺 傳改良上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，而且在評(píng)價(jià)環(huán)境劑量輻射的危害性和模擬原始地球環(huán)境運(yùn)動(dòng)離 子在生命起源中的作用具有重要的意義。 現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)控制帶電粒子——離子進(jìn)行輻照，其能量、劑量、束流強(qiáng)度、真空度 均可以重復(fù)，菌種誘變輻照條件完全人為可控制，這是離子注入菌種誘變優(yōu)于航天育種的 方面。北京師范大學(xué)核科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的科研人員，從上世紀(jì)80年代起，始終在這個(gè)領(lǐng)域 里進(jìn)行科學(xué)研究。我們先后對(duì)青霉素菌種孢子、鏈霉素菌種孢子菌種，進(jìn)行氮離子注入或者 碳離子注入實(shí)驗(yàn)。華北制藥、魯抗制藥幾個(gè)藥廠先后投入離子注入變異菌種取得明顯增產(chǎn) 效果。二十世紀(jì)四十年代，生產(chǎn)青霉每毫升發(fā)酵液，只產(chǎn)生約20單位的青霉素，通過(guò)透變育 種和其它措施配合，目前的發(fā)酵單位已比原來(lái)提高了三四十倍，達(dá)到每毫升5萬(wàn) 10萬(wàn)單 位。菌種的離子注入實(shí)驗(yàn)很復(fù)雜，因?yàn)殡x子注入機(jī)真空室不能有水分進(jìn)入，否則難以抽真 空。鮮活生長(zhǎng)狀態(tài)的菌群含有大量水分，不能直接進(jìn)入真空室，只有將菌種培養(yǎng)出孢子干燥 后才能進(jìn)入真空室進(jìn)行離子注入，由于孢子的生命活度低，青霉菌或放線菌的孢子一般都 處于休眠狀態(tài)，處于休眠狀態(tài)的孢子離子注入后變異，不如處在萌發(fā)狀態(tài)的菌種孢子被離 子注入誘變效率高。這是活菌種誘變非真空離子注入方法設(shè)計(jì)思想產(chǎn)生的原因。

發(fā)明內(nèi)容
—種活菌誘變非真空離子注入方法，其特征在于采用高能量離子注入機(jī)，應(yīng)用高 能量離子束流，穿過(guò)鈦、不銹鋼制成的隔真空透離子窗，在離子注入機(jī)真空系統(tǒng)外得到離子 束流，用此離子束流穿透一個(gè)有機(jī)薄膜隔菌窗窗口進(jìn)入菌種培養(yǎng)箱，在菌種培養(yǎng)箱內(nèi)控制 溫度、濕度、可調(diào)氣氛促使離子注入前菌種孢子萌發(fā)；然后，將承載著正在萌發(fā)生長(zhǎng)的菌種 孢子的培養(yǎng)皿放置在靶位上進(jìn)行離子注入，正在萌發(fā)生長(zhǎng)菌種孢子受到離子的轟擊在其內(nèi) 部發(fā)生基因斷裂、DNA重組現(xiàn)象，以誘發(fā)活菌種變異，改變微生物菌種生長(zhǎng)特性；微生物科 學(xué)家可以在這些變異中，篩選出具有優(yōu)良變異特性的菌種；其中，離子注入離子能量為1 兆電子伏特-1000兆電子伏特；其中，菌種接受離子注入計(jì)量為102-1017離子/平方厘米；
其中，離子注入非金屬離子選自H、N、C、0、P、S、B、I、Si、Se元素；其中，離子注入金屬離子 選自K、Ca、Na、Mg、Sr、Mn、Zn、Fe、Cr、Cu、Ge元素。
具體實(shí)施例方式
活菌誘變非真空離子注入方法，首先要具備一臺(tái)可以引出粒子束流的離子注入 機(jī)，能量在l兆電子伏特以上。離子束流被引出真空室以后，離子遇到空氣能量損失非常 快，菌種培養(yǎng)箱的離子入射口 ，應(yīng)緊貼加速器的離子出口 ，將需要離子注入放在培養(yǎng)皿中正 在萌發(fā)的菌種，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)離子束入射口的靶位上開(kāi)始離子注入，當(dāng)注入計(jì)量達(dá)到實(shí) 驗(yàn)設(shè)定的注入計(jì)量時(shí)停止離子注入，更換被注入菌種樣品培養(yǎng)皿。菌種培養(yǎng)箱的溫度、濕度 應(yīng)依據(jù)菌種孢子萌發(fā)的條件設(shè)定。離子注入菌種孢子萌發(fā)時(shí)機(jī)的十分重要，菌種孢子在剛 剛萌動(dòng)時(shí)受外界剌激離子沖擊、電離輻射、特殊設(shè)定元素的質(zhì)量沉積，會(huì)產(chǎn)生敏感快速的基因突變、DNA斷裂重組、促使菌種生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生明顯變異。 菌落誘發(fā)的突變率和離子注入劑量直接有關(guān)，它能產(chǎn)生電離作用，直接和間接改 變DNA結(jié)構(gòu)。直接的效應(yīng)是導(dǎo)致堿基的化學(xué)鍵、脫氧核糖的化學(xué)鍵、糖_磷酸相連接的化學(xué) 鍵的斷裂；間接的效應(yīng)是電離輻射使水和有機(jī)分子產(chǎn)生自由基，自由基作用于DNA分子，特 別是對(duì)嘧啶的作用更強(qiáng)，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒 位、缺失和易位等畸變。離子輻照射劑量102_1017離子/平方厘米，或者采用能使微生物產(chǎn) 生(30% 70%)的劑量死亡率的劑量。離子注入的電離輻射是造成染色體巨大損傷的最 好誘變劑，離子注入的質(zhì)量沉積是造成基因突變又一重要因素。要確定一個(gè)合適的劑量，通 常要進(jìn)行多次試驗(yàn)。誘變效應(yīng)的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變則 較多地出現(xiàn)于偏高的劑量中，還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負(fù)變。因 此，在誘變育種工作中，目前比較傾向于采用較低的劑量。 出發(fā)菌種是指用于誘變的原始菌種。出發(fā)菌種可以是從自然界的土樣或水樣中分 離出來(lái)的野生型菌種；也可以是生產(chǎn)中正在使用的菌種；還可以從菌種保藏機(jī)構(gòu)中獲得。 選擇的原則是菌種要對(duì)誘變劑的敏感性強(qiáng)、變異幅度大、產(chǎn)量高。 分離和篩選經(jīng)過(guò)中間培養(yǎng)，分離出大量的較純的單個(gè)菌落，接著，要從幾千萬(wàn)個(gè)菌 落中篩選出幾個(gè)好的，即篩選出所謂性能良好的正突變菌株，這將要花費(fèi)大量的人力和物 力。怎樣設(shè)計(jì)才能花費(fèi)較少的工作量達(dá)到最好的效果，這是篩選工作中的一條原則。 一般 采用一些方法加以簡(jiǎn)化，如利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應(yīng)直接挑 取高產(chǎn)變異菌株等。平皿反應(yīng)是指每個(gè)變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培 養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理效應(yīng)，如變色圈、透明圈、生長(zhǎng)圈、抑菌圈等，這些效應(yīng) 的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標(biāo)志。常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色 法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。 菌種經(jīng)誘變處理后，會(huì)產(chǎn)生各種各樣的突變類(lèi)型。如何從中挑選出所需要的突變 類(lèi)型呢？ 一般要經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩兩個(gè)階段。下面以青霉素產(chǎn)生菌高產(chǎn)突變菌種的篩選為 例說(shuō)明。將經(jīng)誘變處理的菌液按一定濃度稀釋后，涂布在平板培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后，將單個(gè) 菌落挑到斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，再將斜面上的菌落逐個(gè)接種到搖瓶中，振蕩培養(yǎng)后測(cè)它 們的抗生素效價(jià)。這就是初篩。初篩中所得到的超過(guò)對(duì)照效價(jià)10%以上的菌種，再進(jìn)行復(fù) 篩。復(fù)篩的過(guò)程與初篩基本相同，不同的是一般將斜面上的單個(gè)菌落接種到三個(gè)搖瓶中，得 出平均效價(jià)。復(fù)篩可進(jìn)行1 3次。由此篩選出的高產(chǎn)穩(wěn)定菌種還要經(jīng)過(guò)小型甚至中型試 驗(yàn)，才能用到發(fā)酵生產(chǎn)中。
權(quán)利要求
一種活菌種誘變非真空離子注入方法，其特征在于采用高能量離子注入機(jī)，應(yīng)用高能量離子束流，穿過(guò)鈦、不銹鋼制成的隔真空透離子窗，在離子注入機(jī)真空系統(tǒng)外得到離子束流，用此離子束流穿透一個(gè)有機(jī)薄膜隔菌窗窗口進(jìn)入菌種培養(yǎng)箱，在菌種培養(yǎng)箱內(nèi)控制溫度、濕度、可調(diào)氣氛促使離子注入前菌種孢子萌發(fā)；然后，將承載著正在萌發(fā)生長(zhǎng)的菌種孢子的培養(yǎng)皿放置在靶位上進(jìn)行離子注入，正在萌發(fā)生長(zhǎng)菌種孢子受到離子的轟擊在其內(nèi)部發(fā)生基因斷裂、DNA重組現(xiàn)象，以誘發(fā)活菌種變異，改變微生物菌種生長(zhǎng)特性；微生物科學(xué)家可以在這些變異中，篩選出具有優(yōu)良變異特性的菌種；其中，離子注入離子能量為1兆電子伏特-1000兆電子伏特；其中，菌種接受離子注入計(jì)量為102-1017離子/平方厘米；其中，離子注入非金屬離子選自H、N、C、O、P、S、B、I、Si、Se元素；其中，離子注入金屬離子選自K、Ca、Na、Mg、Sr、Mn、Zn、Fe、Cr、Cu、Ge元素。
全文摘要
一種活菌種誘變非真空離子注入方法，改變以往離子注入菌種誘變需要采用干燥的菌種孢子，放入真空室靶盤(pán)離子注入的方法。由于菌種干燥孢子的生命活度低，處于休眠狀態(tài)，離子注入后誘變效率低?；罹N誘變非真空離子注入方法，采用高能離子注入機(jī)引出的離子束流，轟擊菌種培養(yǎng)箱內(nèi)正在萌發(fā)的菌種孢子，使正在萌發(fā)的菌種孢子中的水和有機(jī)分子產(chǎn)生自由基、基因斷裂、離子注入、注入離子參與DNA分子鏈的斷裂重組。非真空離子注入方法選定的特定離子注入?yún)⑴c菌種內(nèi)DNA分子鏈斷裂重組，此方法將培育出特殊變異的優(yōu)良菌種。
文檔編號(hào)C12N13/00GK101736001SQ20081018081
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日
發(fā)明者丁曉紀(jì), 劉志恒, 劉曉光, 劉梅, 夏季, 孫振月, 張豐收, 張根發(fā), 張濤, 房惠榮, 李曉明, 李淑榮, 溫賢芳, 王乃彥, 王廣甫, 謝立清 申請(qǐng)人:北京市輻射中心